способ дифференциальной диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите с

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С путем забора у пациента венозной крови и определения концентрации в сыворотке крови трансформирующего фактора роста-1 (TGF-1 ) методом твердофазного иммуноферментного анализа, при значении концентрации TGF-1 более 400 пг/мл диагностируют слабый или умеренно выраженный фиброз печени, а при значении TGF-1 менее 400 пг/мл - тяжелый фиброз или цирроз печени.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням и гепатологии, и может быть использовано для проведения неинвазивной диагностики выраженности фиброза печени.

Известны морфологические методы определения выраженности фиброза печени, оцениваемые полуколичественно по R.G.Knodell (1981), K.G.Ishak (1994), K.P.Batts (1995), и наиболее используемая шкала оценки гистологических изменений печени METAVIR (1996), предусматривающая оценку четырех стадий фиброза [Серов В.В. Сравнительная морфологическая характеристика хронических вирусных гепатитов В и С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1999. - № 1. - С.36-40].

Недостатком морфологического метода является его инвазивность, травматичность для пациента, большая вероятность таких осложнений, как кровотечение, билиарный перитонит и невозможность получения воспроизводимого результата при повторных исследованиях. Летальность, связанная с проведением биопсии, в среднем составляет 0,01%. В ряде случаев указанную манипуляцию невозможно выполнить из-за наличия противопоказаний.

Существуют способы диагностики фиброза печени путем подсчета количества баллов по классификационной счетной шкале М. Bonacini с использованием 3 параметров: количества тромбоцитов, протромбинового времени и соотношения активности АлАТ/АсАТ. У пациентов с количеством баллов 7 и более диагностируют фиброз 3-4 балла, т.е. портопортальный и портоцентральный фиброз печени или предполагают цирроз печени [Ющук Н.Д., Знойко О.О., Сафиуллина Н.Х., Келли Е.И. Пункционная биопсия печени и возможности неинвазивного мониторинга фиброза при хроническом вирусном гепатите С // Клин. перспективы гастроэнтерол., гепатол. - 2002. - № 1. - С.9-16].

К недостаткам способа следует отнести низкую чувствительность этого теста, которая не превышает 50%.

Изобретение направлено на решение задачи: разработка неинвазивного способа диагностики фиброза печени, обладающего высокой точностью.

Поставленная задача достигается тем, что способ дифференциальной диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С осуществляют путем забора у пациента венозной крови и определения концентрации в сыворотке крови трансформирующего фактора роста-1 (TGF-1 ) методом твердофазного иммуноферментного анализа, и при значении концентрации TGF-1 более 400 пг/мл диагностируют слабый или умеренно выраженный фиброз печени, а при значении TGF-1 менее 400 пг/мл - тяжелый фиброз или цирроз печени.

Изобретение иллюстрируется приложенными диаграммами:

на фиг.1 показан средний уровень TGF-1 в крови больных ХВГС и здоровых лиц;

на фиг.2 - средний уровень TGF-1 в сыворотке крови больных ХВГС в зависимости от стадии фиброза.

Характеристики метода согласно предложенному способу:

1. Чувствительность = 75%.

2. Специфичность = 92,3%.

3. Точность = 84%.

4. Ожидаемая ценность = 92,3%.

Преимущество метода - инвазивность, определение выраженности фиброза ткани печени с точностью 84% без проведения пункционной биопсии печени.

Известно, что фиброгенез - это универсальный процесс, основу которого составляет избыточное накопление протеинов внеклеточного матрикса и тканевых коллагеназ, основным источником которых являются звездчатые клетки печени. Звездчатые клетки (липоциты, клетки Ито) в нормальной ткани печени находятся в покоящемся состоянии и, накапливая ретиноиды, производят протеины внеклеточного матрикса. Исследованиями последних лет установлено, что активация звездчатых клеток медиаторами клеточного воспаления, к которым помимо активных форм кислорода, секретируемых поврежденными гепатоцитами, исследователи относят и некоторые факторы роста, являются основным патогенетическим звеном фиброгенеза. Звездчатые клетки при этом перемещаются в зону центральной вены и превращаются в активированный фенотип (становятся похожими на миофибробласты), активно пролиферируют и теряют запасы ретиноидов.

По данным некоторых исследователей, среди ростовых факторов с профиброгенным действием важное значение имеет трансформирующий фактор роста-1 (TGF-1 ). В ранее проведенном исследовании C.Hora, et al. (2006) (Connective tissue growth factor (CTGF) the missing link between steatosis, insulin resistance and fibrosis in patients with chronic hepatitis С / C. Hora, F. Negro, L. Rubbia et al. // J. Hepatology. - 2006. - Vol.11(2). - P.535) показали, что TGF-1 наряду с фактором хемотаксиса моноцитов-1 кодирует синтез белков, участвующих в иммунном воспалении, ведет к изменению характера иммунного ответа на вирусную инфекцию. С биологическим действием TGF-1 связывают трансформацию звездчатых клеток в миофибробласты и опосредованную этим механизмом стимуляцию синтеза белков внеклеточного матрикса. В немногочисленных исследованиях, представленных в современной литературе имеются сведения, свидетельствующие о повышении содержания TGF-1 при хроническом вирусном гепатите С (ХВГС), участие фактора в процессе фиброгенеза печени. Однако следует признать, что однозначно ясного представления о механизмах участия TGF-1 в патоморфогенезе ХВГС, как и данных о его содержании в сыворотке крови больных при различных стадиях фиброза при ХВГС на настоящем этапе изучения патогенеза этого заболевания не имеется.

Возможность неинвазивной оценки процессов фиброгенеза при ХВГС и факторов, влияющих на них, представляется весьма ценной для клинической практики, дает возможность выбрать тактику наблюдения больных и наиболее точно определить объем терапевтических мероприятий.

Показатели содержания TGF-1 в сыворотке крови больных ХВГС

Было изучено содержание TGF-1R в крови 35 обследованных нами больных ХВГС, из них 25 больным произведена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании гепатобиоптатов был выявлен фиброз ткани печени различной стадии (F1-F4 по шкале METAVIR, 1996 г.). Так, расширение портальных трактов за счет фиброза без образования септ (F1) было выявлено у 3 (12%), портальный фиброз с редкими септами (F2) выявлен у 10 (40%), многочисленные септы без формирования цирроза (F3) у 10 (40%), цирроз печени (F4) у 2 (8%) обследованных больных ХВГС.

Выбор нами именно этого фактора роста был связан с широким спектром его биологического действия. Так, TGF-1 является важным просклерогенным медиатором фиброгенеза, играя исключительную роль в образовании миофибробластов.

Проведенное исследование по содержанию TGF-1 позволили выявить его повышенную концентрацию в сыворотках крови у всех больных ХВГС по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы.

При исследовании содержания TGF-1 в сыворотках крови больных ХВГС было обнаружено значительное его повышение. Средний уровень концентрации TGF-1 составил 485±28,2 пг/мл, что достоверно превышало показатель его среднего содержания по сравнению с группой здоровых лиц 77,41±5,1 пг/мл (Р<0,001) (см. фиг.1).

При изучении содержания TGF-1 в зависимости от клинико-биохимических данных и некоторых эпидемиологических факторов было установлено, что наличие клинических либо отсутствие проявлений заболевания, отягощенного преморбидного фона хронической соматической патологией и наркологического анамнеза не оказывало существенного влияния на содержание TGF-1 в крови (Р>0,05). Эти данные позволяют судить о том, что изменение сывороточного содержания TGF-1 1 у обследованных больных было обусловлено хроническим течением HCV-инфекции.

Был проведен сравнительный анализ содержания TGF-1 в сыворотках крови больных ХВГС в зависимости от степени фиброза (см. фиг.2).

Показатели среднего содержания TGF-1(3 в сыворотке крови у больных ХВГС с различной степенью выраженности фиброза ткани печени представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Концентрация TGF-1 в сыворотках крови больных ХВГС в зависимости от степени фиброза печени
Фактор роста	Стадия фиброза по METAVIR(1996)
Фиброз отсутствует (F0) n=0	Слабый фиброз (F1) n=3	Умеренный фиброз (F2) n=10	Тяжелый фиброз (F3) n=10	Цирроз печени (F4) n=2
TGF-1 (пг/мл)	-	403,1±12,42	648,4±39,47	344±34,54	303,8±52,9

При изучении взаимосвязи содержания в сыворотке крови TGF-1 с выраженностью фиброза печени было установлено, что повышение уровня TGF-1 отмечалось в группах больных со слабо- и умеренно выраженным фиброзом ткани печени (F1 и F2).

Так, у больных ХВГС со слабовыраженным фиброзом (F1) средний уровень TGF-1 в сыворотке крови составил 403,1±12,42 пг/мл, с умеренно выраженным фиброзом (F2) был еще более высоким - 648,4±39,47 пг/мл (Р<0,001). В то же время у больных ХВГС с более выраженными фибротическими изменениями - тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3 и F4) средние значения концентрации TGF-1R были достоверно более низкими, чем в группах больных с F1 и F2 и составили 344±34,54 и 303,8±52,9 пг/мл соответственно, не отличаясь между собой (Р>0,05). Установлено значимое снижение TGF-1 в крови у больных с тяжелым фиброзом (F3) в сравнении с этим показателем у больных, имеющих умеренный (F2) фиброз - 344±34,54 против 648,4±39,47 пг/мл (Р<0,001). Таким образом, можно заключить, что наибольшая степень гиперпродукции TGF-1 происходит на ранних этапах фиброгенеза. Показатели среднего содержания TGF-1 в зависимости от этапа фиброгенеза представлены в таблице 2.

Таблица 2.
Концентрация TGF-1 в сыворотке крови больных ХВГС
Факторы роста	Этапы фиброгенеза у обследованных больных ХВГС (n=25)	Показатель достоверности Р
Слабый и умеренный фиброз(F1-F2) n=13	Тяжелый фиброз и цирроз печени (F3-F4) n=12
TGF-1 (пг/мл)	591,8±42,36	337,3±29,6	Р<0,001

При сравнительном анализе значений концентрации TGF-1 в сыворотке крови на раннем и позднем этапах фиброгенеза при ХВГС, напротив, были установлены значимые различия - 591,8±42,36 против 337,3±29,6 пг/мл соответственно (Р<0,001). Выявленная значимая разница и большой разрыв значений этих показателей стали основой предложенного нами неинвазивного способа разграничения умеренного и тяжелого фиброза, позволяющий дифференцировать выраженность фибротических изменений в печени при ХВГС без проведения пункционной биопсии печени.

При проведении нами исследования индивидуальные значения концентрации TGF-1 были выше 400 пг/мл у 12 (92,3%) из 13 больных ХВГС со слабо- и умеренно выраженным фиброзом (F1-F2) и лишь у 3 (25%) из 12 больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4) (Р<0,001). В то же время снижение концентрации TGF-1 ниже значения 400 пг/мл было отмечено у 9 (75%) из 12 больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4) и лишь у 1 (7,7%) из 13 пациентов с ХВГС со слабовыраженным фиброзом (F1-F2) (Р<0,001). Удельный вес обследованных больных в зависимости от концентрации TGF-1 и выраженности фиброза представлен в таблице 3.

Таблица 3.
Концентрация TGF-1 в сыворотке крови больных ХВГС
Концентрация TGF-1	Этапы фиброгенеза у больных ХВГС	Показатель достоверности Р
Слабый и умеренный фиброз (F1-F2) n=13	Тяжелый фиброз и цирроз печени (F3-F4) n=12
Абс.	%	Абс.	%
400 пг/мл и более	12	92,3	3	25	Р<0,001
менее 400 пг/мл	1	7,7	9	75	Р<0,001

С учетом полученных нами данных возможно использовать определение в сыворотке крови уровня TGF-1 в качестве неинвазивного дифференциально-диагностического критерия для разграничения умеренного и тяжелого фиброза печени при хроническом течении HCV-инфекции.

По полученным результатам исследования были рассчитаны показатели чувствительности, специфичности, точности и ожидаемой ценности этого дифференциально-диагностического способа.

1. Чувствительность была рассчитана по формуле:

Чувствительность = ИПР/(ИПР+ЛОР)×100%

2. Специфичность была рассчитана по формуле:

Специфичность = ИОР/(ИОР+ЛПР)×100%

3. Точность была рассчитана по формуле:

Точность=(ИПР+ИОР)/(ИПР+ИОР+ЛОР+ЛПР)×100%

4. Ожидаемая ценность была рассчитана по формуле:

Ожидаемая ценность = ИОР/(ИОР+ЛПР)×100%

где

ИПР (истинные положительные результаты) - число больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4), у которых определение TGF-1 совпадало с данными гистологического исследования биоптата;

ЛОР (ложноотрицательные результаты) - число больных с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-F4), у которых определение TGF-1 не совпадало с данными гистологического исследования биоптата;

ИОР (истинные отрицательные результаты) - число больных, у которых при помощи определения концентрации TGF-1 в сыворотке крови был установлен слабый или умеренно выраженный фиброз (F1-F2);

ЛОР (ложноположительные результаты) - число больных, у которых по определению концентрации TGF-1 в сыворотке крови был ошибочно установлен слабый или умеренно выраженный фиброз;

Расчеты с учетом полученных результатов исследования:

5. Чувствительность = 9/(9+3)×100%=75%

6. Специфичность = 12/(12+1)×100%=92,3%

7. Точность = (12+9)/(9+12+1+3)×100%=84%

8. Ожидаемая ценность = 12/(12+1)×100%=92,3%

Таким образом, при определении TGF-1 в сыворотке крови пациента с хроническим течением гепатита С в концентрации менее 400 пг/мл с точностью 84% могут быть установлены стадии тяжелого фиброза и цирроза печени, а при уровне этого показателя 400 пг/мл и более - исключить их и диагностировать слабый или умеренный фиброз ткани печени.

Клинические примеры этого дифференциально-диагностического способа, демонстрирующие возможность эффективного применения определения концентрации TGF-1 в практике для разграничения умеренного и тяжелого фиброза, цирроза печени:

Пример 1. Выписка из медицинской карты стационарного больного № 1470/515. Больной С., 28 лет, госпитализирован с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. На догоспитальном этапе при профилактическом обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени и желчевыводящих путей не изменена. Активность АлАТ и АсАТ не превышали нормальные значения (0,57 и 0,31 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1 в сыворотке крови составила 376,1 пг/мл, что не позволяло исключить тяжелое фибротическое поражение печени. Пациенту выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При световой микроскопии гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки тяжелого фиброза печени - многочисленные септы без формирования цирроза, что соответствовало стадии F3 по шкале METAVIR.

Пример 2. Выписка из медицинской карты амбулаторного больного № 5109. Больная М., 41 год, наблюдается в консультативно-диагностическом кабинете инфекционного отделения Холмской ЦРБ с 2001 года, диагноз: хронический вирусный гепатит С. При случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени не изменена, калькулезный холецистит. Активность АлАТ и АсАТ не превышали нормальные значения (0,3 и 0,45 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1 в сыворотке крови составила 308,4 пг/мл, что также не позволяло исключить тяжелое фибротическое поражение печени. Пациентке выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При световой микроскопии гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки тяжелого фиброза печени - многочисленные септы без формирования цирроза, что соответствовало стадии F3 по шкале METAVIR.

Пример 3. Выписка из медицинской карты стационарного больного № 1502/560. Больная Н., 56 лет, госпитализирована с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. На догоспитальном этапе при случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР РНК HCV не обнаружена. Клинически выявлена умеренная гепатомегалия. Эхографическая картина печени и желчевыводящих путей не изменена. Активность АлАТ и АсАТ превышали нормальные значения в 1,5-2,5 раза (1,57 и 0,84 мкмоль/л·ч Е/л соответственно). Концентрация TGF-1 в сыворотке крови составила 594,9 пг/мл, что также не позволяло исключить фибротическое поражение печени. Пациентке выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При световой микроскопии гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки умеренно выраженного фиброза печени - портальный фиброз с редкими септами, что соответствовало стадии F2 по шкале METAVIR.

Пример 4. Выписка из медицинской карты стационарного больного № 1564/498. Больной М., 36 лет, госпитализирован с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. Из анамнеза: в 2004 году при случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. Динамически наблюдался в консультативно-диагностическом кабинете инфекционного отделения Холмской ЦРБ. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени и желчевыводящих путей не изменена. Активность АлАТ и АсАТ превышали нормальные значения в 1,5 раза (1,11 и 0,15 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1R в сыворотке крови составила 418,2 пг/мл. Пациенту выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании биоптата обнаружены морфологические признаки умеренно выраженного фиброза печени - портальный фиброз с редкими септами, что соответствовало стадии F2 по шкале METAVIR.

Пример 5. Выписка из медицинской карты амбулаторного больного № 5109. Больная Ф., 37 лет, наблюдается в консультативно-диагностическом кабинете инфекционного отделения Холмской ЦРБ с 2005 года, диагноз: хронический вирусный гепатит С. При профилактическом обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР РНК HCV не обнаружена. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени не изменена, калькулезный холецистит. Активность АлАТ и АсАТ не превышали нормальные значения (0,11 и 0,12 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1 в сыворотке крови составила 418,8 пг/мл. Пациентке была выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании гепатобиоптата обнаружены морфологические признаки легкого фиброза печени - расширение портальных трактов за счет фиброза без образования септ, что соответствовало стадии F1 по шкале METAVIR.

Пример 6. Выписка из медицинской карты стационарного больного № 1561/209. Больной К., 47 лет, диагноз: хронический вирусный гепатит С. При случайном обследовании в крови обнаружены анти-HCV core IgG, анти-NS3-, NS4-, NS5 IgG. При ПЦР обнаружена РНК HCV. Клинические проявления заболевания отсутствовали. Эхографическая картина печени не изменена, незначительное уплотнение паренхимы. Активность АлАТ и АсАТ имели нормальные значения (0,37 и 0,38 мкмоль/л·ч соответственно). Концентрация TGF-1 в сыворотке крови составила 250,9 пг/мл, что указывало на тяжелое фибротическое поражение печени. Пациенту выполнена чрезкожная пункционная биопсия печени. При гистологическом исследовании биоптата обнаружены морфологические признаки цирроза печени, что соответствовало стадии F4 по шкале METAVIR.

С учетом полученных нами данных можно заключить, что возможно использование определения в сыворотке крови уровня TGF-1 в качестве дополнительного неинвазивного дифференциально-диагностического критерия для разграничения умеренного и тяжелого фиброза печени при хроническом течении HCV-инфекции. Вероятно, при хроническом течении HCV-инфекции содержание TGF-1 в концентрации ниже 400 пг/мл ассоциировано с усилением процессов фиброгенеза печени, а его содержание в сыворотке крови свыше 400 пг/мл способствует снижению интенсивности фиброгенеза печеночной ткани.