вирус собачьего гриппа, композиции, содержащие этот вирус, и способы их применения

Формула изобретения

1. Выделенный вирус собачьего гриппа подтипа H3N8, включающий гемаглютинин (НА), имеющий последовательность SEQ ID NO:4 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:4, при условии, что аминокислоты в положениях 94 и 233 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:4, для применения в композиции в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа.

2. Выделенный вирус собачьего гриппа по п.1, который включает нейраминидазу (NM), включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:2, при условии, что аминокислоты в положениях 68 и 134 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:2.

3. Выделенный вирус собачьего гриппа по п.1 или 2, который также включает, по меньшей мере, один из нижеследующих белков: нуклеопротеин (NP), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:6, при условии, что аминокислота в положении 402 идентична аминокислоте в данном положении последовательности SEQ ID NO:6; белок матрикса 1 (M1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, при условии, что аминокислота в положении 111 идентична аминокислоте в данном положении последовательности SEQ ID NO:8; неструктурный белок 1 (NS1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10; белок PA, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 98% идентична последовательности SEQ ID NO:12, при условии, что аминокислоты в положениях 233, 256, 327 и 561 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:12; белок РВ1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:14, при условии, что аминокислоты в положениях 200 и 213 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:14; и/или белок РВ2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:16, при условии, что аминокислоты в положениях 107, 221, 292, и 661 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:16.

4. Выделенный вирус собачьего гриппа по п.1, который является аттенюированным.

5. Выделенный вирус собачьего гриппа по п.4, включенный в композицию в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа.

6. Выделенный вирус собачьего гриппа по п.1, который является инактивированным.

7. Выделенный вирус собачьего гриппа по п.6, включенный в композицию в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа.

8. Выделенный вирус собачьего гриппа подтипа H3N8, депонированный в Американской коллекции типовых культур (АТСС) в качестве патентного депозита № РТА-7694, для применения в композиции в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа.

9. Выделенный или очищенный белок гемаглютинин (НА) вируса собачьего гриппа по п.1 для применения в композиции в количестве, достаточном для индуцированния иммунного ответа, где указанный НА (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:4, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:4 в положениях аминокислот 94 и 233; или фрагмент указанного белка по (i) или по (ii), где указанный фрагмент включает, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 94 или 233 последовательности SEQ ID NO:4.

10. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок НА или его фрагмент по п.9, необязательно являющаяся частью вектора.

11. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота по п.10, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая белок НА, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот.

12. Выделенный или очищенный белок M1 вируса собачьего гриппа по п.1 для применения в композиции в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа, где указанный M1 (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или (ii) происходит от вируса гриппа и который имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:8, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:8 в положении 111; или фрагмент указанного белка по (i) или по (ii), где указанный фрагмент включает, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 111 последовательности SEQ ID NO:8.

13. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок M1 или его фрагмент по п.12, необязательно являющаяся частью вектора.

14. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота по п.13, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая белок M1, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот.

15. Выделенный или очищенный белок NS1 вируса собачьего гриппа по п.1 для применения в композиции в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа, где указанный NS1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

16. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок NS1 по п.15, необязательно являющаяся частью вектора.

17. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота по п.16, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая белок NS1, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:9.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственные патентные заявки

В настоящей патентной заявке испрашивается преимущество предварительной заявки на патент США № 60/727808, поданной 18 октября 2005, и патентной заявки США на изобретение № 11/539123, поданной 5 октября 2006, содержание которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области вирусологии, молекулярной биологии и иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к вирусу собачьего гриппа, а также к композициям, содержащим этот вирус, и к способу его использования для индуцирования иммунного ответа у животных.

Предшествующий уровень техники

Вирус гриппа представляет собой РНК-вирус, принадлежащий семейству Orthomyxoviridae. Вирусная РНК состоит из восьми независимых сегментов, которые легко рекомбинируют с сегментами других вирусов гриппа с образованием новых подтипов.

Нуклеопротеин (NP), который является главным компонентом нуклеокапсида, кодируется пятым сегментом. NP и матриксный белок используются для классификации вируса гриппа на группы A, B или C. Поскольку NP является внутренним белком, то он не подвергается давлению отбора иммунной системой хозяина. Этот белок связывается с РНК, является частью транскриптазного комплекса и участвует в ядерно-цитоплазматическом транспорте транспорта вирусной РНК (вРНК).

Нейраминидаза (NM), которая расщепляет -кето-связь, соединяющую концевую сиаловую кислоту с последующим сахарным остатком и, тем самым, способствует высвобождению вирусного потомства из инфицированных клеток, кодируется шестым сегментом. Были идентифицированы девять подтипов (N1-N9) этого фермента. Все белки этих подтипов имеют две структурных области - стебель и головку . Все белки N8 имеют 470 аминокислот, из которых первые восемь аминокислот являются в высокой степени консервативными. Следующая область богата гидрофобными аминокислотами и считается, что она представляет собой трансмембранный домен. Следующая 51 аминокислота составляет область стебля , а область головки начинается с аминокислоты Cys91. Последняя область содержит каталитический участок фермента. Цистеиновые остатки в области головки и стебля в массе своей высококонсервативны. В этом белке также присутствует 6-8 предполагаемых сайтов N-гликозилирования.

Гемаглютинин (НA), являющийся мембранным гликопротеином, ответственным за адсорбцию вируса в клетку-хозяина, представляет собой главный антиген, против которого направлены нейтрализующие антитела. Главной причиной возникновения эпидемий гриппа является разнообразие антигенных свойств вирусов гриппа. Гемаглютинин кодируется четвертым сегментом. Было идентифицировано шестнадцать различных подтипов (H1-H16) этого белка. HA имеет сигнальный пептид, состоящий из 16 аминокислот, и два полипептида (HAl и HA2), связанные дисульфидными мостиками. HAl имеет амино-конец, а HA2 имеет карбоксильный конец. Молекула HA заякоривается на вирусной мембране гидрофобной областью в HA2. Цистеиновые остатки в массе своей являются высококонсервативными. Имеются также шесть предполагаемых сайтов гликозилирования, которые позволяют вирусу маскировать свои антигенные сайты (Skehel et al., PNAS USA 81: 1779 (1984)).

Другие белки включают матриксные белки (M или Ml и M2), неструктурные белки (NS или NSl и NS2), и белки PA, PBl и PB2. Белок Ml представляет собой главный компонент вириона, который связывается с плазматической мембраной инфицированных клеток посредством двух гидрофобных областей, присутствующих у N-конца белка, а M2 представляет собой ионный канал, то есть интегральный мембранный белок. Белок NSl присутствует в ядре и влияет на клеточный транспорт РНК, сплайсинг и трансляцию. Белок NS2 присутствует в ядре и цитоплазме, но его функция остается неизвестной. Белок PA представляет собой транскриптазу и может обладать протеазной активностью; белок PBl участвует в элогнации транскрипта; а белок PB2 связывается с кэпированными нуклеотидами в процесс транскрипции.

Вообще говоря, грипп представляет собой респираторное заболевание, поражающее человека, свиней, лошадей и домашнюю птицу, и лечение этого заболевания связано с огромными материальными затратами (Wright et al., Orthomyxoviruses. In: Fields Virology. Knipe et al., eds. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001. pp.1533-1579). Вирус гриппа известен своей продолжающейся генетической и антигенной вариабельностью, что является серьезным препятствием на пути эффективной борьбы с указанной вирусной инфекцией (Wright et al. (2001), см. выше; Webster et al., Microbiol. Rev. 56: 152-179 (1992)). Что касается предупреждения эпидемий и пандемий, то главной проблемой является появление новых подтипов этого вируса, обусловленное его генетической рекомбинацией или межвидовой передачей (Wright et al. (2001), см. выше).

Недавно были зарегистрированы вспышки гриппа у животных таких видов, как, например, кошки и собаки, то есть тех, которые ранее не являлись носителями вируса гриппа (Keawcharoen et al., Emerg. Infect. Dis. 10: 2189-2191 (2004); Crawford et al., Science 310: 398-485 (October 21, 2005; published online September 29, 2005); Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. Tn: Proceedings of the. 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Greensboro, NC, October 2005. p.158; and Yoon et al., Emerg. Infect. Dis. 11(12): 1974-1976 (December 2005)). Поэтому круг хозяев вируса гриппа постоянно расширяется.

Вспышки респираторного заболевания у охотничьих гончих собак породы грейхаунд, вызываемые вирусом гриппа, были зарегистрированы во Флориде в 2004, в восточной и западной Айове в апреле 2005 и в Техасе в 2005. Это заболевание характеризуется быстрым повышением температуры и кашлем, учащенным дыханием и носовыми кровотечениями. Заболеваемость собак, находящихся на огороженных территориях беговых дорожек в Айове, составляла почти 100%, хотя смертность от этого заболевания составляла менее чем 5%. При том что большой процент заболевших собак выздоравливал, многие из них погибали от геморрагической пневмонии. Терапевтическое введение антибиотиков широкого спектра приводило к снижению тяжести заболевания, но не могло обеспечить его полное излечение.

В соответствии с этим, целью настоящего изобретения является предоставление вируса гриппа, вызывающего инфекции у собак. Другой целью настоящего изобретения является предоставление материалов и способов индуцирования иммунного ответа против вируса гриппа у собак. Эти и другие цели и преимущества, а также дополнительные отличительные признаки настоящего изобретения будут более очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенному вирусу собачьего гриппа подтипа H3N8, содержащему белок HA, имеющий ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SEQ ID NO:4 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:4, при условии, что аминокислоты в положениях 94 и 233 идентичны аминокислотам SEQ ID NO:4. В частности, настоящее изобретение относится к выделенному вирусу собачьего гриппа подтипа H3N8, депонированному в Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA) 29 июня 2006, в качестве патентного депозита № PTA-7694. В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей аттенюированный вирус, а также к композиции, содержащей инактивированный вирус.

Настоящее изобретение также относится к выделенным или очищенным белкам. В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку HA, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:4, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:4 в положениях аминокислот 94 и 233, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положениях 94 или 233 последовательности SEQ ID NO:4.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку NM, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:2, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:4 в положениях аминокислот 68 и 134, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 68 или 134 последовательности SEQ ID NO:2.

В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку NР, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:6, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:6 в положении аминокислоты 402, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 402 последовательности SEQ ID NO:6.

В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку M1, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:8, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:8 в положении аминокислоты 111, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 111 последовательности SEQ ID NO:8.

Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному белку NSl, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку РА, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 98% (или 99%) идентичную последовательности SEQ ID NO:12, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:12 в положении аминокислот 233, 256, 327 и 561, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положениях 233, 256, 327 или 561 последовательности SEQ ID NO:12.

Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному белку РВ1, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:14, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:14 в положениях аминокислот 200 и 213, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 200 или 213 последовательности SEQ ID NO:14.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку РВ2, который (i) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 или (ii) происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, более чем на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO:16, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:16 в положениях аминокислот 107, 221, 292 или 661, или к фрагменту белка по п.п.(i) или (ii), где указанный фрагмент содержит, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положениях 107, 221, 292 или 661 последовательности SEQ ID NO:16.

В соответствии с вышеуказанным, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей вышеописанный белок, такой как HA или NM, или его фрагмент в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа у животного, и биологически приемлемый носитель.

В соответствии с вышеуказанным, настоящее изобретение также относится к способу индуцирования иммунного ответа против вируса собачьего гриппа у животного. Этот способ включает введение указанному животному композиции, содержащей белок или его фрагмент.

Настоящее изобретение также относится к выделенной или очищенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеописанный белок или его фрагмент и являющейся, но необязательно, частью вектора, а также к композиции, содержащей указанную выделенную или очищенную нуклеиновую кислоту, экспрессирующую белок, такой как НА или NМ, или его фрагмент в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа у животного, и биологически приемлемый носитель.

В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к другому способу индуцирования иммунного ответа против вируса собачьего гриппа у животного. Этот способ включает введение указанному животному композиции, содержащей нуклеиновую кислоту.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлена неполная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1; см. также GenBank регистрационный № DQ146420) кодирующей генной последовательности домена (CDS) белка NM вируса собачьего гриппа подтипа H3N8. В соответствии с общепринятым соглашением эта последовательность представлена в направлении слева направо и сверху вниз.

На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2; см. также GenBank регистрационный № DQ146420), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:1. В соответствии с общепринятым соглашением эта последовательность представлена однобуквенными кодами в направлении слева направо и сверху вниз.

На фиг.3 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3; см. также GenBank регистрационный № DQ146419) CDS-гена белка HA вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.4 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4; см. также GenBank регистрационный № DQ146419), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:3.

На фиг.5 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) CDS-гена белка NP вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.6 представлена выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:5.

На фиг.7 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7) CDS-гена белка М1 вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.8 представлена выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:8), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:7.

На фиг.9 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9) CDS-гена белка NS1 вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.10 представлена выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:10), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:9.

На фиг.11 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11) CDS-гена белка РА вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.12 представлена выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:11.

На фиг.13 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13) CDS-гена белка РВ1 вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.14 представлена выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:14), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:13.

На фиг.15 представлена полноразмерная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:15) CDS-гена белка РВ2 вируса собачьего гриппа подтипа H3N8.

На фиг.16 представлена выведенная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:16), кодируемая последовательностью SEQ ID NO:15.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении штамма вируса собачьего гриппа. Этот штамм был выделен у собак породы грейхаунд в восточной и западной Айове. Этот штамм был классифицирован как подтип H3N8 и обозначен A/canine/Iowa/13628/2005. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к вирусу, содержащему белок HA, имеющий SEQ ID NO:4 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:4, при условии, что аминокислоты в положениях 94 и 233 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:4. Такой вирус может также включать белок NМ, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:2, при условии, что указанные аминокислоты в положениях 68 и 134 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:2. Этот вирус, содержащий вышеупомянутый белок НА, отдельно или в комбинации с вышеупомянутым белком NM, может также содержать, по меньшей мере, один из нижеследующих белков, таких как белок NP, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:6, при условии, что аминокислота в положении 402 идентична аминокислоте в данном положении последовательности в SEQ ID NO:6; белок Ml, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, при условии, что аминокислота в положении 111 идентична аминокислоте в данном положении последовательности SEQ ID NO:8; белок NSl, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10; белок PA, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 98% (или 99%) идентична последовательности SEQ ID NO:12, при условии, что аминокислоты в положениях 233, 256, 327 и 561 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ BD NO:12; белок PBl, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:14, при условии, что аминокислоты в положениях 200 и 213 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:14; и/или белок PB2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 или аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:16, при условии, что аминокислоты в положениях 107, 221, 292, и 661 идентичны аминокислотам в данных положениях последовательности SEQ ID NO:16. В частности, настоящее изобретение относится к выделенному вирусу собачьего гриппа подтипа H3N8, депонированному в Американской коллекции типовых культур (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) США, 29 июня 2006, в качестве патентного депозита № PTA-7694. Вирус гриппа может быть осажден путем проведения одной или нескольких стадий снижения растворимости в водной среде, проводимых в присутствии 5 мас.% полиэтиленгликоля (ПЭГ), имеющего молекулярную массу 3000-20000, или другого линейного волокнистого незаряженного полимера в количестве, эквивалентном солюбилизирующей способности ПЭГ; отделения нерастворимой фракции от растворимой фракции, и выделения вируса из одной из этих фракций (см., например, патент США № 3989818). При этом предпочтительно, чтобы температура не превышала 35°С, pH составлял в пределах от 6 до 9, а ионная сила водной среды была ниже точки высаливания для вируса. Концентрация вируса в водной среде до придания ему нерастворимости соответствует титру гемаглютинации, составляющему, по меньшей мере, 1:32. Были получены агрегированные вирусные частицы, которые обладали лучшим антигенным действием, что, очевидно, обусловлено медленным высвобождением вирусных частиц после вакцинации. Однако, если необходимо получить неагрегированные или менее агрегированные частицы, то они могут быть подвергнуты диссоциации любым подходящим методом, таким как обработка ультразвуком.

Этот вирус может быть аттенюирован путем его пропускания через клеточную систему до тех пор, пока он не утратит свою способность индуцировать заболевание, но будет полностью сохранять свои иммуногенные свойства. Так, например, этот вирус может быть подвергнут серийному разведению в культуре клеток, выделенных у собак или у других подходящих животных, при температуре примерно 37°С. После каждого пассажа вирус собирают из одной культуры и инокулируют в среду, содержащую свежую клеточную культуру, в соответствии с методами, известными специалистам. Так, например, вирус может быть собран из жидкой тканевой клеточной культуры и/или клеток. Во время сбора клеточная культура может быть, но необязательно, подвергнута обработке ультразвуком для стимуляции высвобождения вируса. См., например, патенты США № № 5698433 и 6455298.

Если это необходимо, то штамм вируса гриппа может быть, по меньшей мере, один раз пассирован в аллантоисный мешочек оплодотворенных яиц, таких как куриные яйца, в присутствии сыворотки с получением вируса, резистентного к воздействию сыворотки (см., например, патент США № 3953592; Kilboume et al., J. Exp. Med. Il 1: 387 (1960); Kilboume, Science 160: 74-75 (April 1968); и Laver et al., Virology 30: 493-501 (1966)). Высокоэффективная вакцина против гриппа, обладающая низкой пирогенностью и низкой эндотоксичностью, может быть получена путем последовательной обработки концентрированной аллантоисной жидкости, содержащей аттенюированный вирус, бутилацетатом и этилацетатом, с последующим быстрым выпариванием (см., например, патент США № 4000257). Такой вирус может быть введен интраназально в качестве вакцины.

После инокуляции хозяину этот вирус начинает размножаться до определенного уровня, а поэтому для заражения требуется лишь небольшое количества исходного инокулята. Этот вирус должен быть безвредным, а поэтому инфицирование этим вирусом при его контакте с восприимчивым организмом должно быть минимальным.

Альтернативно, этот вирус может быть инактивирован путем блокирования его репликации и вирулентности. Это может быть достигнуто химическими или физическими методами. Химическая инактивация может быть осуществлена путем обработки этого вируса ферментом, формальдегидом, -пропиолактоном или его производным, этиленимином или его производным, органическим растворителем (например, галогенированным углеводородом) и/или детергентом (например, твином®, тритоном Х®, дезоксихолатом натрия, сульфобетаином или солями цетилтриметиламмония). Если это необходимо, то химически активированные композиции могут быть нейтрализованы. Так, например, если для дезактивации композиции используется формальдегид, то такая композиция может быть нейтрализована тиосульфатом. Затем, если это необходимо, рН может быть доведен до значения примерно 7. Альтернативно, этот вирус может быть экстрагирован смесью эфира и этанола, водные и органические фазы могут быть разделены, и остаточный эфир может быть удален из вирусной суспензии при пониженном давлении (см., например, патент США № 4431633). Физическая инактивация может быть преимущественно осуществлена путем облучения вируса излучением высокой энергии, таким как ультрафиолетовое излучение, -излучение или рентгеновское излучение. Для заражения инактивированными формами требуются относительно большие количества инокулята, а следовательно, и большие количества антигенного материала, который должен быть получен, протестирован и классифицирован.

В соответствии с вышеуказанным, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей аттенюированный или инактивированный вирус. Этот вирус должен присутствовать в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа, и желательно обеспечивать защиту от заражения. Обычно, в такую композицию, особенно, если она содержит инактивированный вирус, добавляют адъювант, такой как твин®, спан®, полный адъювант Фрейнда, сапонин, бактерия Corynebacterium parvum (Coparvax®), фосфат алюминия, гидроксид алюминия или их смесь. Для стабилизации композиции в нее могут быть добавлены гидролизаты белка и/или аминокислоты (см., например, патент США № 4537769). Альтернативно, указанная композиция может быть приготовлена в виде эмульсии масло в воде с использованием масел, таких как Marcol и/или Arlacel.

Могут быть также получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, такие как штаммы, продуцированные комбинацией сверх-аттенюированного родительского штамма (то есть штамма, для аттенюирования которого необходимо значительное большее число пассажей, чем это обычно требуется для устранения патогенности) вируса гриппа A, например A2, с вирулентным штаммом вируса гриппа, описанного в настоящей заявке (см., например, патент США № 3991179; см. также патенты США № № 4009258; 4278662; 4318903; 4338296 и 4693893). Рекомбинантный штамм, предпочтительно, обладает такой же способностью к росту, как

сверхаттенюированный штамм, и, при этом, он обладает антигенными свойствами вирулентного штамма, например имеет белки HA и NM. Отбор штаммов вируса гриппа для получения вакцины описан в патенте США № 5162112. Рекомбинантные штаммы могут быть получены в виде композиций для индуцирования иммунного ответа.

Для стабилизации композиции вируса гриппа, которая позволяла бы хранить эту композицию в холодильнике, могут быть использованы сахароза, моногидрохлорид аргининa, мононатрийгидрат глутаминовой кислоты и гидролизат желатина. См., например, публикацию заявки на патент США № 2006/0110406.

В соответствии с вышеуказанным, настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному белку HA. Белок HA имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, либо он происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:4, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:4 в положениях аминокислот 94 или 233. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка НА, содержащему, по меньшей мере, девять (например, 9, 12, 15, 18, 21 или 24) смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 94 или 233 последовательности SEQ ID NO:4.

Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному белку NМ. Белок NМ имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, либо происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:2, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:2 в положениях аминокислот 68 и 134. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка NМ, содержащему, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 68 или 134 последовательности SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному белку NР. Белок NР имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, либо происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:6, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:6 в положении аминокислоты 402. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка NР, содержащему, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 402 последовательности SEQ ID NO:6.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку М1. Белок М1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, либо происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:8, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:8 в положении аминокислоты 111. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка М1, содержащему, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 111 последовательности SEQ ID NO:8.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному белку NSl, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку РА. Белок РА имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, либо происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 98% (или 99%) идентична последовательности SEQ ID NO:12, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:12 в положениях аминокислот 233, 256, 327 и 561. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка РА, содержащему, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положениях 233, 256, 327 или 561 последовательности SEQ ID NO:12.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку РВ1. Белок РВ1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, либо происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 14, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:14 в положениях аминокислот 200 и 213. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка РВ1, содержащему, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положении 200 или 213 последовательности SEQ ID NO:14.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному или очищенному белку РВ2. Белок РВ2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, либо происходит от вируса гриппа и имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 99% идентична последовательности SEQ ID NO:16, при условии, что указанная аминокислотная последовательность идентична последовательности SEQ ID NO:16 в положениях аминокислот 107, 221, 292 и 661. Настоящее изобретение также относится к фрагменту белка РВ2, содержащему, по меньшей мере, девять смежных аминокислот, из которых, по меньшей мере, одна аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в положениях 107, 221, 292 или 661 последовательности SEQ ID NO:16.

Вышеуказанные белки и их фрагменты могут быть очищены (в комбинации с химической или физической фрагментацией для получения фрагментов) или синтезированы методами, известными специалистам. См., например, Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides 2: 46, Academic Press, NY (1973), для твердофазного синтеза белков, и Schroder et al., The Peptides, vol.1, Academic Press, NY (1965), для синтеза белков в жидкой фазе. Эти методы могут быть осуществлены в соответствии с инструкциями производителей с использованием автоматизированных систем. Указанные белки и фрагменты могут быть продуцированы и выделены в терапевтических количествах рекомбинантными методами.

Альтернативно, белки, а в частности HA и NM, могут быть выделены путем селективной солюбилизации с сохранением остаточных субвирусных частиц, состоящих из интактной липидной/белковой мембраны, включающей все другие, не играющие важной роли вирусные компоненты. Различия в размерах/плотности солюбилизированных белков и остаточных субвирусных частиц позволяют дифференцировать эти частицы по различию их физических свойств методом градиентного центрифугирования и фракционирования, седиментации, хроматографии на молекулярных ситах или осаждения на ультрацентрифуге. Селективная солюбилизация белков HA и NM может быть осуществлена путем обработки вируса катионогенным детергентом (см., например, патент США № 4140762; патент '762). Жидкость, содержащая интактный вирус и полученная от клеточной культуры, может быть обработана ДНК-гидролизующим ферментом путем добавления катионогенного детергента и выделения поверхностных белков антигена (см., например, патент США № 5948410). Эта жидкость может быть подвергнута центрифугированию в несколько стадий, либо вирус может быть фрагментирован в присутствии амфифильного неионогенного детергента с последующей фильтрацией для удаления нежелательных веществ (см., например, патент США № 6048537). Альтернативно, для получения вирусного белка может быть проведена фильтрация на мембранном фильтре и химический гидролиз (см., например, патент США № 4327182). Другие процедуры описаны в патентах США № № 4064232 и 4057626. Перед обработкой вирус предпочтительно размножить, как описано в патенте '762 (столбец 2, 11.10 и т.д.).

Для идентификации эпитопа вирусного белка, индуцирующего иммунный ответ, может быть проведено картирование, то есть эпитопное картирование . Такое картирование включает фрагментацию белка с получением перекрывающихся пептидов (таких как пептиды, содержащие 9, 12, 15, 18, 21 или 24 аминокислоты). Белок может быть фрагментирован протеолитическим ферментом. Затем отдельные пептиды тестируют на их способность связываться с антителом, вырабатываемым нативным белком, или индуцировать активацию Т-клеток или В-клеток. Альтернативно, могут быть отобраны гидрофильные области белка, поскольку гидрофильные остатки часто находятся на поверхности белка, а поэтому они доступны для антитела. Может быть также проведен рентгеновский кристаллографический анализ комплекса антиген-антитело . Потенциальные мотивы, связывающиеся с HLA-якорем и представляющие собой пептидные последовательности, которые, как известно, могут связываться с молекулами MHC, могут быть идентифицированы из аминокислотной последовательности белка. Выбранным эпитопом, предпочтительно, является эпитоп, последовательность которого имеет очень небольшое сходство или почти не имеет сходства с последовательностями, широко распространенными у животных, которым вводят композицию, содержащую или экспрессирующую фрагмент белка.

Настоящее изобретение также относится к выделенной или очищенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеописанный белок или фрагмент и являющейся, но необязательно, частью вектора. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок HA, может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять (9, 12, 15, 18, 21 или 24) смежных аминокислот. Если это необходимо, то может быть получена трехвалентная вакцина на основе белка НА, в которой один из белков HA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 (см., например, патенты США № № 5762939 и 6245532; см., например, патент США № 6740325, в котором описана трехвалентная вакцина). Нуклеиновая кислота, кодирующая белок NM, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот (см., например, патент США № 6605457 и публикацию заявки на патент США 2003/0129197); нуклеиновая кислота, кодирующая белок NP может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот; нуклеиновая кислота, кодирующая белок М1, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот; нуклеиновая кислота, кодирующая белок NS1, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:9; нуклеиновая кислота, кодирующая белок PА, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот; нуклеиновая кислота, кодирующая белок PВ1, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот; а нуклеиновая кислота, кодирующая белок PВ2, может иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:15 или ее фрагмент, кодирующий, по меньшей мере, девять смежных аминокислот. Однако для среднего специалиста в данной области очевидно, что из-за вырожденности генетического кода может присутствовать множество других нуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности.

Могут быть синтезированы вышеуказанные нуклеиновые кислоты, которые представляют собой ДНК или РНК и их фрагменты (см., например, Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed., 1984). Такие молекулы могут включать неприродные нуклеотиды/основания, кодирующие нужную аминокислотную последовательность. Так, например, эти основания или сахар могут быть метилированы. Кроме того, может быть модифицирован остов молекулы нуклеиновой кислоты, например, фосфортиоатный, метилфосфонатный, метилфосфортиоатный, фосфордитиоатный остов и их комбинации.

Альтернативно, выделенная в РНК может быть обработана обратной транскриптазой с получением гибрида РНК/ДНК, от которого может быть отщеплена РНК, а оставшаяся ДНК может быть обработана с получением дцДНК, имеющей концевую шпилечную структуру, которую обрабатывают нуклеазой, специфичной для одноцепочечной ДНК, в результате чего может быть получена бимолекулярная двухцепочечная копия вирусной РНК (вРНК) (см., например, патент США № 4357421). См., например, публикацию заявки на патент США № 2006/0166321, где описано применение тандемных транскрипционных кластеров для получения вируса гриппа в отсутствии вируса-помощника.

Нуклеиновая кислота является, но необязательно, частью ДНК-вектора, содержащего, по меньшей мере, один промотор, где каждая нуклеотидная последовательность функционально присоединена к промотору и где такие нуклеотидные последовательности могут быть одинаковыми или различными. Помимо промоторов частью ДНК-вектора могут быть и другие регуляторные последовательности, такие как стоп-сигналы и т.п.

Так, например, нуклеиновая кислота может быть введена в подходящий рекомбинантный экспрессионный вектор, такой как вектор, адаптированный для бактерий, таких как E.coli и Salmonella typhi; дрожжей, таких как Saccharomyces cervisiae или Pichia pastoris, или нитчатых грибов, таких как Aspergillus nidulans. Бактерии, дрожжи или грибы могут быть культивированы в непрерывной культуре. Затем полипептид, продуцированный в процессе культивирования, может быть выделен и очищен. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в Poxviridae (например, в векторы на основе вируса оспы домашней птицы), Herpesviridae (например, в векторы на основе вируса псевдобешенства; в векторы на основе вируса герпеса индеек, в векторы на основе вируса герпеса кошек; в векторы на основе вируса инфекционного ларинготрахеита; и в векторы на основе вируса коровьего герпеса), Adenoviridae (например, в коровий аденовирус (например, вирус серотипа 3), человеческий аденовирус (например, вирус серотипа 4 или 7) и собачий аденовирус (например, вирус серотипа 2; CAV2; см., например, патент США No. 6090393), или в экспрессионный вектор на основе вируса насекомых, такой как рекомбинантный бакуловирус (например, вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV)), который, в свою очередь, может быть использован для инфицирования восприимчивых культивированных клеток SF9, происходящих от насекомых рода Spodotera frugiperda. Другими вирусными векторами являются вирус коровьей оспы (см., например, патент США № 4722848), аденовирус, аденоподобный вирус, аденоассоциированный вирус, ретровирус и поксвирус (см., например, Hruby, Vet. Parasitol. 29: 281-282 (1988); Uiu, "AIDS Research Reviews," Dekker, Inc., 1991, 1: 403-416), которые могут быть введены путем скарификации кожи или инъекции или, необязательно, в виде липосомной композиции. Другими векторами являются бацилла Кальметта-Герена (BCG; Stover et al, Nature 351: 456-460 (1991)), векторы на основе инактивированного токсина сибирской язвы и т.п. Для экспрессии полипептида в соответствующей конструкции могут быть использованы клетки млекопитающего, такие как клетки яичника китайского хомячка (CHO), и даже клетки растений. Для среднего специалиста в данной области очевидно, что выбор клетки-хозяина зависит от природы посттрансляционного процессинга (например, гликозилирования, укладки и т.п.), который, в свою очередь, может влиять на иммуногенность полипептида и последующие процедуры очистки.

Экспрессия может быть осуществлена в любой подходящей клетке-хозяине, трансформированной/трансфецированной экспрессионным вектором. Примерами подходящих клеток-хозяев являются, но не ограничиваются ими, клетки, описанные выше. Так, например, настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной/трансфецированной экспрессионным вектором.

Супернатанты от систем хозяин/вектор, которые секретируют белок или его фрагмент в культуральную среду, могут быть нанесены на матрицу для очистки, такую как аффинная колонка или ионообменная колонка. Для дополнительной очистки рекомбинантного белка или его фрагмента могут быть проведены одна или несколько стадий обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Для стабилизации продукта белок или его фрагмент могут быть получены в виде гибридного белка. Это может быть осуществлено путем лигирования полинуклеотидных последовательностей, кодирующих два или более белка (или их фрагментов), с соответствующим экспрессионным вектором с использованием или без использования пептидного линкера. При этом желательно, чтобы рамки считывания полинуклеотидных последовательностей находились в одной и той же фазе, то есть чтобы продуцировался один гибридный белок, сохраняющий биологическую активность каждого из белков-компонентов (или их фрагментов) данного гибрида. Для разделения полученных белков (или их фрагментов) может быть использован пептидный линкер, содержащий от 1 до около 50 аминокислот и обеспечивающий правильную укладку каждого белка (или их фрагмента) в его нативную вторичную, третичную и четвертичную структуры (см., например, Maratea et al., Gene 49: 39-46 (1985); Murphy et al., PNAS USA 83: 8258-8262 (1986); патент США № 4935233; и патент США № 4751180). Критерием при выборе пептидного линкера могут служить такие факторы, как способность принимать гибкую удлиненную конформацию, неспособность образовывать вторичную структуру, которая может взаимодействовать с функциональными аминокислотами на одном или двух белках, и отсутствие гидрофобных или заряженных остатков, которые могут реагировать с одним или двумя белками. В использовании линкеров нет необходимости, если концы указанных присоединяемых белков не содержат главных областей, то есть если эти концы могут быть использованы для разделения функциональных доменов и для предупреждения стерических препятствий. Предпочтительные пептидные линкерные последовательности содержат остатки Gly, Asn и Ser. Могут быть также использованы и другие почти нейтральные остатки, такие как Thr и Ala.

Для усиления экспрессии и/или повышения иммуногенности белка или его фрагмента могут быть выбраны и другие дополнительные аминокислотные последовательности. Так, например, белок или его фрагмент может быть присоединен к тяжелой цепи иммуноглобулина G (IgG) или к белку, связывающемуся с антиген-презентирующей клеткой (AПК), или к белку, связывающемуся с дендритными клетками, такому как лиганд IL-D, GM-CSF, IL-1, TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28 или FLT-3. Могут быть применены методы, такие как метод с применением дегидратирующих агентов, например, дициклогексилкарбодиимида (DCCI), или создание связей между сульфгидрильными группами, эпсилон-аминогруппами, карбоксильными группами и т.п. Если это необходимо, то для отделения белка (или его фрагмента) от неприродной(ых) последовательности(ей) в гибридный белок может быть введен рестрикционный сайт. Примером рестрикционных сайтов является последовательность-мишень для протеолитического фермента или метионин, если он отсутствует в белке (или в его фрагменте), поскольку метионин, в свою очередь, отщепляется бромцианом. Такие методы известны специалистам. Белок или его фрагмент может быть модифицирован посредством гликозилирования или другими методами дериватизации (например, посредством ацетилирования или карбоксилирования), которые также хорошо известны специалистам.

Белок (или его фрагмент) может быть экспрессирован in situ из подходящей экспрессионной системы. Для экспрессии белка или его фрагмента, описанных выше, может быть использована любая ДНК-конструкция, которая является эффективной для продуцирования кодируемого белка или его фрагмента в подходящих условиях.

Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты, при ее введении животному в виде оголенной ДНК , может функционировать как эффективная экспрессионная система in situ (см., например, Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993); и Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993)). Доставка ДНК может быть также улучшена с использованием бупивикаина, полимеров и пептидов; и альтернативно, для этих целей могут быть использованы катионные липидные комплексы, частицы, или может быть приложено давление (см., например, патент США № 5922687).

Примерами аминокислотных последовательностей, которые, по меньшей мере, или примерно более чем на 95%, а именно, по меньшей мере, или примерно более чем на 96%, 97%, 98% или 99% идентичны последовательностям SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16, являются аминокислотные последовательности, содержащие одну или несколько замен, инсерций, добавлений и/или делеций. Идентичность последовательностей может быть определена путем выравнивания полипептидных последовательностей и их сравнения с помощью общедоступных компьютерных алгоритмов, таких как BLASTP (Pearson et al., PNAS USA 85: 2444-2448 (1988); Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); и Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). Программное обеспечение BLASTP имеется на сервере FTP Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) или NCBI, Национальной Медицинской Библиотеки (National Library of Medicine, Building 38A, Room 8NSO5, Bethesda, MD 20894). Для определения процента идентичности последовательностей, после выравнивания полипептидных последовательностей, определяют число идентичных аминокислот по всем выравниваемым участкам, а затем число идентичных аминокислот делят на общее число аминокислот представляющего интерес полипептида, и результат умножают на 100.

В соответствии с этим, для среднего специалиста в данной области очевидно, что фрагмент данной аминокислотной последовательности может быть, по меньшей мере, примерно или более чем на 95%, а именно на 96%, 97%, 98% или 99% идентичен указанной аминокислотной последовательности. Таким образом, можно сказать, что эти фрагменты охватывают аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно или более чем на 95% (96%, 97%, 98%, или 99%) идентична последовательностям SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16 . При этом желательно, чтобы такие фрагменты сохраняли иммуногенность полноразмерного белка. Функциональные фрагменты могут быть получены путем анализа на мутации нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, и последующей экспрессии полученного мутантного белка, или путем химического/ферментативного гидролиза самого белка.

Модификации, такие как замены, инсерции, добавления и/или делеции могут быть введены в нуклеиновую кислоту или белок (или его фрагмент) методами, известными специалистам (см., например, Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), где описан олигонуклеотид-направленный сайт-специфический мутагенез). При этом желательно, чтобы такая модификация, по существу, не снижала иммуногенность фрагмента белка; а предпочтительно, чтобы его иммуногенность, в основном, сохранялась на том же уровне, или превышала иммуногенность немодифицированного белка.

Термин консервативная замена означает замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую аналогичными свойствами, то есть имеющую аналогичную вторичную структуру и гидропатическую природу. Аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства полярностей, зарядов, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Так, например, взаимозаменяемыми могут быть отрицательно заряженные аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, или положительно заряженные аминокислоты, такие как лизин и аргинин; либо аминокислоты, входящие в группу аминокислот с незаряженными полярными головными группами и имеющие аналогичную гидрофильность. В соответствии с этим, взаимозаменяемыми могут быть такие аминокислоты, как лейцин, изолейцин и валин; либо такие аминокислоты, как глицин и аланин; либо такие аминокислоты, как аспарагин и глутамин; либо такие аминокислоты, как серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другими группами аминокислот, в пределах которых аминокислоты могут быть взаимозаменяемыми, являются: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser и thr; (2) cys, ser, tyr и thr; (3) val, ile, leu, met, ala и phe; (4) lys, arg и his; и (5) phe, tyr, trp и his.

Исходя из вышеуказанного, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей выделенный или очищенный белок/нуклеиновую кислоту или фрагмент указанного белка или нуклеиновой кислоты, и биологически приемлемый носитель. Нуклеиновая кислота или ее фрагмент могут быть частью вектора. См., например, патент США № 4029763, в котором описана вакцина против гриппа, содержащая белок NM в качестве активного ингредиента, и патент США № 4140762, в котором описана вакцина против гриппа, содержащая белки НА и NM в качестве активных ингредиентов. В патенте США № 4826687 описано добавление мурамил-дипептида в вакцину, содержащую белки HA и NM. При желании, в композицию, состоящую из белка/нуклеиновой кислоты или их фрагментов, могут быть добавлены полипептиды, в основном, соответствующие аминокислотам 148-162, 163-166 и/или 215-239 белка Ml (см., например, патенты США № № 5136019; 5616327 и 5741493). В данной композиции может быть использован любой подходящий биологически приемлемый носитель. Так, например, белок(белки)/нуклеиновая(ые) кислота(ы)/их фрагменты могут быть ресуспендированы в разбавителе, например в 0,9% растворе хлорида натрия, необязательно забуференном, например, фосфатным буфером. Любое количество сахарозы, оставшейся после очистки вируса, может быть удалено путем диализа. Для удаления всех остаточных катионогенных детергентов могут быть проведены диализ или гель-хроматография. Белок или его фрагмент, предпочтительно, присутствуют в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа (то есть, клеточного или гуморального) у животного. Наиболее часто используемым носителем для фармацевтических средств и антигенов является сополимер D,L-лактида и гликолида (PLGA). PLGA представляет собой биологически разлагаемый полиэфир, который может быть использован для регулируемого высвобождения антигена (Eldridge et al., Curr. Topics Micro. Immune 146: 59-66 (1989); см. также патент США № 6090393). Было показано, что включение антигенов в микросферы PLGA диаметром 1-10 микрон дает превосходный адъювантный эффект при их пероральном введении.

При желании может быть добавлен консервант или инактивирующий агент, такой как формальдегид. Обычно количество консерванта/инактивирующего агента составляет 1 часть на 10000 частей.

При желании, один или несколько белков (или их иммуногенных фрагментов), таких как вышеописанный белок HA, могут быть объединены с протеосомами. См., например, патент США № 6743900 и публикацию заявки на патент США № 2004/0156867.

Иммуногенность может быть повышена путем введения стандартных иммунологических адъювантов, таких как гидроксид алюминия (например, около 0,2%) или фосфат алюминия, алюминий (см., например, патенты США № № 6372223, 6635246, 6861244 и 7052701 и публикации заявок на патенты США № № 2004/0096464 и 2006/0147468), хитозан (см., например, патенты США № № 6136606 и 6534065), квасцы, например, в виде гидроксида алюминия, фосфата алюминия или оксида алюминия, минеральные масла (например, Bayol F® и Marcol 52®), полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, мурамил-дипептид, монофосфориллипид А и сапонины, включая компонент Quil A. Иммуногенность может быть также повышена путем добавления цитокина, такого как интерлейкин, или путем конъюгирования белков или их фрагментов. Белок или его фрагмент предпочтительно конъюгируют с макромолекулярным носителем, таким как белок (например, сывороточный альбумин, гемоцианин лимфы улитки, иммуноглобулин, тироглобулин и овальбумин), полисахарид (например, функционализированная латексом сефароза, агароза, целлюлозные сферы и т.п.), фосфолипид, полимерные аминокислоты (например, полиглутаминовая кислота, полилизин и т.п.) или сополимеры аминокислот (см., например, патенты США № № 5136019 и 5612037). Альтернативно, белок или его фрагмент могут быть заключены в протеолипосому или липидную везикулу.

Композиция, которая может индуцировать иммунный ответ, может быть получена в виде суспензии, либо она может быть лиофилизована. В случае лиофилизации предпочтительно добавлять один или несколько стабилизаторов. Подходящими стабилизаторами являются, например, сахароза, фосфат, глутамат и альбумин (SPGA; Bovarnick, J. Bacterid. 59: 509 (1950)), углеводы (например, сорбит, маннит, крахмал, декстран и глюкоза), белки (например, альбумин и казеин) или продукты их разложения, белок-содержащие вещества (например, бычья сыворотка или сепарированное молоко) и буферы (например, фосфаты щелочных металлов).

Альтернативно, может быть изготовлена композиция с регулируемым высвобождением. Аттенюированный/инактивированный вирус или рекомбинантный вектор могут быть микрокапсулированы в полимеры, такие как поликарбонаты, полиэфиры, полиуретаны, полиортоэфиры и полиамиды. Выбор конкретного полимера зависит от ряда факторов, включая воспроизводимость синтеза полимеров и микрокапсуляции; стоимость материалов и производственные затраты; токсикологический профиль; требования, предъявляемые к кинетике изменения высвобождения; и физико-химическая совместимость полимера и вируса/вектора.

Описанные здесь композиции могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими активными ингредиентами/композициями. Примерами являются композиции, которые могут индуцировать иммунный ответ против чумы собак; инфекционного собачьего гепатита (CAV-1 и CAV-2); бешенства; парагриппа; заболевания, вызываемого собачьим коронавирусом; кори; лептоспироза; и заболевания, вызываемого Bordetella. Ранее было описано, что полифенолы ингибируют развитие гриппа у человека (см., например, патент США № 5173922; патент '922). А поэтому добавление полифенола, такого как галлат эпигаллокатехина, галлат эпикатехина, эпигаллокатехин, эпикатехин, свободный теафлавин, моногаллат теафлавина A, моногаллат теафлавина B и/или дигаллат теафлавина, может давать благоприятный эффект (см. патент '922). Ингибиторы белка NM описаны в патенте США № 5453533. Использование цитокинов в качестве иммуностимуляторов и инкапсуляция в липосомы описаны в патенте США № 5919480.

Количество нуклеиновой кислоты в композиции может широко варьироваться. Так, например, ее концентрация может составлять примерно от менее чем 0,1 мас.% до 20-50 мас.% или более, а обычно, по меньшей мере, примерно 2 мас.%. Концентрация белка в композиции также может широко варьироваться. Так, например, такая концентрация может составлять примерно от менее чем 0,1 мас.% до 20-50 мас.% или более, а обычно, по меньшей мере, примерно 2 мас.%. При определении конечной концентрации следует учитывать объем и вязкость жидкости.

В соответствии с этим, настоящее изобретение также относится к способу индуцирования иммунного ответа против вируса собачьего гриппа у животного. Восприимчивость животного к инфекции может быть оценена с помощью теста на подавление бляшкообразования (патент США № 4315073) или теста на гемаглютинацию. Указанный способ включает введение животному вышеописанной композиции, содержащей выделенные или очищенные белок/нуклеиновую кислоту или их фрагмент. Если композиция содержит нуклеиновую кислоту (или ее фрагмент) как часть вектора, то белок (или его фрагмент), предпочтительно, экспрессируется в количестве, достаточном для индуцирования иммунного ответа у животного. Так, например, может быть введена разовая доза, содержащая примерно 9-43 МЕ (международных единиц) на килограмм массы тела животного. Для более крупных млекопитающих разовая доза может содержать примерно 600-3000 МЕ на килограмм массы тела животного. В случае вакцинных композиций, полученных путем культивирования вируса в аллантоисном мешочке оплодотворенных яиц, с последующим сбором вируса и, если это необходимо, стабилизацией собранного вируса с использованием такого стабилизатора, как пептон или сахароза, а также с последующим распределением этого вируса по стеклянным сосудам для лиофилизации, разовая эффективная доза вакцины может содержать вирус в концентрации EID₅₀ , равной, по меньшей мере, 10⁷ (доза, вызывающая инфицирование 50% куриных эмбрионов). В последнем случае лиофилизованную вакцинную композицию, до ее введения, разводят водой или другим фармацевтически приемлемым разбавителем и получают вакцину в форме назального спрея или капель в нос. При желании, могут быть введены две дозы такой вакцины с интервалом в одну неделю.

Указанная композиция может быть введена щенкам в возрасте 12 недель в виде разовой дозы, либо она может быть введена щенкам периодически, начиная с возраста 6 недель (например, через 6, 9 и 12 недель), или еженедельно, начиная с возраста 4 недели. Эффективную дозу и способ ее введения назначают в зависимости от природы композиции, природы продукта экспрессии, LD₅₀, а при использовании рекомбинантного вектора в зависимости от уровня экспрессии вектора, а также от породы собак, их возраста, пола, массы тела и состояния здоровья. Дозы экспрессированного продукта могут варьироваться от нескольких микрограммов до нескольких сотен микрограммов, например от 5 до 500 мкг. Предпочтительные дозы вируса или рекомбинантного вектора могут составлять примерно от 10³ до 10 ⁶ б.о.е. Доза TCID₅₀ живого аттенюированного штамма может составлять, по меньшей мере, примерно 10³.

Указанные композиции могут быть введены парентерально (то есть путем инъекции (например, внутрикожной, подкожной и внутримышечной)) или путем инфицирования, например, интраназально или вовнутрь кишечника (например, перорально). Использование гелеобразующего вещества и муко- или биоадгезива в целях усиления иммунного ответа против внутрикожно вводимой иммуногенной композиции описано в публикации заявки на патент США № 2005/0255121. При желании, композиция для индуцирования иммунного ответа может быть введена с питьевой водой или с сиропом, как описано Chu et al. (заявка на патент США № 2006/0171960, опубликованная 3 августа 2006). Пероральное введение является предпочтительным, поскольку оно позволяет избежать необходимости длительного и трудоемкого введения внутримышечных инъекций, которые, в свою очередь, могут вызывать у животного состояние стресса и дискомфорта. Кроме того, такое состояние дискомфорта может влиять на рабочие качества собак породы гончих. Альтернативно, композиция, содержащая рекомбинантный вектор, экспрессирующий, по меньшей мере, один эпитоп, индуцирующий иммунный ответ, может быть нанесена непосредственно на кожу в целях осуществления локализованной экспрессии и индуцирования иммунного ответа.

Эффективность композиции, способной индуцировать иммунный ответ, может быть продемонстрирована путем инфицирования щенков посредством их обработки вирулентным штаммом вируса собачьего гриппа. У необработанных собак должны развиваться клинические признаки, характерные для инфекций, вызываемых вирусом собачьего гриппа, тогда как у обработанных собак такие признаки должны отсутствовать.

Рекомбинантные векторы и продукты их экспрессии могут быть использованы для продуцирования антител, таких как поликлональные антитела (pAb) и моноклональные антитела (mAb), в соответствии с методами, известными специалистам (Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Shepherd and Dean, Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press, U.S.A. (2000); и Harris and Adair, Antibody Therapeutics, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1997)). Антитела, в частности mAb, могут быть использованы в анализах на связывание и в диагностических наборах/тестах для анализа на присутствие/отсутствие антигена вируса собачьего гриппа, либо на стимуляцию или отсутствие стимуляции иммунной реакции в ответ на воздействие вируса. Указанные антитела могут быть также использованы для выделения материала путем иммуноадсорбционной хроматографии.

Антитела могут быть использованы для пассивной иммунизации. Так, например, животному могут быть инъецированы неполностью очищенная иммунная сыворотка, взятая у животных-хозяев, или антитела, полученные из гибридомных клеточных линий. Эти антитела будут продуцировать терапевтический эффект посредством связывания и нейтрализации инфекционного вируса гриппа.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей антиидиотипическое антитело, имеющее внутренний образ эпитопа вышеописанного белка, такого как белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.

Для среднего специалиста в данной области очевидно, что может быть получено антиидиотипическое антитело, несущее внутренний образ эпитопа, такого как эпитоп, описанный в настоящей заявке. См., например, Herlyn et al., Science 232: 100-102 (1986). Методы получения моноклональных и поликлональных антиидиотипических антител, которые несут внутренний образ полипептида, описаны, например, в патенте США № 5053224. Вкраце, поликлональные антиидиотипические антитела могут быть продуцированы путем иммунизации животных моноклональными идиотипическими антителами, вырабатываемыми против данного полипептида и скринированными на их реактивность с данным полипептидом, и последующего скрининга на антисыворотку, которая реагирует с идиотипическими антителами к полипептиду. Моноклональные антитела (mAb) могут быть также получены от животных стандартными методами иммортализации антитело-секретирующих клеток животного и скрининга культур с использованием идиотипических антител на их конкурентное связывание с данным полипептидом. Хотя mAb являются предпочтительными, однако могут быть также использованы и поликлональные антитела (pAbs), которые могут быть получены в различных системах млекопитающих.

Настоящее изобретение также относится к способу индуцирования иммунного ответа против CIV у собак. Этот способ включает введение собакам эффективного количества композиции, содержащей вышеописанное антиидиотипическое антитело.

Выделенные или очищенные молекулы нуклеиновой кислоты или векторы, содержащие эти молекулы, могут быть использованы для генерирования ДНК в целях получения зондов/праймеров, которые могут быть использованы для детектирования присутствия или отсутствия гибридизуемой ДНК или для амплификации ДНК, такой как кДНК.

В анализах могут быть использованы меченые белки или их фрагменты, а также меченые нуклеиновые кислоты или их фрагменты. Такими методами анализа являются флуоресцентные иммуноанализы (Smith et al., Ann. Clin. Biochem. 18: 253-275 (1981)), радиоиммуноанализы (РИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и иммуноанализ с ферментативным усилением (EMIT; см. Enzyme Immunoassay, Maggio, ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1980. pp. 141-150; 234-235, and 242-243). Эти методы могут быть использованы для детектирования присутствия вируса и для диагностики инфекционного состояния.

В качестве вектора может быть использован и сам вирус. Использование вирусов в качестве вектора известно специалистам.

Пример

Нижеследующий пример служит для иллюстрации настоящего изобретения. Этот пример не должен рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. В данном примере описана идентификация и частичная характеризация вируса собачьего гриппа.

Вспышки острого респираторного заболевания, характеризующегося кашлем, высокой температурой, учащенным дыханием и носовыми кровотечениями, наблюдались в апреле 2005 у собак породы грейхаунд, находившихся в двух различных питомниках на территориях собачьих бегов в восточной и западной Айове. Среди заболевших собак был большой процент выздоровевших, однако многие из них погибли от геморрагической пневмонии.

Легкие пораженных инфекцией собак приобретали интенсивный цвет от красного до черно-красного, имели уплотнения от умеренных до явно пальпируемых, а также обнаруживали фиброзный плеврит. Срезы легких обнаруживали картину от тяжелой геморрагической интерстициальной пневмонии до бронхоинтерстициальной пневмонии. Наблюдались очаговые интерстициальные изменения с утолщением альвеолярной перегородки, образованием сгустков дебриса в альвеолах и ассоциированным с ними ателектазом. Наблюдалась очаговая экстенсивно пиогрануломатозная бронхоинстициальная пневмония с расширением дыхательных путей за счет разрушенных клеток и дебриса. Обнаруживались также рассеянный васкулит и сосудистые тромбы.

Микробиологический тест на стандартные вирусные и бактериальные агенты не выявил каких-либо явных патогенов, за исключением Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, которые присутствовали в легочной ткани у всех обследованных животных. Два из четырех протестированных образцов легких были позитивными на вирус гриппа, на что указывала полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой, проводимая в режиме реального времени (ОТ-ПЦР; Harmon et al., Development of a PCR-based differential test for HI Nl и H3N2 swine influenza viruses. In: Proceedings of the 42nd Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians . San Diego, CA. October 1999, p.44). Иммуногистохимический анализ тест-образцов, проводимый с использованием моноклонального антитела (mAb), специфичного к белку NP вируса гриппа (Vincent et al., J. Vet. Diagn. Invest. 9: 191-195 (1997)), также дал положительный результат на поражение обоих легких вирусной пневмонией, на что указывал ELISA-анализ, проводимый методом антигенной ловушки (Directgen^TM Flu A, Becton/Dickinson, Sparks, MD). Образцы бронхоальвеолярного лаважа, полученные от двух легких, протестированных с помощью ПЦР, были позитивными на вирус гриппа.

Была предпринята попытка выделения вируса, поскольку обнаружение вируса гриппа в легких собак было неожиданным, так как имеется лишь одно сообщение об обнаружении вируса инфекционного гриппа у собак (Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. In: Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. Greensboro, NC. October 2004. p.158). Вирус, способный агглютинировать петушиные эритроциты, был выделен из клеток легких и бронхоальвеолярной жидкости одного из двух животных, у которого с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ) и ПЦР был обнаружен вирус гриппа, и введен в клетки почек собак Madin-Darby (MDCK). С помощью ПЦР было определено, что этот изолят вируса гриппа имеет подтип H3. С помощью анализов на ингибирование белка HA и белка NM было установлено, что этот вирусный изолят имеет подтип Н3N8. Указанный вирусный изолят распознавался антисывороткой против различных вирусов лошадиного гриппа H3, включая вирус Майями ((A/Eq/MI/l/63-H3N8) 640-1280), AK((A/Eq/AK/29759/91-H3N8) 320-640) и вирус Кентуки ((A/Eq/Kentucky/81-H3N8) 160-320).

Секвенирование генов HA и NA обоих изолятов выявило 100% и 99,8% идентичность между этими изолятами, соответственно. Филогенетический анализ показал, что ген НА данных изолятов имел генетическое сходство (96-98%-ную гомологию нуклеотидов) с недавно обнаруженным геном HA вирусов лошадиного гриппа H3N8 (Macken et al., The value of a database in surveillance и vaccine selection. In: Options for the Control of Influenza IV . Osterhaus et al., eds. Elsevier Science, Amsterdam. 2001, pp.103-106). Было также показано, что ген NA изолятов также имеет 96-98% гомологию с недавно обнаруженным геном NA вирусов лошадиного гриппа H3N8. Поскольку собаки породы грейхаунд, содержавшиеся в двух различных питомниках на географически удаленных территориях собачьих бегов в штате Айова, одновременно погибли от болезни, а находившиеся там лошади не были поражены этой болезнью, то это означает, что изолят вируса гриппа представляет собой адаптированный штамм собачьего вируса, который может присутствовать в организме в течение всей жизни и передаваться другим собакам. За тяжесть этого заболевания, вероятно, ответственен микроорганизм S. zooepidemicus, который вызывает респираторное заболевание и септические осложнения у различных животных многих видов (Wood et al., J. Clin. Microbiol. 43: 120-126 (2005); and Gillespie et al., The General Staphylococcus and Streptococcus. In: Hagan and Burner's Infectious Diseases of Domestic Animals. 7th ed. Comstock/Cornell University Press. Ithaca, NY. 1981, pp.164-180).

Все ссылки на литературу, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в настоящей заявке, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждый из указанных документов был отдельно введен в настоящее описание посредством ссылки. При употреблении артиклей а , an и the и аналогичных языковых объектов (референтов), соотносимых с данным существительным, подразумевается, что существительные, используемые в контексте настоящего изобретения (в частности, в нижеследующей формуле изобретения), могут присутствовать как в единственном числе, так и во множественном числе, если это не оговорено особо, и если это явно не противоречит контексту изобретения. Если вместо отдельных величин приводятся интервалы величин, то это продиктовано лишь желанием ускорить перечисление отдельных конкретных величин, входящих в данный интервал, если это не оговорено особо, и каждая такая величина вводится в настоящее изобретение так, как если бы она была указана отдельно. Все описанные здесь методы могут быть осуществлены в любом нужном порядке, если это не оговорено особо, или если это не противоречит контексту настоящего изобретения. Каждый пример или все примеры, или используемые здесь иллюстративные термины (например, такой как ) приводятся лишь для лучшего понимания изобретения, и не ограничивают его объема, который определен в нижеследующей формуле изобретения. Однако термины, употребляемые в настоящем описании, не должны быть истолкованы как указание на какой-либо незаявленный элемент, который может иметь важное значение для осуществления изобретения.

В настоящей заявке описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, включая наилучший способ его реализации, известный авторам настоящего изобретения. При этом следует отметить, что проиллюстрированные варианты приводятся лишь в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничение изобретения.