способ определения ионов оксалата в моче

Формула изобретения

Способ определения ионов оксалата в моче путем жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что анализируемую пробу подщелачивают до pH 10-11, определение ионов проводят, используя колонку с сорбентом силикагель при длине волны 211 нм, в качестве элюента используют 0,1%-ный раствор серной кислоты и 80%-ный раствор ацетонитрила при градиенте концентрации последнего от 0 до 100%, при скорости подачи элюента 100 мкл/мин, объеме элюирования 1000 мкл, температуре хроматографической колонки 35°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, фармакологии и патофизиологии, и может быть использовано для определения ионов оксалата в моче больных в условиях диагностики, лечения и изучения патогенеза мочекаменной болезни.

Мочекаменная болезнь является одним из самых распространенных заболеваний почек. При этом в подавляющем большинстве случаев почечные камни представляют собой кальциевую соль щавелевой кислоты. Установлено, что одним из ключевых факторов образования этих камней является перенасыщение мочи ионами оксалата. Поэтому в процессе диагностики и лечения данного заболевания очень важно контролировать уровень почечной экскреции оксалат-ионов.

В настоящее время существуют несколько способов определения оксалат-ионов в моче, однако использование этих способов сопряжено с рядом недостатков, что делает процедуру определения длительной, а данные количественного анализа неточными.

Известен способ определения оксалат-ионов в моче путем фотоколориметрии, основанный на реакции образования окрашенного комплекса ионов оксалата с ураном и 4-(2-пиридалазо)-резорцинолом (Baadenhuijsen Н., Jansen А.Р, Clinica chirn. Ada. - 1975. - Vol.62. - P.315-324).

Недостатками известного способа являются трудоемкость, связанная с целым рядом сложных химических реакций и физико-химических определений, а также высокая стоимость, труднодоступность в повседневной практике и опасность для здоровья человека применяемых химических реактивов.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ определения оксалат-ионов в моче, основанный на сочетании методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (Keevil BG, Thornton S., Clin Chem. - 2006. - Vol.52, № 12. - P. 2296-2299).

Однако известный способ имеет ряд недостатков. Несмотря на высокую точность определения он подразумевает целый ряд последовательных манипуляций, в которых используется большое количество различных реактивов, что значительно усложняет процедуру определения. Кроме того, используемый метанол требует строгих мер оборота и хранения, закрепленных законодательством, и поэтому доступен далеко не каждой лаборатории. Наконец, в известном способе используют сочетание двух физико-химических способов определения (ВЭЖХ и масс-спектрометрия), что также усложняет задачу.

Авторы предлагают высокоэффективный способ, позволяющий быстро и высокоточно определять качественные и количественные характеристики ионов оксалата в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности определения концентрации ионов оксалата в моче и упрощение способа за счет снижения его трудоемкости и сокращения времени определения.

Технический результат достигается тем, что анализируемую пробу подщелачивают до pH 10-11, в качестве элюента используют 0,1% раствор серной кислоты и 80% раствор ацетонитрила при градиенте концентрации последнего от 0 до 100%, при скорости подачи элюента 100 мкл/мин, объеме элюирования 1000 мкл, температуре хроматографической колонки 35°С и длине волны 211 нм. В этих условиях ионы оксалата приобретают более ионизированный характер, становятся сильно гидрофильными и в процессе хроматографирования в меньшей степени задерживаются на силикагеле, который является сорбентом в используемой хроматографической колонке. Это позволяет уменьшить время удерживания ионов оксалата, и они выходят из колонки раньше, чем остальные компоненты мочи. В результате нивелируются помехи, которые свойственны аналогичному определению без подщелачивания.

Способ осуществляют поэтапно следующим образом.

1. Подготовка пробы.

Для определения используют мочу, из которой для анализа отбирают 1 мл. Затем к данному образцу прибавляют 0,5 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия для подщелачивания мочи до pH 10-11 и фильтруют через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

2. Ход определения.

Полученный образец хроматографируют, используя в качестве элюента смесь 0,1% серной кислоты и 80% ацетонитрила при градиенте последнего от 0 до 100%. Скорость подачи потока элюента составляет 100 мкл/мин, объем элюирования 1000 мкл, температура хроматографической колонки 35°С. Детекцию проводят спектрофотометрически при длине волны 211 нм.

Для проведения определения используют жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (фирмы Эконова, Россия) с УФ-детектором и хроматографической колонкой ProntoSIL 120-5C18AQ.

В качестве стандартного образца используют раствор оксалат-иона для ВЭЖХ в концентрации 1 мг/мл фирмы Fluka.

Ионы оксалата в плазме идентифицируют путем сопоставления времени удерживания пика, полученного на хроматограмме анализируемой пробы с временем удерживания стандартного образца, которое в данных условиях составляет 1 мин 49 с.

Для количественного определения ионов оксалата в моче строят калибровочный график, хроматографируя стандартный раствор оксалат-иона в условиях, описанных выше. Концентрацию ионов оксалата рассчитывают, используя общепринятую компьютерную программу «Мультихром».

Заявляемый способ не требует проведения трудоемких манипуляций и химических реакций, а также не предусматривает применения большого количества реактивов.