способ очистки почвы и поверхностей твердых объектов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами

Формула изобретения

1. Способ очистки почвы и поверхностей твердых объектов от загрязнений нефтью и нефтепродуктами путем обработки загрязненного объекта микробным препаратом, состоящим из смеси культур природных углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктом, отличающийся тем, что используют препарат на основе сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и очищаемый объект дополнительно обрабатывают водой и биогенной добавкой, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, магния и калия, при этом препарат используют в виде суспензии микроорганизмов, содержащей не менее 10⁵ КОЕ на мл, или в виде препарата, иммобилизованного на твердом носителе с концентрацией клеток не менее 10⁵ КОЕ на г твердого носителя.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку объекта водой осуществляют перед его обработкой микробным препаратом.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку объекта водой осуществляют одновременно с его обработкой микробным препаратом.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку объекта водой осуществляют после его обработки микробным препаратом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экологии, прикладной, а также биотехнологии и касается способов очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов с помощью биологических препаратов.

Известен способ очистки твердого объекта (почвы) от нефти и нефтепродуктов путем ее обработки консорциумом штаммов микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species (патент RU № 2232806, МПК C12N 1/20, 2002).

Известен способ очистки твердого объекта (почвы) от нефти и нефтепродуктов путем ее обработки ассоциацией штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы (патент RU № 2312891, МПК C12N 1/20, 2006).

Наиболее близким к заявляемому является известный способ очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов путем обработки загрязненного объекта (почвы) микробным препаратом, состоящим из смеси природных углеводородокисляющих (УВ) культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов (патент RU № 2057724, МПК C02F 3/34, 1994) - прототип. В данном способе микробный препарат выделяют из природного сообщества микроорганизмов, обитающего в загрязненной нефтью или нефтепродуктами твердом объекте (почве) и селекцию культур микроорганизмов проводят традиционным методом в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния с нефтью или нефтепродуктом.

Недостатками известного способа являются его относительно невысокие скорость и эффективность очистки загрязненных твердых объектов от нефти и нефтепродуктов, а также узкая область его применения только для очистки загрязненной нефтью или нефтепродуктами почвы.

Технической задачей изобретения является повышение скорости и эффективности очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в районах с коротким тепловым периодом, а также расширение области применения способа.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов путем обработки загрязненного объекта микробным препаратом, состоящим из смеси природных углеводородокисляющих культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния с нефтью или нефтепродуктом, используют препарат на основе сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и очищаемый объект дополнительно обрабатывают водой и биогенной добавкой, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, причем препарат используют с титром не менее 10 ⁵ колоний образующих единиц на миллилитр при использовании суспензии препарата в водной среде и с титром не менее 10 ⁵ колоний образующих единиц на грамм при использовании водной суспензии препарата, иммобилизованного на твердом носителе. При этом обработку объекта водой осуществляют перед его обработкой микробным препаратом, или одновременно с его обработкой микробным препаратом, или после его обработки микробным препаратом.

В предлагаемом техническом решении селекцию культур микроорганизмов необходимо проводить в присутствии смеси водной питательной среды с нефтью или нефтепродуктом, причем более целесообразно использовать для этих целей сырую нефть. В отсутствие нефти или нефтепродукта получить микробный препарат не удается. В качестве питательной среды, используемой при селекции МС, можно использовать, традиционные для таких целей питательные среды, содержащие, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния. Питательная среда также может содержать микроэлементы.

Используемый в данном способе микробный препарат в чистом виде представляет собой пастообразную массу, которая может быть получена, например, путем выделения препарата из питательной среды методом центрифугирования, сепарирования или сушки. В чистом виде использование такого пастообразного препарата неэффективно, поэтому очищаемый твердый объект всегда дополнительно обрабатывают водой. В зависимости от природы очищаемого объекта можно использовать как морскую, так и пресную воду.

В предлагаемом техническом решении кроме дополнительной обработки очищаемого объекта водой во всех случаях также необходимо дополнительно обрабатывать очищаемый объект биогенной добавкой, которая должна содержать, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния. В качестве биогенной добавки можно использовать как легкорастворимые, так и труднорастворимые минеральные или органоминеральные соединения.

При реализации способа микробный препарат можно использовать в виде суспензии отселектированного сообщества микроорганизмов в водной питательной среде или в воде либо в виде высушенного отселектированного микробного сообщества (МС), а также в виде отселектированного МС, иммобилизованного на твердом носителе.

Микроскопическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими методами было показано, что используемый в предлагаемом способе препарат состоит из бактерий, относящихся к различным биологическим родам, например, таким как Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Mycobacterium, Acinetobacter, Phyllobacterium, Marinobacter, Alcanivorax, Oleispira, Cycloclasticus и т.д. В предлагаемом изобретении для выделения культур микроорганизмов могут быть использованы различные морские бурые водоросли, например бурые водоросли биологических родов Fucus sp., Laminarya sp., Phyllariella sp. и т.д. Эти водоросли широко распространены в морских экосистемах, например в Белом море, в Баренцевом море, в Дальневосточных морях и т.д. Можно использовать как бурые водоросли одного биологического рода, например рода Fucus sp., так и водоросли двух и более биологических родов.

Сушку биомассы препарата можно осуществлять как лиофильно, так распылением суспензии биомассы препарата в газовом потоке, например в воздухе, в азоте, в аргоне и т.д.

В качестве твердого носителя для иммобилизации отселектированного МС можно использовать различные неорганические и органические, преимущественно пористые, объекты, например, такие как природные пористые цеолиты, перлит, торф, опилки, почву и др. Иммобилизацию можно проводить путем обработки носителя суспензией отселектированного сообщества микроорганизмов в жидкой среде посредством распыления, смешения и т.д. с последующей сушкой, которую можно осуществлять как при атмосферном, так и при пониженном давлении.

Микробный препарат, используемый в предлагаемом техническом решении, получают следующим образом. Образцы бурых водорослей собирают, как правило, в зоне литорали. Фрагменты таллома (кусочки водорослей) размером примерно от 1 см² или более помещают в водную питательную среду, например, следующего состава (г/л): KNO₃ - 4,0; KH ₂PO₄ - 0,6; Na₂HPO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 20,0. В качестве источника углерода для жизнедеятельности МС используют либо нефтепродукт, либо преимущественно сырую нефть, вводимые в питательную среду в количестве нескольких массовых процентов. pH среды с нефтью 7,0.

Для получения культуры, окисляющей нефть или нефтепродукт, МС, засеянное как описано выше, инкубируют на лабораторной качалке при скорости вращения 280-300 об/мин, при температуре преимущественно не выше 15°С. Таким методом получают так называемую накопительную культуру микроорганизмов, за развитием которой наблюдают визуально и микроскопически. Через семь суток накопительную культуру помещают в холодильник, поддерживающий температуру в 10-12°С.

Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение нескольких месяцев, путем последовательных нескольких (5-6) пересевов 1 мл накопительной культуры в новую порцию питательной среды с нефтью или нефтепродуктом указанного выше состава.

Культивируемое разнообразие бактерий и определение титра микроорганизмов в накопительной культуре осуществляют путем десятикратного разведения стерильной питательной среды без нефти и высева 0,01 мл накопительной культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней.

Из отдельных колоний микроорганизмов, выросших в этих условиях, традиционными методами выделяют штаммы чистых культур микроорганизмов. Способность чистых культур микроорганизмов потреблять УВ сырой нефти проверяют в тех же условиях, что и у накопительной культуры.

Морфологические и культуральные свойства колоний микроорганизмов, их микроскопию и проверку их окрашиваемости по Граму изучают традиционными микробиологическими методами.

В предложенном техническом решении микробный препарат представляет собой смесь бактерий, включающий одиночные клетки и их группирования в недлинные цепочки или иные скопления за счет выделяемой слизи. Морфологически - это палочки разных размеров и толщины, кокки, коккобациллы, изогнутые палочки, у-образные пары клеток. Некоторые из них подвижные, другие - нет. Бактерии являются гетеротрофными аэробами, сапротрофными, грамположительными и грамотрицательными, не разжижающими агар, использующими простые субстраты, такие как углеводы, аминокислоты, органические кислоты, спирты и углеводороды.

Используемый микробный препарат не обладает токсичными и токсигенными свойствами, не обладает раздражающими действиями на слизистые оболочки, не аллергичен. Он продуцирует биологические поверхностно активные вещества, которые повышают скорость и степень очистки объектов от нефти и нефтепродуктов.

Микробный препарат можно использовать в виде суспензии отселектированного МС в водной среде с титром микроорганизмов не менее 10⁵ колоний образующих единиц (KOE)/мл. При использовании препарата, иммобилизованного на твердом носителе, титр препарата должен составлять не менее 10⁵ KOE/г носителя. Препарат экологичен и может быть использован для очистки различных твердых объектов, таких как почва, металлические и другие загрязненные поверхности от нефти и нефтепродуктов, в том числе при повышенной концентрации соли в различных географических широтах, в том числе в районах крайнего Севера и других районах с коротким тепловым периодом.

При реализации способа контроль за эффективностью и скоростью очистки объектов от нефти и нефтепродуктов можно проводить с помощью любых традиционных для таких целей методов, например, таких как хроматография, гравиметрия, респирометрия и т.д.

Применяемый в заявленном способе препарат удобен для использования. Хранят микробный препарат в виде его суспензии в водной питательной среде, либо в замороженном виде после отделения микроорганизмов от питательной среды, либо в высушенном виде, а также в иммобилизованном виде на твердом носителе после высушивания. Срок годности препарата, хранящегося в виде суспензии в питательной среде при 10°С, без пересева в новую питательную среду, составляет не менее 6 месяцев. Высушенный препарат, а также иммобилизованный препарат может храниться более года.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1.

Образцы морских бурых водорослей биологического рода Fucus sp. собирают в зоне литорали Белого моря в районе Кандалакшской губы при температуре морской воды 12°С. Кусочки таллома водоросли размером около 2 см² помещают в стерильные конические стеклянные колбы емкостью 750 мл, заполненные 100 мл водной питательной среды, содержащей растворенные нижеуказанные соли, взятые в количестве (г/л): KNO₃ - 4,0; KH₂PO₄ - 0,6; Na₂HPO₄ - 1,4; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 20,0. В колбы добавляют по 2 мл сырой Бакинской нефти, используемой в качестве источника углеводородов для жизнедеятельности МС. Колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и закрепляют на лабораторной качалке. Включают качалку, работающую со скоростью 300 об/мин, и проводят инкубацию МС при 12°С в течение 7 суток. Затем колбы помещают в холодильник с температурой 10°С. За развитием культур микроорганизмов наблюдают визуально и микроскопически.

Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение 2,5 месяцев путем последовательных 10 пересевов 1 мл полученной суспензии микроорганизмов в 100 мл новой вышеуказанной питательной среды с нефтью.

Культивируемое разнообразие бактерий МС и определение титра микроорганизмов в полученном сообществе осуществляют путем десятикратного разведения в стерильной среде без нефти и высева 0, 01 мл этой культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней. Получают микробный препарат с титром 10⁸ KOE/мл, содержащий 10 биологических родов грамотрицательных и грамположительных бактерий, следующего морфологического состава: кокки, палочки, изогнутые и коринеформные бактериальные клетки.

Способность полученного микробного препарата очищать твердые объекты от нефти проверяют следующим образом.

Микробную биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8 тыс.об/мин и полученную густую пастообразную массу, содержащую 10¹⁰ KOE/мл, хранят в замороженном виде.

Для иммобилизации препарата осуществляют ресуспендирование 1 мл препарата в 1 л вышеуказанной питательной среды без нефти с последующим введением в полученную суспензию 300 г твердого носителя, в качестве которого используют природный цеолит. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре, затем цеолит с иммобилизованным препаратом отделяют от суспензии и сушат при комнатной температуре до воздушно сухого состояния. Получают микробный препарат, иммобилизованный на твердом носителе, содержащий 10⁷ KOE/г носителя.

На поверхность трех участков засоленной почвы площадью по 1 м², расположенных в прибрежной зоне вышеназванной биостанции МГУ, равномерно наносят по 800 мл сырой Бакинской нефти, затем на загрязненные участки равномерно наносят по 40 г цеолита с иммобилизованным препаратом и биогенную добавку, содержащую 0,8 г KNO₃, 0,12 г - KH₂PO₄; 0,28 г - Na₂HPO ₄ и 0,16 г MgSO₄. После этого загрязненную почву перекапывают и рыхлят, затем каждый участок равномерно обрабатывают 10 л воды путем полива. Опыт проводят при 12°С. За 7 суток степень очистки почвы от нефти, определенная гравиметрическим методом, составляет в среднем 92%.

Пример 2.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако полученный биопрепарат на цеолите не иммобилизуют и в качестве очищаемого объекта используют 200-литровую металлическую бочку, загрязненную изнутри нефтью. В бочку заливают 200 л морской воды, затем туда добавляют 3 мл полученного биопрепарата и биогенную добавку, содержащую 80 г KNO₃, 12 г - KH₂PO ₄; 28 г - Na₂HPO₄ и 16 г MgSO ₄. Получают водную суспензию препарата с титром 1,5×10 ⁵ KOE/мл. Опыт проводят в течение 5 суток при 10°С при периодическом интенсивном перемешивании. За это время степень очистки бочки от нефти достигает 90%.

Пример 3 (контрольный, по прототипу).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако культуру микроорганизмов выделяют из почвы, взятой в районе автозаправочной станции и загрязненной нефтепродуктами. За 7 суток степень очистки почвы от нефти составляет 51%.

Пример 4.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако при получении биологически активного препарата используют смесь образцов морских бурых водорослей биологических родов Laminarya sp. и Phyllariella sp., обитающих в акватории Баренцева моря, селекцию природного сообщества микроорганизмов проводят в присутствии дизельного топлива и биопрепарат на цеолите не иммобилизуют и лиофильно сушат, а в качестве очищаемого объекта используют поверхность трех участков засоленной почвы площадью по 1 м², каждый из которых равномерно загрязнен 600 мл дизельного топлива.

В 10 литрах воды суспендируют полученный препарат, затем туда добавляют биогенную добавку, содержащую 0,8 г KNO₃, 0,12 г - KH₂PO ₄; 0,28 г - Na₂HPO₄ и 0,16 г MgSO ₄. Получают водную суспензию препарата с титром 1×10 ⁵ KOE/мл. Каждый участок загрязненной почвы перекапывают и рыхлят, затем каждый участок равномерно обрабатывают 10 л вышеназванной водной суспензии препарата. Опыт проводят при 12°С. За 7 суток эффективность очистки почвы от дизельного топлива составляет в среднем 86%.

Пример 5.

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют микробный препарат с титром 10⁵ KOE/г носителя и металлическую бочку очищают от мазута. За 9 суток эффективность очистки составляет 90%.

Пример 6 (контрольный, с меньшим, чем заявлено, титром препарата).

Опыт проводят аналогично примеру 4, однако используют водную суспензию микробного препарата с титром 10⁴ KOE/мл. За 5 суток эффективность очистки почвы от дизельного топлива составляет в среднем 51%.

Пример 7 (контрольный, с меньшим, чем заявлено, титром препарата).

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют препарат с титром 10⁴ KOE/мл. За 9 суток эффективность очистки почвы от нефти составляет 67%.

Таким образом, из примеров видно, что предложенный способ действительно позволяет повысить эффективность очистки твердых объектов от нефти и нефтепродуктов с 51 до 86-92% даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в условиях крайнего Севера России, и позволяет вести очистку объектов с более высокой скоростью. Кроме того, предложенный способ существенно расширяет область его применения, распространяя его на любые твердые объекты, загрязненные нефтью или нефтепродуктами.