аптамерные терапевтические средства, применимые для лечения связанных с комплементом расстройств

Формула изобретения

1. Композиция для лечения расстройства, в которое вовлечена опосредованная С5 активация комплемента, опосредованная С5а активация комплемента или опосредованная С5b-9 активация комплемента, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата аптамера/ПЭГ, имеющего последовательность согласно SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65 или SEQ ID NO:66 или его соли, где конъюгат аптамер/ПЭГ модулирует функцию белка комплемента С5, С5а или С5b-9.

2. Композиция по п.1, в которой аптамер конъюгирован с ПЭГ посредством линкера.

3. Композиция по п.2, в которой линкер является алкильным линкером.

4. Композиция по п.3, в которой алкильный линкер включает от 2 до 18 следующих друг за другом групп СН₂.

5. Композиция по п.1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

6. Способ лечения расстройства, в которое вовлечена опосредованная С5 активация комплемента, опосредованная С5а активация комплемента или опосредованная С5b-9 активация комплемента, включающий стадию введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, композиции по п.1, где расстройством, в которое вовлечена опосредованная С5 активация комплемента, опосредованная С5а активация комплемента или опосредованная С5b-9 активация комплемента является повреждение миокарда, связанное с CABG-хирургией, повреждение миокарда, связанное с баллонной ангиопластикой, повреждение миокарда, связанное с рестенозом, опосредованные белком комплемента осложнения, связанные с CABG-хирургией, опосредованные белком комплемента осложнения, связанные с чрескожным вмешательством в коронарные артерии, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, острое отторжение трансплантата, гиперострое отторжение трансплантата, подострое отторжение трансплантата и хроническое отторжение трансплантата.

7. Композиция для лечения расстройства, в которое вовлечена опосредованная С5 активация комплемента, опосредованная С5а активация комплемента или опосредованная С5b-9 активация комплемента, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата аптамера/ПЭГ, имеющего структуру, указанную ниже, или его соли:



где означает линкер.

Аптамер=

fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU

AfCfCfUmGfCmG-3Т (SEQ ID NO:4),

где fC и fU=2'-фторнуклеотиды, a mG и mA=2'-ОМе-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-ОН-нуклеотидами, и 3Т означает инвертированный дезокситимидин, где конъюгат аптамер/ПЭГ модулирует функцию белка комплемента С5, С5а или С5b-9.

8. Композиция по п.7, в которой линкер является алкильным линкером.

9. Композиция по п.8, в которой алкильный линкер содержит от 2 до 18 следующих друг за другом групп СН₂.

10. Композиция по п.7, в которой конъюгат аптамер/ПЭГ имеет структуру, указанную ниже:



где аптамер=

fCmGfCfCGfCmGmGfUfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU

AfCfCfUmGfCmG-3Т (SEQ ID NO:4)

где fC и fU=2'-фторнуклеотиды, a mG и mA=2'-ОМе-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-ОН-нуклеотидами, и 3Т означает инвертированный дезокситимидин.

11. Композиция по п.10, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

12. Способ лечения расстройства, в которое вовлечена опосредованная С5 активация комплемента, опосредованная С5а активация комплемента или опосредованная С5b-9 активация комплемента, включающий стадию введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, композиции по п.10, где расстройством, в которое вовлечена опосредованная С5 активация комплемента, опосредованная С5а активация комплемента или опосредованная С5b-9 активация комплемента является повреждение миокарда, связанное с CABG-хирургией, повреждение миокарда, связанное с баллонной ангиопластикой, повреждение миокарда, связанное с рестенозом, опосредованные белком комплемента осложнения, связанные с CABG-хирургией, опосредованные белком комплемента осложнения, связанные с чрескожным вмешательством в коронарные артерии, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, острое отторжение трансплантата, гиперострое отторжение трансплантата, подострое отторжение трансплантата и хроническое отторжение трансплантата.

13. Конъюгат аптамер/ПЭГ, имеющий последовательность согласно SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65 или SEQ ID NO:66 или его соль.

14. Конъюгат аптамер/ПЭГ по п.13, в котором аптамер конъюгирован с ПЭГ посредством линкера.

15. Конъюгат аптамер/ПЭГ по п.14, в котором линкер является алкильным линкером.

16. Конъюгат аптамер/ПЭГ по п.15, в котором алкильный линкер включает от 2 до 18 следующих друг за другом групп СН₂.

17. Конъюгат аптамер/ПЭГ, имеющий структуру, указанную ниже, или его соль:



где означает линкер.

Аптамер=

fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU

AfCfCfUmGfCmG-3Т (SEQ ID NO:4),

где fC и fU=2'-фторнуклеотиды, a mG и mА=2'-ОМе-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-ОН-нуклеотидами, и 3Т означает инвертированный дезокситимидин.

18. Конъюгат аптамер/ПЭГ по п.17, в котором линкер является алкильным линкером.

19. Конъюгат аптамер/ПЭГ по п.18, в котором алкильный линкер включает от 2 до 18 следующих друг за другом групп СН₂.

20. Конъюгат аптамер/ПЭГ по п.17, где конъюгат аптамер/ПЭГ имеет структуру, указанную ниже:



где означает линкер.

Аптамер=

fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU

AfCfCfUmGfCmG-3Т (SEQ ID NO:4),

где fC и fU=2'-фторнуклеотиды, а mG и mА=2'-ОМе-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-ОН-нуклеотидами, и 3Т означает инвертированный дезокситимидин.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение в общем относится к области нуклеиновых кислот и более конкретно к аптамерам, способным связываться с белком C5 системы комплемента, применимым в качестве средств для терапии и диагностики связанных с комплементом сердечных, воспалительных и аутоиммунных расстройств, ишемического реперфузионного повреждения и/или других заболеваний или расстройств, в которые вовлечена опосредованная C5 активация комплемента. Кроме того, изобретение относится к веществам и способам введения аптамеров, способных связываться с белком системы комплемента C5.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Аптамеры представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, обладающие специфической аффинностью связывания с молекулами посредством других взаимодействий, отличных от классического спаривания согласно Уотсону-Крику.

Аптамеры подобно пептидам, созданным с использованием фагового дисплея, или моноклональным антителам («мАт») способны специфически связываться с выбранными мишенями и модулировать активность мишеней, например, посредством связывания аптамеры могут блокировать способность мишеней функционировать. Созданные способом селекции in vitro из пулов олигонуклеотидов со случайными последовательностями аптамеры были образованы более чем для 100 белков, включая факторы роста, факторы транскрипции, ферменты, иммуноглобулины и рецепторы. Типичный аптамер имеет размер 10-15 кД (30-45 нуклеотидов), связывает свою мишень с субнаномолярной аффинностью и различает близкородственные мишени (например, аптамеры обычно не должны связывать другие белки из того же самого семейства генов). В ряде структурных исследований показано, что аптамеры способны использовать такие же типы взаимодействий при связывании (например, водородные связи, электростатическую комплементарность, гидрофобные взаимодействия, стерическое исключение), которые управляют аффинностью и специфичностью комплексов антитело-антиген.

Аптамеры обладают рядом свойств, требуемых для применения в качестве терапевтических средств и диагностических средств, включая высокую специфичность и аффинность, биологическую эффективность и превосходные фармакокинетические свойства. Кроме того, они обеспечивают конкретные конкурентоспособные преимущества по сравнению с антителами и другими белковыми биологическими средствами, например указанные ниже:

1) Скорость и контроль. Аптамеры получают полностью способом in vitro, что позволяет быстро создавать начальные варианты, включая терапевтические варианты. Селекция in vitro дает возможность тщательно контролировать специфичность и аффинность аптамера и позволяет создавать варианты, включая варианты как против токсичных, так и против неиммуногенных мишеней.

2) Токсичность и иммуногенность . Аптамеры как класс имеют малопроявляемую токсичность или иммуногенность или вовсе их не имеют. При хроническом введении крысам или суркам доз, содержащих высокие уровни аптамера (10 мг/кг в сутки в течение 90 дней), не наблюдали токсичности ни при каких клинических, клеточных или биохимических измерениях. В то время как эффективность многих моноклональных антител может быть сильно ограничена иммунным ответом к самим антителам, чрезвычайно трудно вызвать образование антител к аптамерам, наиболее вероятно, потому, что аптамеры не могут быть презентированы T-клетками посредством MHC, и иммунный ответ обычно не подготовлен для того, чтобы узнавать фрагменты нуклеиновых кислот.

3) Введение. Тогда как большинство одобренных в настоящее время терапевтических антител вводят посредством внутривенной инфузии (обычно в течение 2-4 часов), аптамеры можно вводить путем подкожной инъекции (биодоступность аптамеров при подкожном введении составляет >80% в исследованиях на обезьянах (Tucker et al., J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). Такое различие главным образом является следствием сравнительно низкой растворимости и, соответственно, больших объемов, необходимых в случае большинства терапевтических мАт. Благодаря хорошей растворимости (>150 мг/мл) и сравнительно низкой молекулярной массе (аптамер: 10-50 кД; антитело: 150 кД) еженедельная доза аптамера может быть доставлена посредством инъекции в объеме, составляющем менее 0,5 мкл. Кроме того, небольшой размер аптамеров позволяет им проникать в области, ограниченные конформационно, в которые не могут проникнуть антитела или фрагменты антител, что является еще одним преимуществом терапевтических или профилактических средств на основе аптамеров.

4) Масштабируемость и стоимость. Терапевтические аптамеры химически синтезируют, и, следовательно, их синтез можно легко масштабировать, чтобы удовлетворить потребность в получении. Тогда как трудности масштабного производства в настоящее время ограничивают доступность некоторых биологических средств, и капитальные затраты на крупномасштабное производство белков огромны, один крупномасштабный синтезатор олигонуклеотидов может давать более 100 кг/год и требует относительно скромного начального капиталовложения. Текущие затраты на материалы для синтеза аптамеров в масштабе, измеряемом килограммами, оценивают на уровне $500/г, что сравнимо с затратами на получение высокооптимизированных антител. Предполагают, что продолжающееся совершенствование разработки способа снизит затраты на материалы до <$100/г за пять лет.

5) Стабильность. Терапевтические аптамеры являются химически стойкими. Они в действительности приспособлены к восстановлению активности после воздействия таких факторов, как тепло и денатурирующие агенты, и могут храниться в течение длительных периодов (>1 года) при комнатной температуре в виде лиофилизированных порошков.

Система комплемента

Система комплемента состоит из группы по меньшей мере 20 плазматических и мембранных белков, которые действуют совместно в регулируемой каскадной системе, атакуя внеклеточные формы патогенов (например, бактерию). Система комплемента включает в себя два отдельных ферментативно активируемых каскада, классический и альтернативный пути (фиг.1) и неферментативный путь, известный как формирование мембраноатакующего комплекса.

Первый ферментативно активируемый каскад, известный как классический путь, содержит несколько компонентов C1, C4, C2, C3 и C5 (перечислены в порядке положения в пути). Инициация классического пути системы комплемента происходит после связывания и активации первого компонента комплемента (C1) как иммунными, так и неиммунными активаторами. C1 содержит кальцийзависимый комплекс компонентов C1q, C1r и C1s и активируется при связывании компонента C1q. C1q содержит шесть идентичных субъединиц, и каждая субъединица содержит три цепи (цепи A, B и C). Каждая цепь имеет область глобулярной головки, которая связана с коллагеноподобным хвостом. Связывание и активация C1q комплексами антиген-антитело происходит посредством области головки C1q. Многочисленные не являющиеся антителами активаторы C1q, включая белки, липиды и нуклеиновые кислоты, связывают и активируют C1q через дистальный участок на коллагеноподобной области «ствола». Затем комплекс C1qrs катализирует активацию компонентов комплемента C4 и C2 с образованием комплекса C4bC2a, который функционирует в качестве конвертазы C3.

Второй ферментативно активируемый каскад, известный как альтернативный путь, является быстрым, независимым от антител путем активации и усиления системы комплемента. Альтернативный путь содержит несколько компонентов, C3, фактор B и фактор D (перечислены в порядке положения в пути). Активация альтернативного пути происходит в том случае, когда C3b, форма, образуемая при протеолитическом расщеплении C3, связывается с активирующим поверхностным агентом, таким как бактерия. Фактор B затем связывается с C3b и расщепляется фактором D, давая активный фермент Ba. Фермент Ba затем дополнительно расщепляет C3, создавая дополнительное количество C3b, что приводит к обширному отложению комплексов C3b-Ba на активирующей поверхности.

Таким образом, и классический, и альтернативный пути комплемента продуцируют конвертазы C3, которые расщепляют фактор C3 на C3a и C3b. В этой точке обе конвертазы C3 собираются в конвертазы C5 (C4b2a3b и C3b3bBb). Затем указанные комплексы расщепляют компонент комплемента C5 на два компонента: полипептид C5a (9 кД) и полипептид C5b (170 кД). Полипептид C5a связывается с имеющим 7 трансмембранных фрагментов сопряженным с G-белком рецептором, который первоначально связывали с лейкоцитами и который, как известно в настоящее время, экспрессируется во множестве тканей, включая гепатоциты и нейроны. Молекула C5a является основным хемотаксическим компонентом системы комплемента человека и может запускать множество биологических ответов, включая хемотаксис лейкоцитов, сокращение гладкой мускулатуры, активацию внутриклеточных путей сигнальной трансдукции, адгезию нейтрофилов к эндотелию, высвобождение цитокинов и липидных медиаторов и образование оксидантов.

Более крупный фрагмент C5b связывается последовательно с более дальними компонентами каскада комплемента C6, C7, C8 и C9 с образованием мембраноатакующего комплекса C5b-9 («MAC»). MAC C5b-9 может непосредственно лизировать эритроциты и в больших количествах он является литическим для лейкоцитов и повреждающим для тканей, таких как мышцы, эпителиальные и эндотелиальные клетки. В сублитических количествах MAC может стимулировать повышающую регуляцию молекул адгезии, увеличение внутриклеточного кальция и высвобождение цитокинов. Кроме того, MAC C5b-9 может стимулировать такие клетки, как эндотелиальные клетки и тромбоциты, не вызывая лизиса клеток. Нелитические эффекты C5a и MAC C5b-9 иногда довольно сходны.

Хотя система комплемента играет важную роль в поддержании здоровья, она может вызывать или вносить вклад в заболевание. Например, система комплемента вовлечена в побочные эффекты, имеющие отношение к трансплантационной хирургии по шунтированию коронарных артерий («CABG»), многочисленным почечным, ревматологическим, неврологическим, дерматологическим, гематологическим, сосудистым/легочным, аллергическим, инфекционным и связанным с биосовместимостью/шоком заболеваниям и/или состояниям и диабетической ретинопатии. Система комплемента не обязательно является единственной причиной патологического состояния, но она может быть одним из нескольких факторов, которые вносят вклад в патогенез.

В Fitch et al., Circ. 100: 2499-506 (1999) тестировали действие одноцепочечного фрагмента антитела против C5, пекселизумаба, на пациентов, подвергающихся трансплантационной хирургии по шунтированию коронарных артерий в условиях искусственного кровообращения («CPB»). Отдельным пациентам вводили пекселизумаб в течение 10 минут, одну болюсную дозу непосредственно перед CPB, составляющую 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг. Брали образцы крови и тестировали в отношении активности комплемента перед введением дозы, через 5 мин после введения дозы, через 5 мин при 28°C после начала повторного согревания, через 5 мин при 37°C и вплоть до 7 дней после CPB. Фармакодинамический анализ показал значимое зависимое от дозы ингибирование гемолитической активности комплемента в течение периода времени до 14 часов в дозе 2 мг/кг и образование провоспалительных побочных продуктов комплемента (sC5b-9) эффективно ингибировалось зависимым от дозы образом. Однако, как указано ранее, терапевтические антитела имеют определенные ограничения.

Соответственно, было бы полезно иметь новые ингибиторы системы комплемента для применения в качестве терапевтических и диагностических средств при лечении связанных с комплементом расстройств.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 является иллюстрацией, изображающей классический и альтернативные пути системы комплемента.

Фиг.2 является схематичным представлением способа отбора аптамеров in vitro (SELEX^TM ) из пулов олигонуклеотидов, содержащих случайные последовательности.

Фиг.3A является иллюстрацией, изображающей нуклеотидную последовательность и вторичную структуру анти-C5-аптамера (SEQ ID NO: 1), в которой подчеркнутые остатки являются либо 2'-H-пиримидиновыми остатками, либо 2'-фторпиримидиновыми остатками, заключенные в рамку остатки являются либо 2'-фторпиримидиновыми остатками, либо 2'-OMe-пиримидиновыми остатками, и остатки, указанные стрелкой ( ), представляют собой остатки, которые должны содержать 2'-фтор-модификацию.

Фиг.3B является иллюстрацией, изображающей нуклеотидную последовательность и вторичную структуру анти-C5-аптамера ARC330 (SEQ ID NO: 2), в которой заключенные в кружки остатки являются 2'-H-остатками, остатки пиримидина являются 2'-фтор-замещенными, и большинство остатков пурина являются 2'-OMe-замещенными за исключением трех остатков 2'-OH-пурина, показанных контуром.

Фиг.3C является иллюстрацией, изображающей нуклеотидную последовательность и вторичную структуру анти-C5-аптамера ARC186 (SEQ ID NO: 4), в которой все 21 остаток пиримидина имеют 2'-фтор-модификации, и большинство пуриновых остатков (14 остатков) имеют 2'-OMe-модификации за исключением трех остатков 2'-OH-пурина, показанных контуром.

Фиг.4 является иллюстрацией разветвленного ПЭГ (1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])-пропил-2-(4'-бутамид) с М.м. 40 кД.

Фиг.5 является иллюстрацией разветвленного ПЭГ (1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])-пропил-2-(4'-бутамид) с М.м. 40 кД, связанного с 5'-концом аптамера.

Фиг.6 является иллюстрацией, изображающей различные способы синтеза конъюгатов высокомолекулярный ПЭГ-нуклеиновая кислота.

На фиг.7A показан график, сравнивающий зависимое от дозы ингибирование гемолиза пегилированными анти-C5-аптамерами (ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5)) с ингибированием непегилированным анти-C5-аптамером (ARC186 (SEQ ID NO: 4)); на фиг.7B показана таблица значений IC₅₀ аптамеров, используемых в анализе гемолиза, изображенном на фиг.7A; фиг.7C является графиком, сравнивающим зависимое от дозы ингибирование гемолиза пегилированными анти-C5 аптамерами ARC187 (SEQ ID NO: 5), ARC1537 (SEQ ID NO: 65), ARC1730 (SEQ ID NO: (66) и ARC1905 (SEQ ID NO: 67); на фиг.7D показана таблица значений IC₅₀ аптамеров, используемых в анализе гемолиза, изображенном на фиг.7C.

Фиг.8 является графиком ингибирования гемолиза в процентах анти-C5-аптамером ARC658 (SEQ ID NO: 62) для комплемента сыворотки макак-крабоедов по сравнению с комплементом сыворотки человека.

Фиг.9 является графиком, изображающим связывание ARC186 (SEQ ID NO: 4) с очищенным белком C5 как при 37°C, так и при комнатной температуре (23°C) после 15-минутной инкубации.

На фиг.10 показан другой график, изображающий связывание ARC186 (SEQ ID NO: 4) с очищенным белком C5 как при 37°C, так и при комнатной температуре (23°C) после 4-часовой инкубации.

Фиг.11 является графиком, показывающим временной ход диссоциации комплекса C5 ARC186 при 23°C.

Фиг.12 является графиком, показывающим временной ход установления равновесия при образовании комплекса C5 ARC186 при 23°C.

Фиг.13 является графиком, изображающим связывание ARC186 (SEQ ID NO: 4) с белком C5 по сравнению с белковыми компонентами, расположенными выше и ниже в каскаде комплемента.

Фиг.14 является графиком, изображающим процент радиоактивного ARC186 (SEQ ID NO: 4), который связывает C5 в присутствии немеченого конкурента ARC186 (SEQ ID NO: 4), ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) или ARC187 (SEQ ID NO: 5).

Фиг.15 является графиком, изображающим количество белка комплемента C5b, продуцируемого в образцах крови, инкубированных в течение 5 часов при 25°C и 37°C в присутствии различных концентраций аптамера ARC186 (SEQ ID NO: 4).

Фиг.16 является графиком, изображающим ингибирование комплемента в процентах при действии ARC187 (SEQ ID NO: 5) в присутствии зимозана в неразбавленной сыворотке человека, цитратной цельной крови человека или сыворотке макак-крабоедов.

Фиг.17 является графиком, показывающим, что ARC658 (SEQ ID NO: 62) полностью ингибирует активацию комплемента (C5a) в модели на основе петли из трубки, описанной в примере 1D.

Фиг.18 является графиком, изображающим константы диссоциации для пулов, полученных в 10 раунде отбора C5. Константы диссоциации (K_d) оценивали подгонкой данных к уравнению: фракция связанной РНК = амплитуда *K_d/(K_d + [C5]). «ARC520» (SEQ ID NO: 70) относится к нативному не подвергаемому отбору пулу dRmY, а «+» указывает на наличие конкурирующего вещества (0,1 мг/мл тРНК, 0,1 мг/мл ДНК спермы лосося).

Фиг.19 является графиком, изображающим кривые константы диссоциации клонов C5. Константы диссоциации (K_d) оценивали подгонкой данных к уравнению: фракция связанной РНК = амплитуда*K_d/(K_d + [C5]).

Фиг.20 является графиком, изображающим кривую IC₅₀, который иллюстрирует ингибирующее действие на активность гемолиза различных концентраций анти-C5-аптамера клона ARC913 (SEQ ID NO: 75) по сравнению с ARC186 (SEQ ID NO: 4).

Фиг.21 является иллюстрацией, изображающей структуру ARC187 (SEQ ID NO: 5).

Фиг.22 является иллюстрацией, изображающей структуру ARC1905 (SEQ ID NO: 67).

На фиг.23 показана таблица, в которой изложен дизайн эксперимента при первом исследовании изолированного перфузируемого сердца.

Фиг.24 является графиком сравнения записи давления в отношении внутрижелудочкового давления в левом желудочке (LV) изолированного сердца, на которое воздействовали плазмой человека (A), с записью давления LVP изолированного сердца, на которое воздействовали раствором контрольного аптамера (B).

Фиг.25 является графиком сравнения записи давления в отношении внутрижелудочкового давления в левом желудочке (LV) изолированных сердец, на которые воздействовали молярно эквивалентными 10X и 50X растворами аптамера/C5 (при этом считают, что концентрация C5 в нормальной неразбавленной плазме человека составляет примерно 500 нМ).

Фиг.26 является графиком сравнения изменений частоты сердечных сокращений в ударах в минуту (уд./мин) в изолированных сердцах мышей после воздействия плазмы человека и различных растворов плазма/аптамер.

Фиг.27 является графиком сравнения изменений массы сердца в изолированных сердцах мышей до и после воздействия плазмы человека, содержащей 0-1X молярное соотношение ARC186 (SEQ ID NO: 4) (отказ сердца) или 10-50X молярное соотношение (сердца, защищенные аптамером C5).

Фиг.28 является графиком сравнения относительной продукции C5a в плазме человека, содержащей различные концентрации аптамера, после перфузии изолированных мышиных сердец. Относительные концентрации C5a отложены на графике в виде единиц поглощения (Ab), при этом более высокие значения отражают присутствие более высоких уровней C5a.

Фиг.29 является графиком сравнения относительной продукции растворимого C5b-9 в плазме человека, содержащей различные концентрации аптамера, после перфузии изолированных мышиных сердец.

Фиг.30 является графиком, показывающим влияние ARC186 (SEQ ID NO: 4) на расщепление C3 в экссудате сердца мыши.

На фиг.31 приведена таблица, показывающая результаты иммуногистохимического окрашивания в случае исследования изолированного перфузируемого мышиного сердца.

На фиг.32 приведена таблица, показывающая молярное соотношение ARC658 (SEQ ID NO: 62), необходимое в сыворотке человека или примата для защиты сердца от опосредованного C5b повреждения.

Фиг.33 является графиком, показывающим log-линейный график остаточного количества полноразмерного ARC186 в процентах как функции времени инкубации в плазме крыс и макак-крабоедов.

На фиг.34 представлена таблица, показывающая дизайн эксперимента в случае фармакокинетического исследования, проводимого на крысах Sprague-Dawley, которое описано в примере 5.

На фиг.35 представлена таблица, показывающая среднюю концентрацию в плазме ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) или ARC187 (SEQ ID NO: 5) против времени у крыс Sprague-Dawley.

Фиг.36 является графиком, изображающим среднюю концентрацию в плазме ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) с течением времени после внутривенного введения аптамера крысам.

На фиг.37 представлена таблица, показывающая некамерный анализ концентраций в зависимости от временных данных, изображенных на фиг. 35 и 36.

На фиг.38A приведена таблица, показывающая дизайн фармакокинетического исследования ARC187 (SEQ ID NO: 5) и ARC1905 (SEQ ID NO: 67) у мышей; фиг.38B является графиком, изображающим фармакокинетический профиль ARC187 (SEQ ID NO: 5) и ARC1905 (SEQ ID NO: 67) у мышей CD-1 после однократного болюсного в/в-введения; на фиг.38C приведена таблица, показывающая некамерный анализ концентрации в зависимости от временных данных, изображенных на фиг.38B.

На фиг.39 приведена таблица, показывающая выявление перечисленных аптамеров в ткани сердца мышей после внутривенного введения.

На фиг.40 приведена таблица, показывающая дизайн эксперимента в случае исследования 1 животных, описанного в примере 5E.

На фиг.41 приведена таблица, показывающая концентрацию аптамера в плазме в зависимости от времени после внутривенного болюсного введения аптамера макакам-крабоедам.

На фиг.42 представлена таблица, в которой перечислены фармакокинетические параметры для ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5, вводимых внутривенно макакам-крабоедам в исследовании 1.

Фиг. 43A и 43C являются графиками, изображающими концентрации в плазме sC5b-9 и C5a в зависимости от времени после внутривенного введения анти-C5-аптамеров ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) или ARC187 (SEQ ID NO: 5) макакам-крабоедам; фиг. 43B и 43D являются графиками, изображающими концентрации в плазме sC5b-9 и C5a против концентрации анти-C5-аптамеров ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) или ARC187 (SEQ ID NO: 5).

На фиг.44 представлена таблица, показывающая дизайн эксперимента исследования 2, описанного в примере 5F.

Фиг.45 является графиком, показывающим среднюю концентрацию аптамера в плазме в различных временных точках после внутривенного введения ARC658 (SEQ ID NO: 62) или ARC187 (SEQ ID NO: 5) макакам-крабоедам.

На фиг.46 представлена таблица, показывающая двухкамерный анализ концентрации в зависимости от времени после внутривенного болюсного введения аптамера макакам-крабоедам.

Фиг.47 является графиком, изображающим концентрацию C5b-9 в зависимости от концентрации ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC658 (SEQ ID NO: 62) в присутствии зимозана в плазме макак-крабоедов.

Фиг.48 является графиком, изображающим концентрацию C5a в зависимости от концентрации ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC658 (SEQ ID NO: 62) в присутствии зимозана в плазме макак-крабоедов.

На фиг.49 приведена таблица, в которой суммированы данные исследования ФК-ФД ARC187 (SEQ ID NO: 5) во время и после в/в болюсного плюс инфузионного введения макакам-крабоедам.

На фиг.50 приведена таблица, в которой суммированы фармакокинетические параметры ARC187 (SEQ ID NO: 5) у макак-крабоедов после в/в болюсного введения.

Фиг.51 является графиком, изображающим рассчитанные и фактически измеренные фармакокинетические профили ARC187 (SEQ ID NO: 5) во время и после в/в болюсного плюс инфузионного введения макакам-крабоедам.

Фиг.52 является графиком, показывающим, что уровни в плазме активного ARC187 (SEQ ID NO: 5) остаются постоянными во время и после в/в болюсного плюс инфузионного введения макакам-крабоедам.

На фиг.53 представлена таблица, показывающая рассчитанные потребности человека в дозах анти-C5-аптамеров при CABG-хирургии.

Фиг.54 является графиком, показывающим, что ARC187 (SEQ ID NO: 5) соответственно не влияет in vitro на коагуляцию, которую измеряли по протромбиновому времени (PT) и активированному частичному тромбопластиновому времени (APTT).

На фиг.55 приведена таблица, в которой суммированы эффекты in vitro ARC187 (SEQ ID NO: 5) на антикоагуляционную активность гепарина и прокоагуляционную активность протамина.

Фиг.56 является графиком, показывающим, что ARC187 (SEQ ID NO: 5) не влияет на обратимость антикоагулирующего действия гепарина in vivo.

Фиг.57 является графиком, показывающим, что гепарин и протамин не влияют на функционирование ARC187 (SEQ ID NO: 5), направленное против комплемента, измеряемое по ингибированию активации комплемента зимозаном.

Фиг.58 является графиком, изображающим ингибирование в процентах гемолиза эритроцитов барана в присутствии сыворотки человека как функции концентрации анти-C5-аптамеров ARC1905 (SEQ ID NO: 67) или ARC672 (SEQ ID NO: 63).

Фиг.59A является графиком, изображающим ингибирование гемолиза в процентах в присутствии сыворотки человека, макаки-крабоеда и крысы под действием ARC1905 (SEQ ID NO: 67); на фиг.59B представлена таблица, в которой суммированы средние значения IC₅₀ для ингибирования активации комплемента в сыворотке человека, макаки-крабоеда и крысы под действием ARC1905, анти-C5-аптамера или ARC127, нерелевантного аптамера, который не связывает C5 (негативный контроль).

Фиг.60 является графиком, изображающим значения IC₅₀ для ингибирования радиоактивно меченного ARC186 (SEQ ID NO: 4) (вертикальная ось) как функции концентрации немеченого конкурирующего вещества ARC1905 (SEQ ID NO: 67) или ARC672 (SEQ ID NO: 63) (горизонтальная ось) в анализе конкурентного связывания.

Фиг.61 является графиком, изображающим значение IC₅₀ для ингибирования радиоактивно меченого ARC186 (SEQ ID NO: 4) (вертикальная ось) как функции концентрации немеченого конкурирующего вещества ARC1905 (SEQ ID NO: 67) (горизонтальная ось) при 37°C и 25°C в анализе конкурентного связывания.

Фиг.62 является графиком, изображающим стандартные кривые для C5a человека (hC5a) и C5a макак-крабоедов (эквивалент hC5a).

На фиг.63 представлена таблица, в которой суммированы значения IC₅₀, IC₉₀ и IC₉₉ для ингибирования активации C5 в сыворотке человека и макак-крабоедов под действием ARC1905 (SEQ ID NO: 67), измеренные в анализе индуцированной зимозаном активации комплемента.

Фиг.64 является графиком, на котором изображено ингибирование в процентах образования C5a как функции концентрации ARC1905 (SEQ ID NO: 67) в сыворотке человека и макак-крабоедов, измеряемое в анализе индуцированной зимозаном активации комплемента.

Фиг.65 является графиком, изображающим влияние ARC1905 (SEQ ID NO: 67) на образование C3a в сыворотке человека или макак-крабоедов, измеряемое в анализе индуцированной зимозаном активации комплемента.

На фиг.66 представлена таблица, в которой суммированы средние значения IC₅₀, IC₉₀ и IC₉₉ для ингибирования ARC1905 активации комплемента (SEQ ID NO: 67) в сыворотке человека от 5 доноров, измеренные в модели активации комплемента на основе петли из трубки.

Фиг.67 является графиком, изображающим ингибирование в процентах образования C5a и C3a как функции концентрации ARC1905, анти-C5-аптамера или ARC127, нерелевантного аптамера, который не связывает C5 (негативный контроль) в модели активации комплемента на основе петли из трубки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к веществам и способам лечения, профилактики и улучшения состояния при заболевании, связанном с комплементом. В одном варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую ARC186 (SEQ ID NO: 4), конъюгированный с остатком ПЭГ. В конкретных вариантах такой конъюгат аптамер ARC186/ПЭГ имеет по существу такую же аффинность связывания по отношению к белку комплемента C5, как и аптамер, состоящий из последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4, но в котором отсутствует остаток ПЭГ. По существу такая же аффинность связывания в используемом в данном описании смысле означает наличие не более чем примерно от 2 до десятикратного различия, предпочтительно не более чем от 2 до пятикратного различия констант диссоциации, измеряемых в дот-блот-анализе. В некоторых вариантах константы диссоциации измеряют в конкурентном дот-блот-анализе, который описан в примере 1A ниже. В некоторых вариантах остаток полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, составляющую более 10 кД, в частности молекулярную массу 20 кД, более предпочтительно 30 кД и более предпочтительно 40 кД. В некоторых вариантах остаток ПЭГ конъюгируют с 5'-концом ARC186 (SEQ ID NO:4). В некоторых вариантах конъюгат аптамер/ПЭГ имеет время полужизни, предпочтительно конечное время полужизни в двухкамерной модели, которое определяют способом, описанным в примере 5E ниже, по меньшей мере 15 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов у приматов. В некоторых вариантах конъюгат аптамер/ПЭГ имеет время полужизни, предпочтительно конечное время полужизни в двухкамерной модели, составляющее по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15 часов у крыс. В некоторых вариантах ПЭГ, конъюгированный с 5'-концом ARC186 (SEQ ID NO: 4) представляет собой ПЭГ с М.м. 40 кД. В конкретных вариантах ПЭГ с М.м. 40 кД является разветвленным ПЭГ. В некоторых вариантах разветвленный ПЭГ с М.м. 40 кД представляет собой 1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-2-(4'-бутамид). В других вариантах разветвленный ПЭГ с М.м. 40 кД представляет собой 2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоил.

В вариантах, в которых разветвленный ПЭГ 40 кД представляет собой 1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-2-(4'-бутамид), предлагается аптамер, имеющий структуру, указанную ниже:

где

означает линкер.

Аптамер =

где fC и fU = 2'-фторнуклеотиды, а mG и mA = 2'-OMe-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-OH-нуклеотидами, и 3T означает инвертированный дезокситимидин.

В вариантах, в которых разветвленный ПЭГ 40 кД представляет собой 2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоил, предлагается аптамер, имеющий структуру, указанную ниже:

где

означает линкер.

Аптамер =

где fC и fU = 2'-фторнуклеотиды, а mG и mA = 2'-OMe-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-OH-нуклеотидами, и 3T означает инвертированный дезокситимидин.

В некоторых вариантах данного аспекта изобретения линкер является алкильным линкером. В конкретных вариантах алкильный линкер содержит от 2 до 18 следующих друг за другом CH₂ -групп. В предпочтительных вариантах алкильный линкер содержит от 2 до 12 следующих друг за другом CH₂-групп. В особенно предпочтительных вариантах алкильный линкер содержит от 3 до 6 следующих друг за другом CH₂-групп.

В конкретном варианте предлагается аптамер ARC187 (SEQ ID NO: 5), имеющий структуру, указанную ниже:

где аптамер =

где fC и fU = 2'-фторнуклеотиды, а mG и mA = 2'-OMe-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-OH-нуклеотидами, и 3T означает инвертированный дезокситимидин.

В другом варианте предлагается аптамер ARC1905 (SEQ ID NO:67), имеющий структуру, указанную ниже:

где аптамер =

где fC и fU = 2'-фторнуклеотиды, а mG и mA = 2'-OMe-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-OH-нуклеотидами, и 3T означает инвертированный дезокситимидин.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям. В одном варианте предлагается фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) или их солей. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В данном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество аптамера, который ингибирует расщепление белка комплемента C5 in vivo, или его соли и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В данном аспекте изобретения предлагается фармацевтическая композиция ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) для применения для лечения, профилактики или улучшения состояния при заболевании in vivo. Также в данном аспекте изобретения предлагаются ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) для применения с целью получения фармацевтической композиции.

В другом аспекте согласно изобретению предлагаются способы лечения. В одном варианте способ согласно изобретению заключается в лечении, профилактике или ослаблении заболевания, опосредованного белком комплемента C5 и/или его производными C5a и C5b-9, при этом способ включает в себя введение позвоночному фармацевтической композиции, содержащий ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) или из соль. В некоторых вариантах способ включает в себя введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно изобретению. В некоторых вариантах млекопитающее является человеком.

В некоторых вариантах опосредованным белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболеванием, подвергаемым лечению, являются острые ишемические заболевания (инфаркт миокарда, инсульт, ишемическое/реперфузионное повреждение); острые воспалительные заболевания (инфекционная болезнь, сепсис, шок, острое/гиперострое отторжение трансплантата); хронические воспалительные и/или опосредованные иммунитетом заболевания (аллергия, астма, ревматоидный артрит и другие ревматологические заболевания, рассеянный склероз и другие неврологические болезни, псориаз и другие дерматологические болезни, бульбоспинальный паралич, системная красная волчанка (СКВ), подострое/хроническое отторжение трансплантата, гломерулонефрит и другие почечные болезни). В некоторых вариантах опосредованные белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевания, подвергаемые лечению, включают активацию комплемента, связанную с диализом или ситуациями, при которых кровь пропускают по и/или через синтетическую трубку и/или чужеродный материал. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевание, подвергаемое лечению, выбрано из группы, состоящей из повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, повреждения миокарда, связанного с баллонной ангиопластикой, и повреждения миокарда, связанного с рестенозом. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 расстройство, подвергаемое лечению, выбрано из группы, состоящей из повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, повреждения миокарда, связанного с баллонной ангиопластикой, повреждения миокарда, связанного с рестенозом, опосредованных белком комплемента осложнений, связанных с CABG-хирургией, опосредованных белком комплемента осложнений, связанных с чрескожным вмешательством в коронарные артерии, пароксизмальной ночной гемоглобинурии, острого отторжения трансплантата, гиперострого отторжения трансплантата, подострого отторжения трансплантата и хронического отторжения трансплантата. В некоторых вариантах опосредованным белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболеванием, подвергаемым лечению, являются осложнения, связанные с CABG-хирургией. В конкретном варианте заболеванием, подвергаемым лечению, является повреждение миокарда, связанное с CABG-хирургией.

В некоторых вариантах способ согласно изобретению заключается во введении фармацевтической композиции, содержащий ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, которая примерно в 0,5-10 раз выше концентрации в плазме эндогенного белка комплемента C5. В некоторых вариантах фармацевтические композиции аптамера ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67), вводят так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, которая примерно в 0,75-5 раз, 0,75-3 раза и 1,5-2 раза выше концентрации в плазме эндогенного белка комплемента C5, тогда как в других вариантах композицию аптамера вводят так, чтобы достичь концентрации, эквивалентной концентрации эндогенного белка комплемента. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию согласно изобретению, содержащую ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67), вводят так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, составляющей примерно 5 мкМ, примерно 4 мкМ, примерно 3 мкМ, примерно 2 мкМ, примерно 1,5 мкМ, примерно 1 мкМ или примерно 500 нМ.

Можно использовать любую комбинацию пути, продолжительности и скорости введения, которая достаточна для достижения концентраций аптамеров в плазме согласно изобретению. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию вводят в виде болюса и/или посредством непрерывной инфузии.

В конкретных вариантах лечения, профилактики и/или ослабления осложнений, связанных с CABG-хирургией, в частности повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, способ согласно изобретению включает в себя введение фармацевтической композиции перед хирургией и продолжение введения по меньшей мере 24 часа, в некоторых вариантах примерно 48 часов или в некоторых вариантах примерно 72 часа. В конкретном варианте данного аспекта изобретения концентрацию аптамера в плазме, примерно в два раза более высокую, чем концентрация эндогенного белка комплемента, достигают введением внутривенного болюса, составляющего примерно от 0,75 до 1,25, предпочтительно примерно 1 мг аптамера на кг массы пациента, подвергаемого лечению до, одновременно или после внутривенной инфузии более низкой дозы аптамера, при этом указанная в мг масса не включает массу конъюгированного ПЭГ. В некоторых вариантах более низкую дозу инфузируют со скоростью, выбранной из диапазона от 0,001 до 0,005 мг/кг/мин, при этом указанная в мг масса не включает массу конъюгированного ПЭГ. В конкретном варианте более низкую дозу инфузируют со скоростью, составляющей примерно 0,0013 мг/кг/мин. В следующих вариантах данного аспекта изобретения, в которых аптамер/конъюгат имеет достаточно длительное время полужизни, фармацевтическую композицию аптамера можно вводить один раз или два раза в сутки в виде внутривенной болюсной дозы.

В другом аспекте изобретения предлагаются диагностические способы. В одном варианте диагностический способ заключается в контактировании ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) с композиций, предположительно содержащей белок комплемента C5 или его вариант, и регистрации присутствия или отсутствия белка комплемента C5 или его варианта. В некоторых вариантах белок или вариант белка комплемента является белком позвоночного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека. Настоящее изобретение относится к композиции ARC187 (SEQ ID NO: 5) или ARC1905 (SEQ ID NO: 67) для применения в качестве диагностического средства in vitro или in vivo.

В другом аспекте изобретения предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ARC330 (SEQ ID NO: 2) и ARC188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522- 525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537, ARC1730 (SEQ ID NO: 6 - SEQ NO: 66). В другом варианте предлагается любой из ARC330 (SEQ ID NO: 2) и ARC 188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537, ARC1730 (SEQ ID NO: 6 - SEQ NO: 66) для применения при получении фармацевтической композиции. В данном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащий терапевтически эффективное количество аптамера, которое ингибирует расщепление белка комплемента C5 in vivo, или его соли и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В конкретном варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1. В конкретном варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах, в которых аптамер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, аптамер имеет по существу такую же аффинность связывания по отношению к белку комплемента C5, как и аптамер, состоящий из последовательности согласно SEQ ID NO: 4, но без остатка ПЭГ.

В некоторых вариантах, в которых аптамер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, аптамер имеет время полужизни, предпочтительно конечное время полужизни в двухкамерной модели, которое определяли в примере 5E ниже, составляющее по меньшей мере 15, предпочтительно по меньшей мере 30 часов у приматов. В некоторых вариантах, в которых аптамер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, аптамер имеет время полужизни, предпочтительно конечное время полужизни в двухкамерной модели, составляющее по меньшей мере полтора часа, предпочтительно по меньшей мере семь часов у крыс.

В некоторых вариантах данного аспекта изобретения, в которых аптамер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, аптамер синтезируют с 5'-линкером, как указано далее: , где означает линкер. В некоторых вариантах линкером является алкильный линкер, как указано далее: H₂N-(CH₂ )_n-5'-аптамер-3', где n= от 2 до 18, предпочтительно n=2-12, более предпочтительно n=3-6, более предпочтительно n=6, и где аптамер =

где fC и fU = 2'-фторнуклеотиды, а mG и mA = 2'-OMe-нуклеотиды, и все другие нуклеотиды являются 2'-OH-нуклеотидами, и 3T означает инвертированный дезокситимидин. Полученный в результате аптамер, модифицированный аминогруппой, может быть конъюгирован с остатком ПЭГ, выбранным из группы, состоящей из ПЭГ 10 кД, ПЭГ 20 кД, ПЭГ 30 кД и линейного ПЭГ 40 кД. В некоторых вариантах предлагается фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аптамера, содержащего нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6 - SEQ NO: 66, особенно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, или его соли. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В данном аспекте изобретения предлагается фармацевтическая композиция для применения при лечении, профилактике или ослаблении заболевания in vivo, содержащая аптамер, который содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6 - SEQ NO: 66, особенно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66.

В другом варианте предлагается способ лечения, профилактики или ослабления заболевания, опосредованного белком комплемента C5, включающий в себя введение позвоночному фармацевтической композиции, содержащий аптамер или его соль, в которой аптамер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6 - SEQ NO: 66, особенно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах данного аспекта изобретения способ включает в себя введение фармацевтической композиции согласно изобретению млекопитающему, предпочтительно человеку.

В некоторых вариантах опосредованным белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболеванием, подвергаемым лечению, являются острые ишемические заболевания (инфаркт миокарда, инсульт, ишемическое/реперфузионное повреждение); острые воспалительные заболевания (инфекционная болезнь, сепсис, шок, острое/гиперострое отторжение трансплантата); хронические воспалительные и/или опосредованные иммунной системой заболевания (аллергия, астма, ревматоидный артрит и другие ревматологические заболевания, рассеянный склероз и другие неврологические заболевания, псориаз и другие дерматологические заболевания, бульбоспинальный паралич, системная красная волчанка (СКВ), подострое/хроническое отторжение трансплантата, гломерулонефрит и другие почечные заболевания). В некоторых вариантах опосредованные белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевания, подвергаемые лечению, включают активацию комплемента, связанную с диализом или ситуациями, при которых кровь пропускают по и/или через синтетическую трубку и/или чужеродный материал. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевание, подвергаемое лечению, выбрано из группы, состоящей из повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, повреждения миокарда, связанного с баллонной ангиопластикой, и повреждения миокарда, связанного с рестенозом. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 расстройство, подвергаемое лечению, выбрано из группы, состоящей из повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, повреждения миокарда, связанного с баллонной ангиопластикой, повреждения миокарда, связанного с рестенозом, опосредованных белком комплемента осложнений, связанных с CABG-хирургией, опосредованных белком комплемента осложнений, связанных с чрескожным вмешательством в коронарные артерии, пароксизмальной ночной гемоглобинурии, острого отторжения трансплантата, гиперострого отторжения трансплантата, подострого отторжения трансплантата и хронического отторжения трансплантата. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевание, подвергаемое лечению, представляет собой осложнения, связанные с CABG-хирургией. В конкретном варианте заболеванием, подвергаемым лечению, является повреждение миокарда, связанное с CABG-хирургией.

В некоторых вариантах способ согласно изобретению заключается во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей аптамер, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6-66, особенно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, так чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, которая примерно в 0,5-10 раз выше концентрации в плазме эндогенного белка комплемента C5. В некоторых вариантах фармацевтические композиции аптамера вводят так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, которая примерно в 0,75-5 раз, 0,75-3 раза и 1,5-2 раза выше концентрации в плазме эндогенного белка комплемента C5, тогда как в других вариантах композицию аптамера вводят так, чтобы достичь концентрации, эквивалентной концентрации эндогенного белка комплемента. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, составляющей примерно 5 мкМ, примерно 4 мкМ, примерно 3 мкМ, примерно 2 мкМ, примерно 1,5 мкМ, примерно 1 мкМ или примерно 500 нМ.

Можно использовать любую комбинацию пути, продолжительности и скорости введения, которая достаточна для достижения концентраций аптамеров в плазме согласно изобретению. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию вводят в виде болюса и/или посредством непрерывной инфузии.

В конкретных вариантах лечения, профилактики и/или ослабления осложнений, связанных с CABG-хирургией, в частности повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, способ согласно изобретению включает в себя введение фармацевтической композиции перед хирургией и продолжение введения по меньшей мере 24 часа, в некоторых вариантах примерно 48 часов или в некоторых вариантах примерно 72 часа. В конкретном варианте данного аспекта изобретения требуемую концентрацию аптамера в плазме, например, в два раза более высокую, чем концентрация эндогенного белка комплемента, достигают введением пациенту, подвергаемому лечению, внутривенного болюса до, одновременно или после внутривенной инфузии более низкой дозы аптамера. В следующих вариантах данного аспекта изобретения, в которых аптамер/конъюгат имеет достаточно длительное время полужизни, фармацевтическую композицию аптамера можно вводить один раз или два раза в сутки в виде внутривенной болюсной дозы.

В другом аспекте изобретения предлагаются диагностические способы. В одном варианте диагностический способ заключается в контактировании композиции, предположительно содержащей белок комплемента C5 или его вариант, с аптамером, содержащим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6-66, особенно из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 66, и регистрации присутствия или отсутствия белка комплемента C5 или его варианта. В некоторых вариантах белок или вариант белка комплемента является белком позвоночного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека. Настоящее изобретение относится к композиции аптамера, содержащей аптамер, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6-66, для применения в качестве диагностического средства in vitro или in vivo. В настоящем изобретении предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 6 - SEQ NO 66, для применения при получении фармацевтической композиции.

В другом аспекте изобретения предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая на 80% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98. В некоторых вариантах предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая на 80% идентична уникальной области любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81 и SEQ ID NO: 88-98. В другом варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая на 90% идентична любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98. В конкретном варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая на 90% идентична уникальной области любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81 и SEQ ID NO: 88-98. В еще одном варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность из 40 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, идентичных 40 непрерывно следующим друг за другом нуклеотидам, входящим в любую из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81 и SEQ ID NO: 88-98. В другом варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность из 30 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, идентичных 30 непрерывно следующим друг за другом нуклеотидам, входящим в любую из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98. В еще одном варианте предлагается аптамер, который специфично связывается с белком комплемента C5, содержащий нуклеотидную последовательность из 10 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, идентичных 10 непрерывно следующим друг за другом нуклеотидам, входящим в любую из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98. В предпочтительном варианте предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность согласно любой из нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98.

В некоторых вариантах аптамеры согласно данному аспекту изобретения, описанные непосредственно выше, могут дополнительно содержать химическую модификацию, выбранную из группы, состоящей из химического замещения в положении сахара; химического замещения в положении фосфата и химического замещения в положении основания последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах модификация выбрана из группы, состоящей из включения модифицированного нуклеотида; 3'-кэпирования, конъюгации с высокомолекулярным неиммуногенным соединением; конъюгации с липофильным соединением и модификации фосфатного остова.

В предпочтительных вариантах данного аспекта изобретения аптамер модулирует функцию белка комплемента C5 или его варианта. В особенно предпочтительных вариантах аптамер ингибирует функцию белка комплемента C5 или его варианта, предпочтительно in vivo, более предпочтительно in vivo у человека. В одном варианте данного аспекта изобретения функцией, модулируемой, предпочтительно ингибируемой аптамером, является расщепление белка комплемента C5.

В некоторых вариантах другого аспекта изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащий терапевтически эффективное количество аптамера, которое блокирует расщепление белка комплемента C5 in vivo, или его соли и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах предлагается фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аптамера, содержащего нуклеотидную последовательность, на 80% идентичную, предпочтительно на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98, или его соли. В некоторых вариантах предлагается фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аптамера, содержащего нуклеотидную последовательность, на 80% идентичную, предпочтительно на 90% идентичную уникальной области нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98, или его соли. В других вариантах предлагается фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество аптамера, имеющего 40, 30 или 10 непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов, идентичных 40, 30 или 10 нуклеотидам, соответственно, нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В данном аспекте изобретения предлагается фармацевтическая композиция для применения при лечении, профилактике или ослаблении заболевания in vivo, при этом фармацевтическая композиция содержит аптамер, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-4, SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98, или его соль. В данном аспекте предлагается аптамер, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-4, SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98, для применения в приготовлении фармацевтической композиции. В данном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество аптамера, который ингибирует расщепление белка комплемента C5 in vivo, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах опосредованным белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболеванием, подвергаемым лечению, являются острые ишемические заболевания (инфаркт миокарда, инсульт, ишемическое/реперфузионное повреждение); острые воспалительные заболевания (инфекционная болезнь, сепсис, шок, острое/гиперострое отторжение трансплантата); хронические воспалительные и/или опосредованные иммунной системой заболевания (аллергия, астма, ревматоидный артрит и другие ревматологические заболевания, рассеянный склероз и другие неврологические заболевания, псориаз и другие дерматологические заболевания, бульбоспинальный паралич, системная красная волчанка (СКВ), подострое/хроническое отторжения трансплантата, гломерулонефрит и другие почечные заболевания). В некоторых вариантах опосредованные белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевания, подвергаемые лечению, включают активацию комплемента, связанную с диализом или ситуациями, при которых кровь пропускают по и/или через синтетическую трубку и/или чужеродный материал. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевание, подвергаемое лечению, выбрано из группы, состоящей из повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, повреждения миокарда, связанного с баллонной ангиопластикой, и повреждения миокарда, связанного с рестенозом. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 расстройство, подвергаемое лечению, выбрано из группы, состоящей из повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, повреждения миокарда, связанного с баллонной ангиопластикой, повреждения миокарда, связанного с рестенозом, опосредованных белком комплемента осложнений, связанных с CABG-хирургией, опосредованных белком комплемента осложнений, связанных с чрескожным вмешательством в коронарные артерии, пароксизмальной ночной гемоглобинурии, острого отторжения трансплантата, гиперострого отторжения трансплантата, подострого отторжения трансплантата и хронического отторжения трансплантата. В некоторых вариантах опосредованное белком комплемента C5, C5a и/или C5b-9 заболевание, подвергаемое лечению, представляет собой осложнения, связанные с CABG-хирургией. В конкретном варианте заболеванием, подвергаемым лечению, является повреждение миокарда, связанное с CABG-хирургией.

В некоторых вариантах способ согласно изобретению заключается во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей аптамер, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-4, SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98 так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, которая примерно в 0,5-10 раз выше концентрации в плазме эндогенного белка комплемента C5. В некоторых вариантах фармацевтические композиции аптамера вводят так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, которая примерно в 0,75-5 раз, 0,75-3 раза и 1,5-2 раза выше концентрации в плазме эндогенного белка комплемента C5, тогда как в других вариантах композицию аптамера вводят так, чтобы достичь концентрации, эквивалентной концентрации эндогенного белка комплемента. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят так, чтобы достичь концентрации аптамера в плазме, составляющей примерно 5 мкМ, примерно 4 мкМ, примерно 3 мкМ, примерно 2 мкМ, примерно 1,5 мкМ, примерно 1 мкМ или примерно 500 нМ.

Можно использовать любую комбинацию пути, продолжительности и скорости введения, которая достаточна для достижения концентраций аптамеров в плазме согласно изобретению. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах фармацевтическую композицию вводят в виде болюса и/или посредством непрерывной инфузии.

В конкретных вариантах лечения, профилактики и/или ослабления осложнений, связанных с CABG-хирургией, в частности повреждения миокарда, связанного с CABG-хирургией, способ согласно изобретению включает в себя введение фармацевтической композиции перед хирургией и продолжение введения по меньшей мере 24 часа, в некоторых вариантах примерно 48 часов или в некоторых вариантах примерно 72 часа. В конкретном варианте данного аспекта изобретения требуемую концентрацию аптамера в плазме, например, в два раза более высокую, чем концентрация эндогенного белка комплемента, достигают введением пациенту, подвергаемому лечению, внутривенного болюса до, одновременно или после внутривенной инфузии более низкой дозы аптамера. В следующих вариантах данного аспекта изобретения, в которых аптамер/конъюгат имеет достаточное длительное время полужизни, фармацевтическую композицию аптамера можно вводить один раз или два раза в сутки в виде внутривенной болюсной дозы.

В другом варианте предлагается диагностический способ, при этом способ заключается в контактировании композиции, предположительно содержащей белок комплемента C5 или его вариант, с аптамером, содержащим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98, и регистрации присутствия или отсутствия белка комплемента C5 или его варианта. В некоторых вариантах белок или вариант белка комплемента является белком позвоночного, предпочтительно млекопитающего и более предпочтительно человека. Настоящее изобретение относится к композиции аптамера, содержащей аптамер, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-81, SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 88-98 для применения в качестве диагностического средства in vitro или in vivo.

В некоторых вариантах предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, по существу состоящую из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 68 и 69. В некоторых вариантах предлагается аптамер, содержащий нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 68 и 69. В некоторых вариантах данного аспекта изобретения аптамеры могут быть использованы в диагностическом способе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления изобретения приведены в сопутствующем описании ниже. Несмотря на то, что на практике или при тестировании настоящего изобретения могут быть применены любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, приведенным в данном описании, описаны предпочтительные способы и материалы. Другие отличительные признаки, цели и преимущества изобретения будут понятны из описания. В описании формы единственного числа также включают множественное число, если контекст явно не диктует иное. Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в данной области, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта настоящее изобретение будет проверено.

Способ SELEX^TM

Подходящим способом создания аптамера является способ, названный «Систематическая эволюция лигандов при экспоненциальном обогащении» («SELEX^TM»), в общем изображенный на фиг.2. Способ SELEX^TM является способом эволюции in vitro молекул нуклеиновой кислоты с высокоспецифичным связыванием с молекулами-мишенями, и способ описан, например, в заявке на выдачу патента США с регистрационным No. 07/536428, поданной 11 января 1990, в настоящее время отпавшей, в патенте США No. 5475096, озаглавленном «Nucleic Acid Ligands», и в патенте США No. 5270163 (см. также WO 91/19813), озаглавленном «Nucleic Acids Ligands». Каждый идентифицированный в SELEX^TM лиганд в виде нуклеиновой кислоты, т.е. каждый аптамер, является специфичным лигандом данного соединения или молекулы-мишени. Способ SELEX^TM основан на специфичном представлении о том, что нуклеиновые кислоты обладают достаточной способностью образовывать множество двухмерных и трехмерных структур и достаточной химической изменчивостью своих мономеров, чтобы действовать в качестве лигандов (т.е. образовывать специфичные связывающиеся пары) фактически любого химического соединения, либо мономерного, либо полимерного. В качестве мишеней могут служить молекулы любого размера или состава.

SELEX^TM основан в качестве исходной точки на большой библиотеке или пуле однонитевых олигонуклеотидов, содержащем рандомизированные последовательности. Олигонуклеотиды могут представлять собой модифицированную или немодифицированную ДНК, РНК или гибриды ДНК/РНК. В некоторых примерах пул содержит 100% случайных или частично случайных олигонуклеотидов. В других примерах пул содержит случайные или частично случайные олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну фиксированную и/или консервативную последовательность, включенную в рандомизированную последовательность. В других примерах пул содержит случайные или частично случайные олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну фиксированную и/или консервативную последовательность на своем 5'- и/или 3'-конце, которая может содержать последовательность, общую для всех молекул олигонуклеотидного пула. Фиксированные последовательности представляют собой такие последовательности, как сайты гибридизации для ПЦР-праймеров, последовательности промоторов для РНК-полимераз (например, T3, T4, T7 и SP6), сайты рестрикции или гомополимерные последовательности, такие как участки поли-A или поли-T, каталитические центры, сайты для избирательного связывания с аффинными колонками и другие последовательности для облегчения клонирования и/или секвенирования представляющего интерес олигонуклеотида. Консервативные последовательности представляют собой другие последовательности, отличные от описанных ранее фиксированных последовательностей, общие для ряда аптамеров, которые связываются с одной и той же мишенью.

Олигонуклеотиды пула предпочтительно включают рандомизированную часть последовательности, а также фиксированные последовательности, необходимые для эффективной амплификации. Обычно олигонуклеотиды исходного пула содержат фиксированные 5'- и 3'-концевые последовательности, которые фланкируют внутреннюю область из 30-50 случайных нуклеотидов. Рандомизированные нуклеотиды могут быть получены несколькими способами, включая химический синтез и отбор по размеру из случайно расщепленных клеточных нуклеиновых кислот. Изменчивость последовательностей в тестируемых нуклеиновых кислотах также можно ввести или увеличить с помощью мутагенеза до или во время циклов селекции/амплификации.

Случайная часть последовательности олигонуклеотида может иметь любую длину и может содержать рибонуклеотиды и/или дезоксирибонуклеотиды, и может включать модифицированные или неприродные нуклеотиды или аналоги нуклеотидов. См., например, патент США No. 5958691, патент США No. 5660985, патент США No. 5958691, патент США No. 5698687, патент США No. 5817635, патент США No. 5672695 и публикацию PCT WO 92/07065. Случайные олигонуклеотиды могут быть синтезированы из связываемых фосфодиэфирной связью нуклеотидов с использованием методики твердофазного синтеза олигонуклеотидов, хорошо известной в данной области. См., например, Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467 (1986) и Froehler et al., Tet. Lett. 27: 5575-5578 (1986). Случайные олигонуклеотиды также могут быть синтезированы с использованием способов синтеза в растворах, таких как способы синтеза триэфиров. См., например, Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557 (1977) и Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449 (1978). Типичный синтез, осуществляемый на автоматизированном оборудовании для синтеза ДНК, дает 10¹⁴-10¹⁶ отдельных молекул, количество, достаточное для большинства экспериментов SELEX^TM. Достаточно большие области случайной последовательности в конструкции последовательности увеличивают вероятность того, что каждая синтезированная молекула, вероятно, представляет собой уникальную последовательность.

Исходная библиотека олигонуклеотидов может быть создана посредством автоматизированного химического синтеза в синтезаторе ДНК. Чтобы синтезировать рандомизированные последовательности, смеси всех четырех нуклеотидов добавляют на каждой стадии добавления нуклеотидов во время процесса синтеза, обеспечивая случайное включение нуклеотидов. Как указано выше, в одном варианте случайные олигонуклеотиды содержат полностью случайные последовательности; однако в других вариантах случайные олигонуклеотиды могут содержать участки неслучайных или частично случайных последовательностей. Частично случайные последовательности могут быть созданы добавлением четырех нуклеотидов в разных молярных соотношениях на каждой стадии добавления.

Исходная библиотека олигонуклеотидов может представлять собой библиотеку РНК или ДНК. В тех случаях, когда необходимо использовать библиотеку РНК в качестве исходной библиотеки, ее обычно создают транскрибированием библиотеки ДНК in vitro с использованием РНК-полимеразы T7 или модифицированной РНК-полимеразы T7 и очищают. Затем библиотеку РНК или ДНК смешивают с мишенью в условиях, благоприятных для связывания, и подвергают поэтапному повторению связывания, разделения и амплификации, используя одну и ту же общую схему отбора, чтобы достичь фактически любого требуемого критерия аффинности и избирательности связывания. Более конкретно, начиная со смеси, содержащей исходный пул нуклеиновых кислот, способ SELEX^TM включает в себя стадии: (a) контактирование смеси с мишенью в условиях, благоприятных для связывания; (b) отделения несвязанных нуклеиновых кислот от тех нуклеиновых кислот, которые специфично связались с молекулами мишени; (c) диссоциации комплексов нуклеиновая кислота-мишень; (d) амплификации нуклеиновых кислот, диссоциированных из комплексов нуклеиновая кислота-мишень с получением обогащенной лигандом смеси нуклеиновых кислот; и (e) повторения стадий связывания, отделения, диссоциации и амплификации на протяжении такого количества циклов, которое требуется для получения высокоспецифичных, высокоаффинных лигандов в виде нуклеиновых кислот для молекул-мишеней. В тех случаях, когда отбирают РНК-аптамеры, способ SELEX^TM дополнительно включает в себя стадии: (i) обратной транскрипции нуклеиновых кислот, диссоциированных из комплексов нуклеиновая кислота-мишень, перед амплификацией на стадии (d); и (ii) транскрибирования амплифицированных нуклеиновых кислот со стадии (d) перед повторением процесса.

В смеси нуклеиновых кислот, содержащей большое количество возможных последовательностей и структур, имеет место широкий диапазон аффинностей связывания по отношению к данной мишени. Смесь нуклеиновых кислот, содержащих, например, 20-нуклеотидный рандомизированный участок, может иметь 4 ²⁰ возможных кандидата для исследования. Кандидаты, которые имеют более высокие константы аффинности по отношению к мишени, наиболее вероятно связываются с мишенью. После отделения, диссоциации и амплификации создают вторую смесь нуклеиновых кислот, обогащенную кандидатами с более высокой аффинностью связывания. Дополнительные раунды селекции постепенно отдают предпочтение наилучшим лигандам вплоть до того, как получаемая в результате смесь нуклеиновых кислот становится преимущественно состоящей только из одной или нескольких последовательностей. Полученные последовательности затем могут быть клонированы, секвенированы и отдельно тестированы в отношении аффинности связывания в виде чистых лигандов или аптамеров.

Циклы селекции и амплификации повторяют вплоть до достижения требуемой цели. В наиболее общем случае селекцию/амплификацию продолжают вплоть до достижения значительного повышения прочности связывания при повторении цикла. Способ обычно используют по отношению к образцу, состоящему примерно из 10 ¹⁴ разных видов нуклеиновых кислот, но могут использовать по отношению к образцу, содержащему примерно 10¹⁸ разных видов нуклеиновых кислот. Обычно молекулы аптамеров нуклеиновых кислот отбирают в 5-20 циклах. В одном варианте гетерогенность вводится только на начальных стадиях селекции и не возникает на протяжении процесса повторения.

В одном варианте SELEX^TM процесс селекции является настолько эффективным при выделении таких нуклеиновых кислот-лигандов, которые наиболее сильно связываются с выбранной мишенью, что требуется только один цикл селекции и амплификации. Такую эффективную селекцию можно осуществлять, например, в способе типа хроматографии, при котором способность нуклеиновых кислот связываться с мишенями, связанными с колонкой, используется таким образом, что колонка способна в достаточной мере обеспечить разделение и выделение нуклеиновых кислот-лигандов с наибольшей аффинностью.

Во многих случаях не обязательно требуется осуществлять повторяющиеся стадии SELEX^TM вплоть до идентификации одной нуклеиновой кислоты-лиганда. Раствор специфичных для мишени нуклеиновых кислот-лигандов может содержать семейство структур или мотивов нуклеиновых кислот, которые имеют ряд консервативных последовательностей и ряд последовательностей, которые могут быть заменены или добавлены без существенного влияния на аффинность нуклеиновых кислот-лигандов для мишени. В конце процесса SELEX^TM перед завершением можно определить последовательность нескольких представителей семейства нуклеиновых кислот-лигандов в растворе.

Известно, что существует несколько первичных, вторичных и третичных структур нуклеиновых кислот. Структуры или мотивы, которые, как было показано, чаще всего вовлечены во взаимодействия, отличные от взаимодействий Уотсона-Крика, называют петлями в виде шпилек, симметричными и ассиметричными петлями, псевдоузлами и их бесчисленными комбинациями. Почти все известные случаи таких мотивов свидетельствуют о том, что они могут быть образованы в последовательности нуклеиновой кислоты, состоящей не более чем из 30 нуклеотидов. По этой причине часто предпочтительно начинать процессы SELEX^TM непрерывных рандомизированных участков с последовательностями нуклеиновых кислот, содержащими рандомизированный участок, имеющий примерно от 20 до примерно 50 нуклеотидов, и в некоторых вариантах примерно от 30 до примерно 40 нуклеотидов. В одном примере 5'-фиксированная:случайная:3'-фиксированная последовательность содержит случайную последовательность, имеющую примерно от 30 до примерно 50 нуклеотидов.

Основной способ SELEX^TM был модифицирован так, чтобы добиться ряда конкретных целей. Например, в патенте США No. 5707796 описано применение SELEX^TM вместе с гель-электрофорезом для того, чтобы отобрать молекулы нуклеиновых кислот со специфичными структурными характеристиками, такими как изогнутая ДНК. В патенте США No. 5763177 описаны основанные на SELEX^TM способы селекции нуклеиновых кислот-лигандов, содержащих фотореактивные группы, способные к связыванию и/или фотосшиванию с молекулой-мишенью и/или к фотоинактивации молекулы-мишени. В патенте США No. 5567588 и патенте США No. 5861254 описаны основанные на SELEX^TM способы, в которых достигают высокоэффективного разделения олигонуклеотидов, имеющих высокую и низкую аффинность по отношению к молекуле-мишени. В патенте США No. 5496938 описаны способы получения улучшенных нуклеиновых кислот-лигандов после осуществления способа SELEX ^TM. В патенте США No. 5705337 описаны способы ковалентного связывания лиганда с его мишенью.

SELEX^TM также можно использовать для получения нуклеиновых кислот-лигандов, которые связываются с более чем одним сайтом на молекуле-мишени и для получения нуклеиновых кислот-лигандов, которые содержат отличные от нуклеиновых кислот виды молекул, которые связываются со специфичными сайтами на мишени. SELEX^TM обеспечивает способ выделения и идентификации нуклеиновых кислот-лигандов, которые связываются с любой мишенью, которую можно себе представить, включая крупные и небольшие биологические молекулы, такие как белки, связывающие нуклеиновые кислоты, и белки, о которых не известно, что они связывают нуклеиновые кислоты в виде части своей биологической функции, а также кофакторы и другие малые молекулы. Например, в патенте США No. 5580737 описаны последовательности нуклеиновой кислоты, идентифицированные с помощью SELEX^TM , которые способны связываться с высокой аффинностью с кофеином и близкородственным аналогом, теофиллином.

Counter-SELEX ^TM представляет собой способ повышения специфичности нуклеиновых кислот-лигандов по отношению к молекуле-мишени посредством исключения последовательностей нуклеиновых кислот-лигандов с перекрестной реактивностью к одной или нескольким молекулам, не являющимся мишенью. Counter-SELEX^TM состоит из стадий: (a) приготовления смеси нуклеиновых кислот, выбранных для исследования; (b) контактирования смеси кандидатов с мишенью, при этом нуклеиновые кислоты, обладающие повышенной аффинностью в отношении мишени по сравнению со смесью кандидатов, могут быть отделены от остальной части смеси кандидатов; (c) отделения нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной части смеси кандидатов; (d) диссоциации нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью из комплекса с мишенью; e) контактирования нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью с одной или несколькими молекулами, не являющимися мишенью, для того чтобы удалить нуклеиновые кислоты-лиганды со специфичной аффинностью по отношению к молекуле(лам), не являющейся мишенью; и f) амплификации нуклеиновых кислот со специфичной аффинностью только к молекуле-мишени, чтобы получить смесь нуклеиновых кислот, обогащенную последовательностями нуклеиновой кислоты с относительно более высокой аффинностью и специфичностью в отношении связывания с молекулой-мишенью. Как описано выше в отношении SELEX^TM, циклы селекции и амплификации при необходимости повторяют вплоть до достижения требуемой цели.

Одной возможной проблемой, с которой сталкиваются при использовании нуклеиновых кислот в качестве терапевтических средств и вакцин, является тот факт, что олигонуклеотиды в своей фосфодиэфирной форме могут быстро разрушаться в жидкостях организма внутриклеточными и внеклеточными ферментами, такими как эндонуклеазы и экзонуклеазы, до проявления требуемого эффекта. Соответственно, способ SELEX^TM включает в себя идентификацию высокоаффинных нуклеиновых кислот-лигандов, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие улучшенные свойства лиганду, такие как повышенная стабильность in vivo или улучшенные параметры доставки. Примеры таких модификаций включают химические замещения в положениях рибозы, и/или фосфата, и/или основания.

Идентифицированные с помощью SELEX^TM нуклеиновые кислоты-лиганды, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны, например, в патенте США No. 5660985, в котором описаны олигонуклеотиды, содержащие производные нуклеотидов, химически модифицированные в 2'-положении рибозы, в положении 5 пиримидинов и в положении 8 пуринов, в патенте США No. 5756703, где описаны олигонуклеотиды, содержащие различные 2'-модифицированные пиримидины, и в патенте США No. 5580737, в котором описаны высокоспецифичные нуклеиновые кислоты-лиганды, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных заместителями: 2'-аминогруппой (2'-NH ₂), 2'-фтором (2'-F) и/или 2'-OMe (2'-OMe).

Модификации нуклеиновых кислот-лигандов, входящих в объем настоящего изобретения, включают без ограничения модификации, которые обеспечивают другие химические группы, которые придают дополнительный заряд, способность к поляризации, гидрофобность, способность к образованию водородных связей, к электростатическому взаимодействию и гибкость основаниям нуклеиновой кислоты-лиганда или нуклеиновой кислоте-лиганду в целом. Модификации для создания популяций олигонуклеотидов, которые резистентны к нуклеазам, также могут включать одну или несколько заменяющих межнуклеотидных связей, измененные сахара, измененные основания или их комбинации. Такие модификации включают без ограничения модификации в 2'-положении сахара, модификации в положении 5 пиримидина, модификации в положении 8 пурина, модификации в экзоциклических аминах, замещение 4-тиоуридина, замещение 5-бром- или 5-иод-урацила; модификации остова, фосфоротиоатные или алкилфосфатные модификации, метилирование и необычные комбинации при спаривании оснований, такие как изооснования изоцитидин и изогуанидин. Модификации также могут включать 3'- и 5'-модификации, такие как кэпирование.

В одном варианте предлагаются олигонуклеотиды, в которых группа P(O)O заменена P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), P(O)NR₂ («амидат»), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ («формацеталь») или 3'-амин (-NH-CH₂-CH₂-), где каждый R или R' независимо означает H или замещенный или незамещенный алкил. Связывающие группы могут быть связаны с соседними нуклеотидами посредством связи -O-, -N- или -S-. Не требуется, чтобы все связи в олигонуклеотидах были идентичными. В используемом в данном описании смысле термин фосфоротиоат включает замену одного или нескольких не образующих мостик атомов кислорода в фосфодиэфирной связи одним или несколькими атомами серы.

В следующих вариантах олигонуклеотиды содержат модифицированные группы сахаров, например, одну или несколько гидроксильных групп заменяют галогеном, алифатическими группами или функционализируют в виде эфиров или аминов. В одном варианте 2'-положение остатка фуранозы замещают любой из групп OMe, O-алкилом, O-аллилом, S-алкилом, S-аллилом или галогеном. Способы синтеза 2'-модифицированных сахаров описаны, например, в Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19: 733-738 (1991); Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19: 2629-2635 (1991) и Hobbs, et al., Biochemistry 12: 5138-5145 (1973). Другие модификации известны специалисту в данной области. Такие модификации могут представлять собой модификации, полученные до процесса SELEX ^TM, или модификации, полученные после процесса SELEX ^TM (модификация предварительно идентифицированных немодифицированных лигандов), или могут быть получены в процессе SELEX.

Модификации, получаемые перед процессом SELEX, и модификации, получаемые в процессе SELEX, дают нуклеиновые кислоты-лиганды, обладающие как специфичностью в отношении их мишени SELEX ^TM, так и повышенной стабильностью, например стабильностью in vivo. Модификации, полученные после процесса SELEX^TM , в нуклеиновых кислотах-лигандах могут приводить к повышенной стабильности, например стабильности in vivo без неблагоприятного влияния на способность нуклеиновой кислоты-лиганда к связыванию.

Способ SELEX^TM охватывает комбинирование отобранных олигонуклеотидов с другими отобранными олигонуклеотидами и неолигонуклеотидными функциональными единицами, как описано в патенте США No. 5637459 и патенте США No. 5683867. Способ SELEX ^TM, кроме того, охватывает комбинирование отобранных нуклеиновых кислот-лигандов с липофильными или неиммуногенными высокомолекулярными соединениями в виде диагностического или терапевтического комплекса, как описано, например, в патенте США No. 6011020, патенте США No. 6051698 и публикации PCT No. WO 98/18480. Указанные патенты и заявки содержат инструкции относительно комбинирования широкого ряда форм и других свойств со свойствами олигонуклеотидов, обеспечивающими эффективную амплификацию и репликацию, и с требуемыми свойствами других молекул.

Также проведена идентификация нуклеиновых кислот-лигандов к небольшим гибким пептидам с использованием способа SELEX^TM. Небольшие пептиды имеют гибкие структуры и обычно существуют в растворе в виде множества конформеров, находящихся в равновесии, и, соответственно, сначала считали, что аффинности связывания могут быть ограничены потерей конформационной энтропии при связывании гибкого пептида. Однако возможность идентификации нуклеиновых кислот-лигандов к небольшим пептидам в растворе была показана в патенте США No. 5648214. В указанном патенте идентифицировали высокоаффинные нуклеиновые кислоты-лиганды в виде РНК к веществу P, 11-аминокислотному пептиду.

Аптамеры, обладающие специфичностью и аффинностью связывания по отношению к мишени(ям), согласно изобретению обычно отбирают способом SELEX^TM , который описан в данной публикации. В качестве части способа SELEX^TM отобранные последовательности, которые связываются с мишенью, затем необязательно минимизируют, чтобы определить минимальную последовательность, имеющую требуемую аффинность связывания. Отобранные последовательности и/или минимизированные последовательности необязательно оптимизируют, осуществляя случайный или направленный мутагенез последовательности, чтобы увеличить аффинность связывания, или альтернативно, чтобы определить, какие положения в последовательности важны для активности связывания. Дополнительно селекцию можно осуществить, используя последовательности, содержащие модифицированные нуклеотиды, чтобы стабилизировать молекулы аптамеров от разрушения in vivo.

2'-модифицированный SELEX^TM

Для того чтобы аптамер был подходящим для применения в качестве терапевтического средства, он предпочтительно является недорогим, с точки зрения синтеза, безопасным и стабильным in vivo. РНК- и ДНК-аптамеры дикого типа обычно являются нестабильными in vivo вследствие их чувствительности к разрушению нуклеазами. Резистентность к разрушению нуклеазами может быть в значительной степени увеличена включением модифицирующих групп в 2'-положении.

Фтор и аминогруппы успешно включали в олигонуклеотидные библиотеки, из которых затем были отобраны аптамеры. Однако такие модификации значительно увеличивают затраты на синтез полученного в результате аптамера и в некоторых случаях могут вносить проблемы с безопасностью вследствие вероятности того, что модифицированные нуклеотиды могут быть повторно использованы в ДНК хозяина при разрушении модифицированных олигонуклеотидов и последующем использовании нуклеотидов в качестве субстратов для синтеза ДНК.

Аптамеры, которые содержат 2'-OMe-нуклеотиды («2'-OMe»), которые предлагаются в некоторых вариантах настоящего изобретения, преодолевают многие из указанных недостатков. Олигонуклеотиды, содержащие 2'-OMe-нуклеотиды, резистентны к нуклеазам и их синтез не является дорогим. Хотя 2'-OMe-нуклеотиды распространены в биологических системах, природные полимеразы не воспринимают 2'-O-метил-NTP в качестве субстратов в физиологических условиях, соответственно, не существует проблем, касающихся опасности повторного использования 2'-OMe-нуклеотидов в ДНК хозяина. Способ SELEX ^TM, используемый для создания 2'-модифицированных аптамеров, описан, например, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным No. 60/430761, поданной 3 декабря 2002, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным No. 60/487474, поданной 15 июля 2003, в предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным No. 60/517039, поданной 4 ноября 2003, в заявке на выдачу патента США No. 10/729581, поданной 3 декабря 2003, и в заявке на выдачу патента США No. 10/873856, поданной 21 июня 2004, озаглавленной «Method for in vitro Selection of 2'-OMe Substituted Nucleic Acids», каждая из которых включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к аптамерам, которые связываются и модулируют функцию белка комплемента C5, которые содержат модифицированные нуклеотиды (например, нуклеотиды, которые имеют модификацию в 2'-положении), чтобы сделать олигонуклеотиды более стабильными, чем немодифицированные олигонуклеотиды, к ферментативному и химическому разрушению, а также к термическому и физическому разрушению. Хотя имеется несколько примеров 2'-OMe-содержащих аптамеров в литературе (см., например, Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995), такие аптамеры были созданы селекцией in vitro библиотек модифицированных транскриптов, в которых остатки C и U были 2'-фтор-замещенными (2'-F), а остатки A и G имели 2'-OH-группы. После идентификации функциональных последовательностей каждый остаток A и G тестировали в отношении толерантности к 2'-OMe-замещению и повторно синтезировали аптамер, имеющий все остатки A и G, которые толерантны к 2'-OMe-замещению, в виде 2'-OMe-остатков. Большинство остатков A и G в аптамерах, созданных таким двухстадийным способом, толерантны к замещению 2'-OMe-остатками, хотя в среднем примерно 20% не являются толерантными. Поэтому аптамеры, созданные с применением такого способа, имеют тенденцию к содержанию от двух до четырех 2'-OH-остатков, и в результате ухудшается стабильность и увеличиваются затраты на синтез. В результате включения модифицированных нуклеотидов в реакцию транскрипции, в которой создают стабилизированные олигонуклеотиды, используемые в олигонуклеотидных пулах, из которых аптамеры отбирают и обогащают посредством SELEX^TM (и/или любым из его вариантов и усовершенствований, включая варианты, описанные в данной публикации), способы согласно настоящему изобретению исключают необходимость в стабилизации отобранных аптамерных олигонуклеотидов (например, с помощью повторного синтеза аптамерных олигонуклеотидов с модифицированными нуклеотидами).

В одном варианте настоящее изобретение относится к аптамерам, содержащим комбинации 2'-OH, 2'-F, 2'-дезокси- и 2'-OMe-модификаций нуклеотидов ATP, GTP, CTP, TTP и UTP. В другом варианте настоящее изобретение относится к аптамерам, содержащим комбинации 2'-OH, 2'-F, 2'-дезокси-, 2'-OMe, 2'-NH₂ и 2'-метоксиэтил-модификаций нуклеотидов ATP, GTP, CTP, TTP и UTP. В другом варианте настоящее изобретение относится к аптамерам, содержащим 5⁶ комбинаций 2'-OH, 2'-F, 2'-дезокси-, 2'-OMe, 2'-NH₂ и 2'-метоксиэтил-модификаций нуклеотидов ATP, GTP, CTP, TTP и UTP.

2'-модифицированные аптамеры согласно изобретению создают с использованием модифицированных полимераз, например модифицированной полимеразы T7, имеющей скорость включения модифицированных нуклеотидов, содержащих объемные заместители в положении 2'-фуранозы, которая выше, чем скорость включения в случае полимераз дикого типа. Например, полимераза T7 с одиночной мутацией (Y639F), в которой остаток тирозина в положении 639 был заменен на фенилаланин, легко использует 2'-дезокси-, 2'-амино- и 2'-фтор-содержащие нуклеозидтрифосфаты (NTP) в качестве субстратов, и указанную полимеразу широко использовали для синтеза модифицированных РНК для множества применений. Однако, как сообщается, такая мутантная полимераза T7 не может легко использовать (т.е. включать) NTP с объемными 2'-заместителями, такими как 2'-OMe или 2'-азидо- (2'-N₃ ) заместители. Для включения объемных 2'-заместителей был описан двойной мутант полимеразы T7 (Y639F/H784A), имеющий замену гистидина в положении 784 на остаток аланина в дополнение к мутации Y639F, и он был использован в ограниченных случаях для включения модифицированных пиримидиновых NTP. См. Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138. Также описана полимераза T7 с одиночной мутацией (H784A), имеющая замену гистидина в положении 784 на остаток аланина. Padilla et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138. В обеих полимеразах T7, c двойной мутацией Y639F/H784A и одиночной мутацией H784A, замена на меньший аминокислотный остаток, такой как аланин, позволяет включать более объемные нуклеотидные субстраты, например 2'-O-метил-замещенные нуклеотиды.

В общем, было обнаружено, что в описанных в данной публикации условиях одиночный мутант Y693F может быть использован для включения всех 2'-OMe-замещенных NTP за исключением GTP, а двойной мутант Y639F/H784A может быть использован для включения всех 2'-OMe-замещенных NTP, включая GTP. Предполагается, что одиночный мутант H784A обладает свойствами, сходными с мутантами Y639F и Y639F/H784A, при использовании в условиях, описанных в данной публикации.

2'-модифицированные олигонуклеотиды могут быть синтезированы полностью из модифицированных нуклеотидов или с подгруппой модифицированных нуклеотидов. Модификации могут быть одинаковыми или разными. Все нуклеотиды могут быть модифицированными и все могут содержать одну и ту же модификацию. Все нуклеотиды могут быть модифицированными, но содержать разные модификации, например, все нуклеотиды, содержащие одно и то же основание, могут иметь один тип модификации, тогда как нуклеотиды, содержащие другие основания, могут иметь другие типы модификации. Все пуриновые нуклеотиды могут иметь один тип модификации (или являться немодифицированными), тогда как все пиримидиновые нуклеотиды имеют другой отличный тип модификации (или являются немодифицированными). Таким образом, транскрипты или пулы транскриптов создают с использованием любой комбинации модификаций, включая, например, рибонуклеотиды (2'-OH), дезоксирибонуклеотиды (2'-дезокси), 2'-F- и 2'-OMe-нуклеотиды. Смесь для транскрипции, содержащую 2'-OMe-C и -U и 2'-OH-A и -G, называют смесью «rRmY», а отобранные из нее аптамеры называют «rRmY»-аптамерами. Смесь для транскрипции, содержащую дезокси-A и -G и 2'-OMe-U и -C, называют смесью «dRmY», а отобранные из нее аптамеры называют «dRmY»-аптамерами. Смесь для транскрипции, содержащую 2'-OMe-A, -C и -U и 2'-OH-G, называют смесью «rGmH», а отобранные из нее аптамеры называют «rGmH»-аптамерами. Смесь для транскрипции, попеременно содержащую 2'-OMe-A, -C, -U и -G и 2'-OMe-A, -U и -C и 2'-F-G, называют «смесью чередующихся нуклеотидов», а отобранные из нее аптамеры называют аптамерами, содержащими «смесь чередующихся нуклеотидов». Смесь для транскрипции, содержащую 2'-OMe-A, -U, -C и -G, в которой до 10% G являются рибонуклеотидами, называют смесью «r/mGmH», а отобранные из нее аптамеры называют «r/mGmH»-аптамерами. Смесь для транскрипции, содержащую 2'-OMe-A, -U и -C и 2'-F-G называют смесью, «fGmH», а отобранные из нее аптамеры называют «fGmH»-аптамерами. Смесь для транскрипции, содержащую 2'-OMe-A, -U и -C и дезокси-G, называют смесью «dGmH», а отобранные из нее аптамеры называют «dGmH»-аптамерами. Смесь для транскрипции, содержащую дезокси-A и 2'-OMe-C, -G и -U, называют смесью «dAmB», а отобранные из нее аптамеры называют «dAmB»-аптамерами, и смесь для транскрипции, содержащую все 2'-OH-нуклеотиды, называют смесью «rN», а отобранные из нее аптамеры называют «rN»- или «rRrY»-аптамерами. Аптамер «mRmY» представляет собой аптамер, содержащий все 2'-OMe-нуклеотиды, и обычно его получают из r/mGmH-олигонуклеотида заменой после осуществления SELEX, когда это возможно, любого 2'-OH-G на 2'-OMe-G.

Предпочтительный вариант включает любую комбинацию 2'-OH-, 2'-дезокси- и 2'-OMe-нуклеотидов. Более предпочтительный вариант включает любую комбинацию 2'-дезокси- и 2'-OMe-нуклеотидов. Еще более предпочтительный вариант относится к любой комбинации 2'- дезокси- и 2'-OMe-нуклеотидов, в которой пиримидины являются 2'-OMe-нуклеотидами (такими как dRmY, mRmY или dGmH).

Включение модифицированных нуклеотидов в аптамеры согласно изобретению осуществляют до (перед) процессом селекции (например, модификация, получаемая до процесса SELEX^TM ). Необязательно аптамеры согласно изобретению, в которые были включены модифицированные нуклеотиды в результате модификации перед процессом SELEX^TM, могут быть дополнительно модифицированы в результате модификации после процесса SELEX ^TM (т.е. модификация, получаемая после процесса SELEX ^TM, осуществляемого после модификации, полученной перед SELEX^TM). Модификации, получаемые перед процессом SELEX^TM, дают модифицированные нуклеиновые кислоты-лиганды со специфичностью по отношению к мишени SELEX^TM, а также повышенной стабильностью in vivo. Модификации, получаемые после процесса SELEX^TM (например, укорочение, делеция, замена или дополнительные модификации нуклеотидов предварительно идентифицированных лигандов, имеющих нуклеотиды, включенные в результате модификации, осуществляемой перед процессом SELEX ^TM) могут приводить к дополнительному повышению стабильности in vivo, не оказывая неблагоприятного влияния на способность к связыванию нуклеиновой кислоты-лиганда, имеющего нуклеотиды, включенные в результате модификации, осуществляемой перед процессом SELEX^TM.

Для создания пулов 2'-модифицированных (например, 2'-OMe) РНК-транскриптов в условиях, при которых полимераза использует 2'-модифицированные NTP, предпочтительной полимеразой является двойной мутант Y693F/H784A или одиночный мутант Y693F. Другие полимеразы, особенно полимеразы, которые проявляют высокую толерантность к объемным 2'-заместителям, также могут быть использованы в настоящем изобретении. Такие полимеразы могут быть подвергнуты скринингу в отношении их возможностей посредством анализа их способности включать модифицированные нуклеотиды в условиях транскрипции, описанных в данной публикации.

Определили ряд факторов, которые важны для создания условий для транскрипции, применимых в способах, раскрытых в данном описании. Например, увеличение выходов модифицированного транскрипта наблюдали в том случае, когда включали лидерную последовательность в 5'-конец фиксированной последовательности на 5'-конце транскрипционной матрицы ДНК, так что по меньшей мере примерно 6 первых остатков полученного в результате транскрипта все являлись пуринами.

Другим важным фактором для получения транскриптов, содержащих модифицированные нуклеотиды, является присутствие или концентрация 2'-OH-GTP. Транскрипция может быть разделена на две фазы: первой фазой является инициация, во время которой NTP добавляется к 3'-гидроксильному концу GTP (или другого замещенного гуанозина) с получением динуклеотида, который затем удлиняется примерно на 10-12 нуклеотидов; второй фазой является элонгация, во время которой транскрипция продолжается после добавления примерно 10-12 первых нуклеотидов. Было обнаружено, что небольшие количества 2'-OH-GTP, добавляемые к смеси для транскрипции, содержащей избыток 2'-OMe-GTP, достаточно, чтобы дать возможность полимеразе инициировать транскрипцию с использованием 2'-OH-GTP, но после того как транскрипция входит в фазу элонгации, снижается способность различать 2'-OMe- и 2'-OH-GTP, и избыток 2'-OMe-GTP по сравнению с 2'-OH-GTP позволяет включать в основном 2'-OMe-GTP.

Другим важным фактором для включения 2'-OMe-замещенных нуклеотидов в транскрипты является применение двухвалентного магния и марганца в транскрипционной смеси. Было обнаружено, что различные комбинации концентраций хлорида магния и хлорида марганца влияют на выходы 2'-OMe-транскриптов, при этом оптимальная концентрация хлорида магния и марганца зависит от концентрации в реакционной смеси для транскрипции NTP, которые образуют комплексы с двухвалентными ионами металлов. Чтобы получить наибольшие выходы максимально 2'-замещенных OMe-транскриптов (т.е. все A, C и U и примерно 90% G-нуклеотидов), предпочтительны концентрации, составляющие примерно 5 мМ хлорида магния и 1,5 мМ хлорида марганца в том случае, когда каждый NTP присутствует в концентрации 0,5 мМ. Когда концентрация каждого NTP составляет 1,0 мМ, предпочтительны концентрации примерно 6,5 мМ хлорида магния и 2,0 мМ хлорида марганца. Когда концентрация каждого NTP составляет 2,0 мМ, предпочтительны концентрации примерно 9,6 мМ хлорида магния и 2,9 мМ хлорида марганца. В любом случае отклонение от указанных концентраций до двухкратного еще дает значительные количества модифицированных транскриптов.

Также важное значение имеет праймирование транскрипции GMP или гуанозином. Такое влияние является результатом специфичности полимеразы по отношению к инициирующим нуклеотидам. В результате 5'-концевой нуклеотид любого транскрипта, созданного таким образом, вероятно будет представлять собой 2'-OH-G. Предпочтительная концентрация GMP (или гуанозина) составляет 0,5 мМ и еще более предпочтительно 1 мМ. Было обнаружено, что введение ПЭГ, предпочтительно ПЭГ-8000, в реакционную смесь для транскрипции полезно для того, чтобы максимизировать включение модифицированных нуклеотидов.

Для максимального включения 2'-OMe-ATP (100%), UTP (100%), CTP (100%) и GTP (~90%) («r/mGmH») в транскрипты предпочтительны следующие условия: HEPES-буфер 200 мМ, DTT 40 мМ, спермидин 2 мМ, ПЭГ-8000 10% (масс./об.), тритон X-100 0,01% (масс./об.), MgCl₂ 5 мМ (6,5 мМ, когда концентрация каждого 2'-OMe-NTP составляет 1,0 мМ), MnCl₂ 1,5 мМ (2,0 мМ, когда концентрация каждого 2'-OMe-NTP составляет 1,0 мМ), 2'-OMe-NTP (каждого) 500 мкМ (более предпочтительно 1,0 мМ), 2'-OH-GTP 30 мкМ, 2'-OH-GMP 500 мкМ, pH 7,5, РНК-полимеразы T7 Y639F/H784A 15 единиц/мл, неорганическая пирофосфатаза 5 единиц/мл, и полностью пуриновая лидерная последовательность длиной по меньшей мере из 8 нуклеотидов. В используемом в данном описании смысле одну единицу мутантной РНК-полимеразы T7 Y639F/H784A (или любой другой мутантной РНК-полимеразы T7, указанной в данном описании) определяют как количество фермента, необходимого для включения 1 нмоль 2'-OMe-NTP в транскрипты в условиях r/mGmH. В используемом в данном описании смысле одну единицу неорганической пирофосфатазы определяют как количество фермента, которое будет высвобождать 1,0 моль неорганического ортофосфата в минуту при pH 7,2 и 25°C.

Для максимального включения (100%) 2'-OMe-ATP, -UTP и -CTP («rGmH») в транскрипты предпочтительны следующие условия: HEPES-буфер 200 мМ, DTT 40 мМ, спермидин 2 мМ, ПЭГ-8000 10% (масс./об.), тритон X-100 0,01% (масс./об.), MgCl₂ 5 мМ (9,6 мМ, когда концентрация каждого 2'-OMe-NTP составляет 2,0 мМ), MnCl₂ 1,5 мМ (2,9 мМ, когда концентрация каждого 2'-OMe-NTP составляет 2,0 мМ), 2'-OMe-NTP (каждого) 500 мкМ (более предпочтительно 2,0 мМ), pH 7,5, РНК-полимераза T7 Y639F 15 единиц/мл, неорганическая пирофосфатаза 5 единиц/мл и полностью пуриновая лидерная последовательность длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов.

Для максимального включения (100%) 2'-OMe-UTP и -CTP («rRmY») в транскрипты предпочтительны следующие условия: HEPES-буфер 200 мМ, DTT 40 мМ, спермидин 2 мМ, ПЭГ-8000 10% (масс./об.), тритон X-100 0,01% (масс./об.), MgCl₂ 5 мМ (9,6 мМ, когда концентрация каждого 2'-OMe-NTP составляет 2,0 мМ), MnCl₂ 1,5 мМ (2,9 мМ, когда концентрация каждого 2'-OMe-NTP составляет 2,0 мМ), 2'-OMe-NTP (каждого) 500 мкМ (более предпочтительно 2,0 мМ), pH 7,5, РНК-полимераза T7 Y639F/H784A 15 единиц/мл, неорганическая пирофосфатаза 5 единиц/мл и полностью пуриновая лидерная последовательность длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов.

Для максимального включения (100%) дезокси-ATP и -GTP и 2'-OMe-UTP и -CTP («dRmY») в транскрипты предпочтительны следующие условия: HEPES-буфер 200 мМ, DTT 40 мМ, спермин 2 мМ, спермидин 2 мМ, ПЭГ-8000 10% (масс./об.), тритон X-100 0,01% (масс./об.), MgCl₂ 9,6 мМ, MnCl₂ 2,9 мМ, 2'-OMe-NTP (каждого) 2,0 мМ, pH 7,5, РНК-полимераза T7 Y639F 15 единиц/мл, неорганическая пирофосфатаза 5 единиц/мл и полностью пуриновая лидерная последовательность длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов.

Для максимального включения (100%) 2'-OMe-ATP, -UTP и -CTP и 2'-F-GTP («fGmH») в транскрипты предпочтительны следующие условия: HEPES-буфер 200 мМ, DTT 40 мМ, спермидин 2 мМ, ПЭГ-8000 10% (масс./об.), тритон X-100 0,01% (масс./об.), MgCl₂ 9,6 мМ, MnCl ₂ 2,9 мМ, 2'-OMe-NTP (каждого) 2,0 мМ, pH 7,5, РНК-полимераза T7 Y639F 15 единиц/мл, неорганическая пирофосфатаза 5 единиц/мл и полностью пуриновая лидерная последовательность длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов.

Для максимального включения (100%) дезокси-ATP и 2'-OMe-UTP, -GTP и -CTP («dAmB») в транскрипты предпочтительны следующие условия: HEPES-буфер 200 мМ, DTT 40 мМ, спермидин 2 мМ, ПЭГ-8000 10% (масс./об.), тритон X-100 0,01% (масс./об.), MgCl₂ 9,6 мМ, MnCl ₂ 2,9 мМ, 2'-OMe-NTP (каждого) 2,0 мМ, pH 7,5, РНК-полимераза T7 Y639F 15 единиц/мл, неорганическая пирофосфатаза 5 единиц/мл и полностью пуриновая лидерная последовательность длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов.

Для каждого из описанных выше случаев (a) транскрипцию предпочтительно осуществляют при температуре примерно от 20°C до примерно 50°C, предпочтительно примерно от 30°C до 45°C и более предпочтительно примерно при 37°C в течение периода времени, составляющего по меньшей мере два часа, и (b) используют 50-300 нМ двунитевой матрицы ДНК для транскрипции (200 нМ матрицы используют в раунде 1, чтобы увеличить разнообразие (300 нМ матрицы используют при транскрипции dRmY)) и для последующих раундов примерно 50 нМ, разведение 1/10 оптимизированной реакционной смеси для ПЦР, используя условия, описанные в данной публикации). Предпочтительные ДНК-матрицы для транскрипции описаны ниже (где ARC254 и ARC256 транскрибируются при всех 2'-OMe-условиях, а ARC255 транскрибируется в условиях rRmY).

В условиях транскрипции rN согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-OH-аденозинтрифосфаты (ATP), 2'-OH-гуанозинтрифосфаты (GTP), 2'-OH-цитидинтрифосфаты (CTP) и 2'-OH-уридинтрифосфаты (UTP). Модифицированные олигонуклеотиды, получаемые с использованием смесей для транскрипции rN согласно настоящему изобретению, содержат по существу все основания в виде 2'-OH-аденозина, 2'-OH-гуанозина, 2'-OH-цитидина и 2'-OH-уридина. В предпочтительном варианте транскрипции rN полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-аденозин, по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-цитидин и по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-уридин. В более предпочтительном варианте транскрипции rN полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-аденозин, по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-цитидин и по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-уридин. В наиболее предпочтительном варианте транскрипции rN модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-аденозин, 100% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-цитидин и 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-уридин.

В условиях транскрипции rRmY согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-OH-аденозинтрифосфаты, 2'-OH-гуанозинтрифосфаты, 2'-OMe-цитидинтрифосфаты и 2'-OMe-уридинтрифосфаты. Модифицированные олигонуклеотиды, полученные с использованием смесей для транскрипции rRmY согласно настоящему изобретению, содержат по существу все основания в виде 2'-OH-аденозина, 2'-OH-гуанозина, 2'-OMe-цитидина и 2'-OMe-уридина. В предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-аденозин, по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин и по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин. В более предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-аденозин, по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин и по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин. В наиболее предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-аденозин, 100% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин и 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин.

В условиях транскрипции dRmY согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-дезоксиаденозинтрифосфаты, 2'-дезоксигуанозинтрифосфаты, 2'-O-метилцитидинтрифосфаты и 2'-O-метилуридинтрифосфаты. Модифицированные олигонуклеотиды, полученные с использованием условий транскрипции dRmY согласно настоящему изобретению, содержат по существу все основания в виде 2'-дезоксиаденозина, 2'-дезоксигуанозина, 2'-O-метилцитидина и 2'-O-метилуридина. В предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксиаденозин, по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксигуанозин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-O-метилцитидин и по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-O-метилуридин. В более предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксиаденозин, по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксигуанозин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-O-метилцитидин, и по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-O-метилуридин. В наиболее предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксиаденозин, 100% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксигуанозин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-O-метилцитидин и 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-O-метилуридин.

В условиях транскрипции rGmH согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-OH-гуанозинтрифосфаты, 2'-OMe-цитидинтрифосфаты, 2'-OMe-уридинтрифосфаты и 2'-OMe-аденозинтрифосфаты. Модифицированные олигонуклеотиды, полученные с использованием транскрипционных смесей rGmH согласно настоящему изобретению содержат по существу все основание в виде 2'-OH-гуанозина, 2'-OMe-цитидина, 2'-OMe-уридина и 2'-OMe-аденозина. В предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин и по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин. В более предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин и по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин. В наиболее предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой 100% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин и 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин.

В условиях транскрипции r/mGmH согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-OMe-аденозинтрифосфат, 2'-OMe-цитидинтрифосфат, 2'-OMe-гуанозинтрифосфат, 2'-OMe-уридинтрифосфат и 2'-OH-гуанозинтрифосфат. Полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды, полученные с использованием транскрипционных смесей r/mGmH согласно настоящему изобретению, содержат по существу все основания в виде 2'-OMe-аденозина, 2'-OMe-цитидина, 2'-OMe-гуанозина и 2'-OMe-уридина, при этом популяция гуанозиновых нуклеотидов имеет максимум примерно 10% 2'-OH-гуанозина. В предпочтительном варианте полученные в результате r/mGmH-модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-гуанозин, по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин и не более чем примерно 10% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин. В более предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-гуанозин, по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин и не более чем примерно 10% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин. В наиболее предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-гуанозин и 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин, не более чем примерно 10% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OH-гуанозин.

В условиях транскрипции fGmH согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-OMe-аденозинтрифосфаты, 2'-OMe-уридинтрифосфаты, 2'-OMe-цитидинтрифосфаты и 2'-F-гуанозинтрифосфаты. Модифицированные олигонуклеотиды, полученные с использованием условий транскрипции fGmH согласно настоящему изобретению, содержат по существу все основания в виде 2'-OMe-аденозина, 2'-OMe-уридина, 2'-OMe-цитидина и 2'-F-гуанозина. В предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин, по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин и по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-F-гуанозин. В более предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин, по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин и по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-F-гуанозин. В наиболее предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-аденозин, 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин и 100% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-F-гуанозин.

В условиях транскрипции dAmB согласно настоящему изобретению реакционная смесь для транскрипции содержит 2'-дезоксиаденозинтрифосфаты, 2'-OMe-цитидинтрифосфаты, 2'-OMe-гуанозинтрифосфаты и 2'-OMe-уридинтрифосфаты. Модифицированные олигонуклеотиды, полученные с использованием транскрипционных смесей dAmB согласно настоящему изобретению, содержат по существу все основания в виде 2'-дезоксиаденозина, 2'-OMe-цитидина, 2'-OMe-гуанозина и 2'-OMe-уридина. В предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 80% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксиаденозин, по меньшей мере 80% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, по меньшей мере 80% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-гуанозин и по меньшей мере 80% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин. В более предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды содержат последовательность, в которой по меньшей мере 90% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксиаденозин, по меньшей мере 90% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, по меньшей мере 90% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-гуанозин и по меньшей мере 90% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин. В наиболее предпочтительном варианте полученные в результате модифицированные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность, в которой 100% всех аденозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксиаденозин, 100% всех цитидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-цитидин, 100% всех гуанозиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-гуанозин и 100% всех уридиновых нуклеотидов представляют собой 2'-OMe-уридин.

В каждом случае продукты транскрипции затем можно использовать в качестве библиотеки в способе SELEX^TM , чтобы идентифицировать аптамеры и/или определить консервативный мотив последовательностей, которые обладают специфичностью связывания по отношению к данной мишени. Полученные в результате последовательности уже являются стабилизированными, что исключает из процесса стадию получения стабилизированной последовательности аптамера и в результате дает более высокостабилизированный аптамер. Другим преимуществом способа 2'-OMe-SELEX^TM является тот факт, что полученные в результате последовательности, скорее всего, имеют меньше 2'-OH-нуклеотидов, необходимых в последовательности, а возможно, не имеют ни одного. В тех случаях, когда 2'-OH-нуклеотиды остаются, они могут быть удалены при осуществлении модификации после SELEX.

Как описано ниже, более низкие, но еще приемлемые выходы транскриптов, полностью содержащих 2'-замещенные нуклеотиды, могут быть получены в других условиях, отличных от оптимизированных условий, описанных выше. Например, изменения описанных выше условий транскрипции включают:

Концентрация HEPES-буфера может быть в диапазоне от 0 до 1 М. Настоящее изобретение также охватывает применение других буферных средств, имеющих pKa от 5 до 10, включая, например, трис(гидроксиметил)аминометан.

Концентрация DTT может быть в диапазоне от 0 до 400 мМ. Способы согласно настоящему изобретению также предусматривают применение других восстановителей, включая, например, меркаптоэтанол.

Концентрация спермидина и/или спермина может быть в диапазоне от 0 до 20 мМ.

Концентрация ПЭГ-8000 может быть в диапазоне от 0 до 50% (масс./об.). Способы согласно настоящему изобретению также предусматривают применение другого гидрофильного полимера, включая, например, ПЭГ с другой молекулярной массой или другие полиалкиленгликоли.

Концентрация тритона X-100 может быть в диапазоне от 0 до 0,1% (масс./об.). Способы согласно настоящему изобретению также предусматривают применение других неионогенных детергентов, включая, например, другие детергенты, включая другие детергенты на основе тритона-X.

Концентрация MgCl₂ может быть в диапазоне от 0,5 мМ до 50 мМ. Концентрация MnCl₂ может быть в диапазоне от 0,15 мМ до 15 мМ. Обе соли MgCl₂ и MnCl₂ должны присутствовать в описанных диапазонах, и в предпочтительном варианте присутствуют в соотношении MgCl ₂:MnCl₂ примерно от 10 до 3, предпочтительно соотношение равно примерно 3-5:1, более предпочтительно соотношение равно примерно 3-4:1.

Концентрация 2'-OMe-NTP (каждого NTP) может быть в диапазоне от 5 мкМ до 5 мМ.

Концентрация 2'-OH-GTP может быть в диапазоне от 0 мкМ до 300 мкМ.

Концентрация 2'-OH-GMP может быть в диапазоне от 0 до 5 мМ.

pH может быть в диапазоне от pH 6 до pH 9. Способы согласно настоящему изобретению могут быть осуществлены на практике в pH-диапазоне активности большинства полимераз, которые включают модифицированные нуклеотиды. Кроме того, способы согласно настоящему изобретению предусматривают необязательное использование хелатирующих агентов в условиях реакции транскрипции, включая, например, EDTA, EGTA и DTT.

Отобранные аптамеры, имеющие наиболее высокую аффинность и специфичное связывание, которое показано в биологических анализах, описанных в примерах ниже, являются подходящими терапевтическими средствами для лечения состояний, в патогенез которых вовлечен белок комплемента C5.

Аптамеры, обладающие аффинностью связывания с белком системы комплемента C5

Хотя система комплемента играет важную роль в поддержании здоровья, она может вызывать или вносить вклад в заболевание. Соответственно, требуется разработка ингибиторов системы комплемента для терапевтического применения. Особенно желательно получить ингибиторы белка комплемента C5, так как он является компонентом как классического, так и альтернативного путей каскадов активации комплемента (Matis and Rollins (1995) Nature Medicine 1(8): 839-842). Соответственно, ингибирование C5 может предотвратить опосредованное комплементом повреждение, вызванное любым из путей. Некоторые белки системы комплемента, такие как C1q и C3, важны для нормальных механизмов защиты от микроорганизмов и для клиренса иммунных компонентов и очистки поврежденной ткани; однако C5 не играет существенной роли для указанных функций. Таким образом, функция C5 может быть ингибирована в течение коротких или длительных периодов времени без подрыва защитной роли системы комплемента.

Терапевтический ингибитор C5 также желателен вследствие того, что ингибирование расщепления C5 предотвращает образование двух потенциально повреждающих активностей комплемента. Во-первых, ингибирование образования C5a в результате расщепления C5 устраняет основную хемотаксическую и воздействующую на кровеносные сосуды активность комплемента. Во-вторых, ингибирование образования C5b в результате расщепления C5 блокирует сборку цитолитического мембраноатакующего комплекса C5b-9 («MAC»). Ингибирование расщепления C5 блокирует эффекты C5a и C5b на лейкоциты и на ткани, например на эпителиальные клетки (Ward (1996) Am. J. Pathol. 149: 1079).

C5a и MAC вовлечены в острое и хроническое воспаление, связанное с заболеванием человека, и их роль в патологических состояниях была подтверждена в моделях на животных. C5a требуется для зависимого от комплемента и нейтрофилов повреждения сосудов легкого (Ward (1997) J. Lab. Clin. Med. 129: 400; Mulligan et al., (1998) J. Clin. Invest. 98: 503) и связан с активацией нейтрофилов и тромбоцитов при шоке и ожоговом повреждении (Schmid et al., (1997) Shock 8: 119). MAC опосредует повреждение мышц при остром аутоиммунном бульбоспинальном параличе (Biesecker and Gomez (1989) J. Immunol. 142: 2654), отторжение органов при трансплантации (Baldwin et al., (1995) Transplantation 59: 797; Brauer et al., (1995) Transplantation 59: 288; Takahashi et al., (1997) Immunol. Res. 16: 273) и повреждение почек при аутоиммунном гломерулонефрите (Biesecker (1981) J. Exp. Med. 39: 1779; Nangaku (1997) Kidney Int. 52: 1570). И C5a и MAC вовлечены в острую ишемию миокарда (Homeister and Lucchesi (1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34: 17), острое (Bednar et al., (1997) J. Neurosurg. 86: 139) и хроническое повреждение ЦНС (Morgan (1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14: 19), активацию лейкоцитов во время искусственного кровообращения (Sun et al., (1995) Nucleic Acids Res. 23: 2909; Spycher and Nydegger (1995) Infushionsther. Transfusionsmed. 22: 36) и в повреждение тканей, связанное с аутоиммунными заболеваниями, включая артрит и волчанку (Wang et al., (1996) Immunology 93: 8563).

Активация комплемента также вовлечена в диабетическую ретинопатию и может осложнять или инициировать повреждение сосудов сетчатки (Zhang et al., (2002) Diabetes 51: 3499). Низкий уровень конститутивной активации комплемента обычно имеет место в глазу в отсутствие диабета, доказательством которого является наличие MAC и регуляторных белков комплемента в глазах недиабетических крыс, что свидетельствует о том, что у пациентов с диабетом происходит нарушение регуляции комплемента (Sohn et al., (2000) IOVS 41: 3492). Кроме того, отложение C5b-9 было выявлено в сосудах сетчатки доноров у людей, больных диабетом, которое отсутствовало у доноров, не больных диабетом (Zhang et al.), сниженная экспрессия CD55 и CD59 показана в сетчатке при диабете (Zhang et al.), и гликозилированный CD59 присутствует в моче больных диабетом, но отсутствует у пациентов, не больных диабетом (Acosta et al., (2002) PNAS 97, 5450-5455). Кроме того, известно что при диабете типа I активируется комплемент и сосудистая система. См., например, Hansen, T.K. et al., Diabetes, 53: 1570-1576 (2004). C5a активирует эндотелиальные клетки посредством взаимодействия с иммунной системой и системой комплемента. См., например, Albrecht, E.A. et al., Am. J. Pathology, 164: 849-859 (2004). Сосудистая система активируется при глазных болезнях, включая диабетическую ретинопатию. См., например, Gert, V.B. et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 43: 1104-1108 (2002). Система комплемента также активируется при диабетической ретинопатии. См., например, Gert, V.B. et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 43: 1104-1108 (2002) и Badouin, C. et. аl., Am. J. Opthalmol., 105: 383-388 (1988).

В некоторых вариантах вещества согласно настоящему изобретению включают ряд аптамеров нуклеиновых кислот длиной примерно от 15 до примерно 60 нуклеотидов, которые специфично связываются с белком комплемента C5 и которые функционально модулируют, например блокируют, активность белка комплемента C5 в анализах in vivo и/или основанных на клетках анализах.

В данном описании представлены аптамеры, которые способны специфично связываться и модулировать белок комплемента C5. Указанные аптамеры обеспечивают низкотоксичное, безопасное и эффективное средство лечения, ослабления и/или предотвращения различных связанных с комплементом заболеваний или расстройств, включая, например, связанные с комплементом сердечные расстройства (например, повреждение миокарда; опосредованные белком комплемента C5 осложнения, связанные с трансплантационной хирургией по шунтированию коронарных артерий (CABG), такие как послеоперационное кровотечение, системная активация нейтрофилов и лейкоцитов, повышенный риск инфаркта миокарда и когнитивной дисфункции; рестеноз; и опосредованные белком комплемента C5 осложнения, связанные с чрескожным вмешательством в коронарные артерии), ишемическое-реперфузионное повреждение (например, инфаркт миокарда, инсульт, переохлаждение), связанные с комплементом воспалительные расстройства (например, астма, артрит, сепсис и отторжение после трансплантации органов) и связанные с комплементом аутоиммунные расстройства (например, бульбоспинальный паралич, системная красная волчанка (СКВ). Другие показания, при которых желательно ингибирование C5, включают, например, воспаление легких (Mulligan et al. (1998) J. Clin. Invest. 98: 503), экстракорпоральную активацию комплемента (Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96: 1564), опосредованную антителами активацию комплемента (Biesecker et al. (1989) J. Immunol. 142: 2654), гломерулонефрит и другие почечные болезни, глазные заболевания, такие как опосредованное C5 повреждение ткани глаза, например диабетическая ретинопатия, и пароксизмальную ночную гемоглобинурию. Указанные аптамеры также можно использовать в диагностике.

Указанные аптамеры могут содержать модификации, которые описаны в данной публикации, включая, например, конъюгирование с липофильными или высокомолекулярными соединениями (например, ПЭГ), включение кэпирующего остатка, включение модифицированных нуклеотидов и модификации фосфатного остова.

В одном варианте осуществления изобретения предлагается изолированный не встречающийся в природе аптамер, который связывается с белком комплемента C5. В некоторых вариантах изолированный не встречающийся в природе аптамер имеет константу диссоциации («K_d») по отношению к белку комплемента C5, составляющую менее 100 мкМ, менее 1 мкМ, менее 500 нМ, менее 100 нМ, менее 50 нМ, менее 1 нМ, менее 500 пМ, менее 100 пМ, менее 50 пМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения константу диссоциации определяют дот-блот-титрованием, как описано в примере 1 ниже.

В другом варианте аптамер согласно изобретению модулирует функцию белка комплемента C5. В другом варианте аптамер согласно изобретению ингибирует функцию C5, тогда как в другом варианте аптамер стимулирует функцию C5. Вариант белка комплемента C5 в используемом в данном описании смысле охватывает варианты, которые выполняют по существу такую же функцию, что и белок комплемента C5. Вариант белка комплемента C5 предпочтительно имеет по существу такую же структуру и в некоторых вариантах имеет 80% идентичность последовательности, более предпочтительно 90% идентичность последовательности и более предпочтительно 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью белка комплемента C5, содержащего указанную ниже аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 102) (приведена в Haviland et al., J. Immunol. 1991 Jan 1; 146(1): 362-8):

В некоторых вариантах осуществления изобретения идентичность последовательностей целевых вариантов определяют с использованием BLAST, как описано ниже. Термин «идентичность последовательностей» в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или белков относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют конкретное процентное содержание аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и выравнивании в отношении максимального соответствия, которое измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или в результате визуального просмотра. В случае сравнения последовательностей обычно одна последовательность действует как эталонная последовательность, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты подпоследовательностей и вводят параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Алгоритм сравнения последовательностей затем вычисляет идентичность последовательностей в процентах для тестируемой последовательности(ей) по сравнению с эталонной последовательностью на основе заданных параметров программы. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно, например, провести с помощью алгоритма локальной гомологии, описанного в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), с помощью алгоритма выравнивания для определения гомологии согласно Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), способом поиска сходства согласно Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), компьютеризованными способами использования указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете компьютерных программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) или посредством визуального просмотра (в общем см. Ausubel et al., выше).

Одним из примеров алгоритма, который подходит для определения идентичности последовательностей в процентах, является алгоритм, используемый в основном средстве поиска, основанном на локальном выравнивании (в дальнейшем «BLAST»), см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) и Altschul et al., Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402 (1997). Компьютерная программа для осуществления анализов BLAST общедоступна из National Center for Biotechnology Information (в дальнейшем «NCBI»). Параметры по умолчанию, применяемые при определении идентичности последовательностей при использовании компьютерной программы, доступны из NCBI, например, BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) и BLASTP (для аминокислотных последовательностей) описаны в McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004).

В другом варианте осуществления изобретения предлагается аптамер, который обладает по существу такой же способностью связывать белок комплемента C5, что и аптамер, содержащий любую из последовательностей: SEQ ID NO: 1-2, 5-67, 75-81, 83 или 88-98. В другом варианте согласно изобретению аптамер имеет по существу такую же структуру и способность связывать белок комплемента C5, что и аптамер, содержащий любую из последовательностей: SEQ ID NO: 1-2, 5-67, 75-81, 83 или 88-98. В другом варианте аптамеры согласно изобретению имеют последовательность, включая ее любые химические модификации, согласно любой из SEQ ID NO: 2, 5-67, 75-81, 83 или 88-98. В другом варианте аптамеры согласно изобретению используют в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях. В другом варианте аптамеры или композиции, содержащие аптамеры согласно изобретению, используют для лечения различных связанных с комплементом заболеваний или расстройств, включая любое заболевание или расстройство, выбранное из группы, состоящей из связанных с комплементом сердечных расстройств (например, повреждения миокарда; опосредованных белком комплемента C5 осложнений, связанных с трансплантацией при шунтировании коронарных артерий (CABG), таких как послеоперационное кровотечение, системная активация нейтрофилов и лейкоцитов, повышенный риск инфаркта миокарда и когнитивной дисфункции; рестеноз; и опосредованные белком комплемента C5 осложнения, связанные с чрескожным вмешательством в коронарные артерии), ишемического-реперфузионного повреждения (например, инфаркта миокарда, инсульта, переохлаждения), связанных с комплементом воспалительных расстройств (например, астмы, артрита, сепсиса и отторжения после трансплантации органов) и связанных с комплементом аутоиммунных расстройств (например, бульбоспинального паралича, системной красной волчанки (СКВ), воспаления легких, экстракорпоральной активации комплемента, опосредованной антителами активации комплемента и глазных болезней, таких как опосредованное комплементом повреждение ткани глаза, например диабетической ретинопатии.

В одном варианте анти-C5-аптамеры согласно изобретению содержат смесь 2'-фтор-модифицированных нуклеотидов, 2'-OMe-модифицированных нуклеотидов («2'-OMe») и 2'-OH-пуриновых остатков. Наглядная общая последовательность (SEQ ID NO: 1) для модифицированного анти-C5-аптамера показана ниже в таблице 1, и структура показана на фиг.3A. Подавляющее большинство пуринов (A и G) были модифицированы до 2'-OMe, исключая только два остатка G, в которых сохранился 2'-OH (остатки показаны контуром). Обведенные в кружки остатки представляют подгруппу пиримидинов, которые были одновременно модифицированы до 2'-H по существу без изменения анти-C5-активности аптамера (см. ARC330 в таблице 1 ниже (SEQ ID NO: 2, фиг.3B)). Подчеркнутые остатки, показанные на фиг.3A, означают пиримидиновые остатки, которые могут содержать либо 2'-фтор, либо 2'-H-модификацию (но не 2'-OMe), тогда как обведенные прямоугольниками остатки означают пиримидиновые остатки, которые могут содержать либо 2'-фтор, либо 2'-OMe-модификацию (но не 2'-H). Остатки, указанные стрелкой ( ), должны содержать 2'-фтор-модификацию. Без 2'-фтор-модификации остатков, указанных стрелкой ( ), полученная гемолитическая активность полученного в результате аптамера существенно снижается. В предпочтительном варианте анти-C5-аптамер согласно изобретению содержит нуклеотидную последовательность согласно SEQ ID NO: 1.

Примером анти-C5-аптамера согласно изобретению является ARC186 (SEQ ID NO: 4), который показан на Фиг.3C и описан в патенте США с регистрационным No. 6395888, который включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Все 21 пиримидиновых остатка ARC186 имеют 2'-фтор-модификации. Большинство пуринов (14 остатков) имеют 2'-OMe-модификации за исключением трех 2'-OH-пуриновых остатков (показаны контуром на фиг.3C). Анти-C5-аптамеры согласно изобретению также могут содержать различные смеси 2'-фтор- и 2'-H-модификаций. Например, другим анти-C5-аптамером согласно изобретению является ARC330 (SEQ ID NO: 2), показанный на фиг.3B. ARC330 (SEQ ID NO: 2) содержит семь 2'-H-модификаций (обведенные в кружки остатки на фиг.3B), 14 пиримидиновых остатков с 2'-фтор-модификациями, 14 пуриновых остатков с 2'-OMe-модификациями и три 2'-OH-пуриновых остатка (показаны контуром на фиг.3B).

Другие комбинации аптамеров, содержащих смесь 2'-фтор-модификаций, 2'-OMe-модификаций, 2'-OH-пуриновых остатков, и конъюгирование с неиммуногенными высокомолекулярными соединениями (например, ПЭГ) разного размера, каждые из которых получены из ARC186 (SEQ ID NO: 4), описаны в таблице 1 ниже. Изобретение относится к аптамерам, которые описаны в таблице 1 ниже. Изобретение также относится к аптамерам, которые описаны ниже, но в которых отсутствует указанный 3'-кэп (например, инвертированный дезокситимидиновый кэп) и/или к аптамерам, указанным ниже, но содержащим 3'-кэп (например, инвертированный dT) в тех случаях, когда 3'-кэп не указан.

Если не оговорено особо, нуклеотидные последовательности в таблице 1 ниже указаны в 5'-3'-направлении. Для каждой отдельной последовательности в таблице 1 все 2'-OMe-модификации пуринов или пиримидинов обозначены «m» перед соответствующим нуклеотидом; все 2'-фтор-модификации пиримидинов обозначены «f» перед соответствующим нуклеотидом; все дезокси-модификации пуринов или пиримидинов обозначены «d» перед соответствующим нуклеотидом; и любой пурин или пиримидин, указанный без «m», «f» или «d» перед нуклеотидом, означает 2'-OH-остаток. Дополнительно «3T» указывает инвертированный дезокситимидин, «NH» указывает гексиламинный линкер, «NH₂ » указывает гексиламинную концевую группу, «ПЭГ» означает группу полиэтиленгликоля, имеющую указанную молекулярную массу, и «биотин» означает аптамер, имеющий конъюгированный с 5'-концом биотин.

Таблица 1

где разветвленный ПЭГ с М.м. 40 кД представляет собой,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-2-(4'-бутамид)

где разветвленный ПЭГ с М.м. 40 кД представляет собой 2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоил

Другие аптамеры согласно изобретению, которые связывают белок комплемента C5, описаны ниже в примере 3.

В некоторых вариантах аптамерные терапевтические средства согласно настоящему изобретению имеют высокую аффинность и специфичность по отношению к своим мишеням, снижая при этом опасные побочные эффекты не встречающихся в природе нуклеотидных замещений, если аптамерные терапевтические средства разлагаются в организме пациентов или субъектов. В некоторых вариантах терапевтические композиции, содержащие аптамерные терапевтические средства согласно настоящему изобретению, не имеют или имеют сниженное количество фторированных нуклеотидов.

Аптамеры согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием любого способа синтеза олигонуклеотидов, известного в данной области, включая способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов, известный в данной области (см., например, Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14: 5399-5467 (1986) и Froehler et al., Tet. Lett. 27: 5575-5578 (1986)) и способы синтеза в растворах, такие как способы синтеза триэфиров (см., например, Sood et al., Nucl. Acid Res. 4: 2557 (1977) и Hirose et al., Tet. Lett., 28: 2449 (1978)).

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим молекулы аптамеров, которые связываются с белком комплемента C5. В некоторых вариантах композиции подходят для применения вовнутрь и содержат эффективное количество фармакологически активного соединения согласно изобретению отдельно или в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Соединения особенно применимы, так как они имеют очень низкую токсичность или совсем не токсичны.

Композиции согласно изобретению можно применять для лечения или предотвращения патологии, такой как заболевание или расстройство, или ослабления симптомов такого заболевания или расстройства у пациента. Например, композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения или предотвращения патологии, связанной с обусловленными комплементом сердечными расстройствами (например, повреждением миокарда; опосредованными белком комплемента C5 осложнениями, связанными с трансплантационной хирургией по шунтированию коронарных артерий (CABG), такими как послеоперационное кровотечение, системная активация нейтрофилов и лейкоцитов, повышенный риск инфаркта миокарда и когнитивной дисфункции; рестенозом; и опосредованными белком комплемента C5 осложнениями, связанными с чрескожным вмешательством в коронарные артерии), ишемическим-реперфузионным повреждением (например, инфарктом миокарда, инсультом, переохлаждением), связанными с комплементом воспалительными расстройствами (например, астмой, артритом, сепсисом и отторжением после трансплантации органов) и связанными с комплементом аутоиммунными расстройствами (например, бульбоспинальным параличом, системной красной волчанкой (СКВ или волчанкой); воспалением легких, экстракорпоральной активацией комплемента, опосредованной антителами активацией комплемента и глазными болезнями, такими как диабетическая ретинопатия. Композиции согласно изобретению применимы для введения субъекту, страдающему или предрасположенному к заболеванию или расстройству, которое связано или происходит в результате действия белка комплемента C5, с которым аптамеры согласно изобретению специфично связываются.

Композиции согласно изобретению можно использовать в способе лечения пациента или субъекта, имеющего патологию. Способы согласно изобретению заключаются во введении пациенту или субъекту аптамера или композиции, содержащей аптамеры, которые связываются с белком комплемента C5, так что связывание аптамера с белком комплемента C5 изменяет его биологическую функцию, тем самым излечивая патологию.

Пациентом или субъектом, имеющим патологию, т.е. пациентом или субъектом, которого лечат способами согласно данному изобретению, может быть позвоночное, более конкретно млекопитающее или более конкретно человек.

На практике аптамеры или их фармацевтически приемлемые соли вводят в количествах, которые будут достаточными для проявления их биологической активности, например, для ингибирования связывания мишени аптамера с ее рецептором, предотвращения расщепления белка-мишени.

Один аспект согласно изобретению относится к композиции аптамера согласно изобретению в комбинации с другими средствами лечения расстройств, опосредованных C5 комплементом. Композиция аптамера согласно изобретению может содержать, например, более одного аптамера. В некоторых примерах композицию аптамера согласно изобретению, содержащую одно или несколько соединений согласно изобретению, вводят в комбинации с другой применимой композицией, такой как противовоспалительное средство, иммунодепрессант, противовирусное средство или тому подобное. Кроме того, соединения согласно изобретению могут быть введены в комбинации с цитотоксическим, цитостатическим или химиотерапевтическим средством, таким как алкилирующий агент, антиметаболит, ингибитор митоза или цитотоксический антибиотик, которые описаны выше. В общем, доступные в настоящее время дозированные формы известных терапевтических средств будут подходящими для применения в таких комбинациях.

«Комбинированная терапия» (или «совместная терапия») заключается во введении композиции аптамера согласно изобретению и по меньшей мере второго средства в виде части конкретной схемы лечения, предназначенной для оказания целебного влияния в результате совместного действия таких терапевтических средств. Целебный эффект комбинации включает, но не ограничен указанным, фармакокинетическое или фармакодинамическое совместное действие, оказываемое в результате комбинирования терапевтических средств. Введение таких терапевтических средств в комбинации обычно осуществляют в течение определенного периода времени (обычно в течение минут, часов, суток или недель в зависимости от выбранной комбинации).

«Комбинированная терапия» может подразумевать, но как правило не подразумевает, введение двух или более указанных терапевтических средств в виде части отдельных схем монотерапии, которые случайно и произвольно приводят к комбинациям согласно настоящему изобретению. Подразумевается, что «комбинированная терапия» охватывает введение указанных терапевтических средств последовательно, то есть когда каждое терапевтическое средство вводят в разное время, а также введение указанных терапевтических средств или по меньшей мере двух терапевтических средств по существу одновременно. По существу одновременное введение можно осуществить, например, введением субъекту одной капсулы, содержащей фиксированное соотношение каждого терапевтического средства, или в виде нескольких отдельных капсул для каждого терапевтического средства.

Последовательное или по существу одновременное введение каждого терапевтического средства можно осуществить любым подходящим путем, включая без ограничения местные пути, пероральные пути, внутривенные пути, внутримышечные пути и прямое всасывание через ткани слизистых оболочек. Терапевтические средства можно вводить одним и тем же путем или разными путями. Например, первое терапевтическое средство выбранной комбинации можно вводить путем инъекции, тогда как другие терапевтические средства комбинации можно вводить местно.

Альтернативно, например, все терапевтические средства могут быть введены местно или все терапевтические средства могут быть введены посредством инъекции. Последовательность, в которой вводят терапевтические средства, не является строго необходимой, если не оговорено особо. «Комбинированная терапия» также может охватывать введение терапевтических средств, которые описаны выше, в другой комбинации с другими биологически активными ингредиентами. В том случае, когда комбинированная терапия дополнительно включает нелекарственное лечение, то нелекарственное лечение можно осуществлять в любое подходящее время при условии, что достигается целебный эффект от совместного действия комбинации терапевтических средств и нелекарственного лечения. Например, в подходящих случаях целебный эффект все еще достигается и тогда, когда нелекарственное лечение отделено по времени от введения терапевтических средств, может быть на несколько дней или даже недель.

Терапевтические или фармакологические композиции согласно настоящему изобретению, как правило, должны содержать эффективное количество активного компонента(ов) для терапии, растворенного или диспергированного в фармацевтически приемлемой среде. Фармацевтически приемлемые среды или носители включают любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотоничные и замедляющие всасывание агенты и тому подобное. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в терапевтические композиции согласно настоящему изобретению.

Приготовление фармацевтической или фармакологической композиции будет понятно специалистам в данной области в свете настоящего описания. Обычно такие композиции могут быть приготовлены в виде инъекционных средств, либо в виде жидких растворов, либо суспензий; твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией; в виде таблеток или других твердых препаратов для перорального введения; в виде капсул для высвобождения с течением времени или в виде любой другой формы, используемой в настоящее время, включая глазные капли, кремы, примочки, мази, средства для ингаляции и тому подобное. Также может быть полезным применение стерильных препаратов, таких как основанные на физиологическом растворе лосьоны, хирургами, терапевтами или медицинскими работниками для обработки конкретной области операционного поля. Композиции также могут быть доставлены посредством микроустройства, микрочастицы или губки.

После приготовления терапевтические средства должны вводить таким способом, который совместим с дозированным препаратом, и в таком количестве, которое является фармакологически эффективным. Препараты легко вводят в виде различных дозированных форм, например в виде инъекционных растворов, описанных выше, но также могут быть использованы капсулы, высвобождающие лекарственное средство, и тому подобное.

В данном контексте количество активного ингредиента и объем вводимой композиции зависит от животного-хозяина, подвергаемого лечению. Точные количества активного соединения, требуемые для введения, зависят от решения лечащего врача и являются индивидуальными для каждого субъекта.

Обычно используют минимальный объем композиции, требуемый для диспергирования активных соединений. Подходящие схемы введения также варьируют, но могут быть определены посредством первоначального введения соединения и наблюдения результатов и после этого назначением следующих контролируемых доз через определенные интервалы времени.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы {например, желатиновой капсулы) активный компонент лекарственного средства можно комбинировать с пероральным, нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и тому подобное. Кроме того, при желании или необходимости, в смесь также могут быть включены подходящие связывающие средства, скользящие вещества, дезинтегрирующие средства и красители. Подходящие связывающие агенты включают крахмал, алюмосиликат магния, крахмальную пасту, желатин, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, кукурузные подсластители, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакантовая камедь или альгинат натрия, полиэтиленгликоль, воски и тому подобное. Скользящие вещества в указанных дозированных формах включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, диоксид кремния, тальк, стеариновую кислоту, ее магниевую или кальциевую соль и/или полиэтиленгликоль и тому подобное. Дезинтегрирующие агенты включают без ограничения крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь, крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль или шипучие смеси и тому подобное. Разбавители включают, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицин.

Инъекционные композиции предпочтительно являются водными изотоничными растворами или суспензиями, а суппозитории преимущественно готовят из жировых эмульсий или суспензий. Композиции могут быть стерилизованными и/или могут содержать адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажнители или эмульгаторы, ускорители растворения, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества. Композиции готовят согласно обычным способам смешивания, гранулирования или получения покрытий соответственно, и обычно они содержат примерно от 0,1 до 75%, предпочтительно примерно от 1 до 50% активного ингредиента.

Соединения согласно изобретению также можно вводить в таких пероральных дозированных формах, как таблетки или капсулы с регулируемым по времени высвобождением и длительным высвобождением, пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, настои, суспензии, сиропы и эмульсии.

Жидкие, особенно инъекционные, композиции, могут быть, например, приготовлены растворением, диспергированием и т.д. Активное соединение растворяют или смешивают с фармацевтически чистым растворителем, таким, например, как вода, физиологический раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и тому подобные, с образованием таким образом инъекционного раствора или суспензии. Кроме того, могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения в жидкости перед инъекцией.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить во внутривенной (как в виде болюса, так и в виде инфузии), внутрибрюшинной, подкожной или внутримышечной форме, во всех случаях с использованием форм, хорошо известных специалистам в области фармации. Инъекционные препараты могут быть приготовлены в обычных формах, либо в виде жидких растворов, либо суспензий.

Парентеральное инъекционное введение обычно используют для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и инфузий. Кроме того, в одном из способов парентерального введения применяют имплантацию систем медленного высвобождения или длительного высвобождения, которые обеспечивают поддержание постоянного уровня дозы, согласно патенту США No. 3710795, включенному в данное описание в виде ссылки.

Кроме того, предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению можно вводить в интраназальной форме посредством местного применения подходящих интраназальных носителей, ингаляторов или посредством трансдермального пути, используя формы трансдермальных кожных пластырей, хорошо известные специалистам в данной области. При введении в форме трансдермальной системы доставки введение дозы, конечно, будет непрерывным, а не прерывистым на протяжении схемы дозирования. Другие предпочтительные местные препараты включают кремы, мази, примочки, аэрозольные спреи и гели, при этом концентрация активного ингредиента, как правило, может быть в диапазоне от 0,01% до 15% масс./масс. или масс./об.

В случае твердых композиций эксципиенты, которые можно использовать, включают фармацевтически чистые маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и тому подобное. Активное соединение, определенное выше, также может быть приготовлено в виде суппозиториев с использованием в качестве носителя, например, полиалкиленгликолей, например пропиленгликоля. В некоторых вариантах суппозитории преимущественно готовят из жировых эмульсий или суспензий.

Соединения согласно настоящему изобретению также можно вводить в форме систем доставки, основанных на липосомах, таких как малые однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах пленка липидных компонентов гидратирована водным раствором лекарственного средства с образованием липидного слоя, инкапсулирующего лекарственное средство, как описано в патенте США No. 5262564. Например, молекулы аптамеров, описанные в данной публикации, могут быть получены в виде комплекса с липофильным соединением или неиммуногенным, высокомолекулярным соединением, сконструированным с использованием способов, известных в данной области. Пример связанных с нуклеиновыми кислотами комплексов приведен в патенте США No. 6011020.

Соединения согласно настоящему изобретению также могут быть связаны с растворимыми полимерами в качестве носителей направляемых к мишени лекарственных средств. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропилметакриламидфенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный остатками пальмитоила. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению могут быть связаны с классом биоразрушаемых полимеров, применимых для достижения контролируемого высвобождения лекарственного средства, например с полимолочной кислотой, полиэпсилонкапролактоном, полигидроксимасляной кислотой, сложными полиортоэфирами, полиацеталями, полидигидропиранами, полицианоакрилатами и поперечно сшитыми или амфипатическими блок-сополимерами гидрогелей.

При желании вводимая фармацевтическая композиция также может содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажнители или эмульгаторы, буферные средства для поддержания pH и другие вещества, такие как, например, ацетат натрия и олеат триэтаноламина.

Схему дозирования с использованием аптамеров выбирают в соответствии с различными факторами, включая тип, вид, возраст, массу, пол и состояние здоровья пациента; тяжесть состояния, подвергаемого лечению; путь введения; функционирование почек и печени пациента и конкретный используемый аптамер или его соль. Опытный врач или ветеринар легко может определить и назначить эффективное количество лекарственного средства, необходимое для предотвращения, противодействия или задержки прогрессирования состояния.

Пероральные дозы согласно настоящему изобретению при использовании для получения указанных эффектов должны быть в диапазоне примерно от 0,05 до 7500 мг/сутки перорально. Композиции предпочтительно предлагают в форме таблеток с насечками, содержащих 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 и 1000,0 мг активного ингредиента. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены в виде одной суточной дозы или суммарная суточная доза может быть введена дробными дозами два, три или четыре раза в сутки.

Инфузионные дозы, интраназальные дозы и трансдермальные дозы должны быть в диапазоне от 0,05 до 7500 мг/сутки. Подкожные, внутривенные и внутрибрюшинные дозы должны быть в диапазоне от 0,05 до 3800 мг/сутки.

Эффективные уровни в плазме соединений согласно настоящему изобретению находятся в диапазоне от 0,002 мг/мл до 50 мг/мл.

Модулирование фармакокинетики и биораспределения терапевтических аптамеров

Важно, чтобы фармакокинетические свойства всех основанных на олигонуклеотидах терапевтических средств, содержащих аптамеры, были подогнаны так, чтобы они соответствовали требуемому фармацевтическому применению. Хотя в случае аптамеров, направленных против внеклеточных мишеней, не возникают трудности, связанные с внутриклеточной доставкой (как в случае с антисмысловыми средствами и терапевтическими средствами на основе РНК-и), такие аптамеры еще должны быть способными распределяться к органам и тканям-мишеням и сохраняться в организме (немодифицированными) в течение периода времени, соответствующего требуемой схеме дозирования.

Таким образом, настоящее изобретение относится к веществам и способам, позволяющим влиять на фармакокинетику композиций аптамеров и, в частности, на возможность регулировать фармакокинетику аптамеров. Возможность регулирования (т.е. возможность модулирования) фармакокинетики аптамеров достигается посредством конъюгирования модифицирующих остатков (например, полимеров ПЭГ) с аптамером и/или включения модифицированных нуклеотидов (например, 2'-фтор- или 2'-OMe-нуклеотидов), чтобы изменить химический состав нуклеиновой кислоты. Возможность регулировать фармакокинетику аптамера используют для усовершенствования существующих терапевтических применений или альтернативно для разработки новых терапевтических применений. Например, в случае некоторых терапевтических применений, например в случае противоопухолевого применения или в условиях неотложной помощи, когда может требоваться быстрый клиренс или прекращение действия лекарственного средства, желательно уменьшить время удержания аптамера в кровообращении. Альтернативно при других терапевтических применениях, например при поддерживающей терапии, когда требуется системная циркуляция терапевтического средства, может быть желательным увеличение времени удержания аптамеров в кровообращении.

Кроме того, возможность регулирования фармакокинетики аптамера используют для того, чтобы модифицировать биораспределение аптамерного терапевтического средства у субъекта. Например, при некоторых терапевтических применениях может требоваться изменение биораспределения аптамерного терапевтического средства, чтобы попытаться направить его к конкретному типу ткани или к специфичному органу (или группе органов). При таких применениях аптамерное терапевтическое средство предпочтительно накапливается в конкретной ткани или органе(ах). При других терапевтических применениях может быть необходимо направить средство к тканям, имеющим клеточный маркер или симптом, связанный с данным заболеванием, повреждение клеток или другую аномальную патологию, так чтобы аптамерное терапевтическое средство предпочтительно накапливалось в пораженной ткани. Например, как описано в одновременно находящейся на рассмотрении предварительной заявке на выдачу патента США с регистрационным No. 60/550790, поданной 5 марта 2004 и озаглавленной «Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics), пегилирование аптамерного терапевтического средства (например, пегилирование с использованием полимера ПЭГ с М.м. 20 кД) используют для направления средства к воспаленным тканям, так что пегилированное аптамерное терапевтическое средство предпочтительно накапливается в воспаленной ткани.

Чтобы определить профили фармакокинетики и биораспределения аптамерных терапевтических средств (например, конъюгатов аптамеров или аптамеров, имеющих измененный химический состав, например модифицированные нуклеотиды) регистрируют множество параметров. Такие параметры включают, например, время полужизни (t_1/2), клиренс из плазмы (Cl), объем распределения (Vss), площадь под кривой концентрация-время (AUC), максимальную наблюдаемую концентрацию в сыворотке или плазме (C_max) и среднее время удержания (MRT) композиции аптамера. В используемом в данном описании смысле термин «AUC» относится к площади под графиком концентрации аптамерного терапевтического средства в плазме против времени после введения аптамера. Значение AUC используют для оценки биодоступности (т.е. процентного содержания введенного аптамерного терапевтического средства в кровообращении после введения аптамера) и/или общего клиренса (Cl) (т.е. скорости, с которой аптамерное терапевтическое средство удаляется из кровообращения) данного аптамерного терапевтического средства. Объем распределения устанавливает отношение концентрации аптамерного терапевтического средства в плазме к количеству аптамера, присутствующего в организме. Чем больше Vss, тем больше аптамера обнаруживается вне плазмы (т.е. больше экстравазация).

Настоящее изобретение относится к веществам и способам модулирования контролируемым образом фармакокинетики и биораспределения стабилизированной композиции аптамера in vivo посредством конъюгирования аптамера с модифицирующим остатком, таким как низкомолекулярная, пептидная или полимерная концевая группа, или посредством включения модифицированных нуклеотидов в аптамер. Как указано в данном описании, конъюгирование модифицирующего остатка и/или изменение химического состава нуклеотидов изменяет основные аспекты, касающиеся времени удержания аптамера в циркуляции и распределения по тканям.

В дополнение к клиренсу с участием нуклеаз олигонуклеотидные терапевтические средства подвергаются удалению посредством почечной фильтрации. Как таковые, резистентные к нуклеазам олигонуклеотиды, вводимые внутривенно, обычно имеют время полужизни in vivo <10 мин, если фильтрация не может быть блокирована. Это можно осуществить либо обеспечением быстрого распределения из потока крови в ткани, либо увеличением кажущейся молекулярной массы олигонуклеотида до величины, превышающей эффективное отсечение по размеру в клубочках. Конъюгирование небольших терапевтических средств с полимером ПЭГ (пегилирование), описанное ниже, может значительно продлевать время удержания аптамеров в циркуляции, тем самым уменьшая частоту дозирования и повышая эффективность против сосудистых мишеней.

Аптамеры могут быть конъюгированы с различными модифицирующими остатками, такими как высокомолекулярные полимеры, например ПЭГ; пептиды, например, Tat (13-аминокислотный фрагмент белка Tat ВИЧ (Vives, et al. (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant (16-аминокислотная последовательность, полученная из третьей спирали гемеотического белка antennapedia у Drosophila (Pietersz, et al. (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) и Arg₇ (короткие положительно заряженные проникающие в клетки пептиды, состоящие из полиаргинина (Arg₇) (Rothbard, et al. (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J et al. (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); и малые молекулы, например липофильные соединения, такие как холестерин. Среди различных конъюгатов, описанных в данной публикации, свойства аптамеров in vivo сильнее всего изменяются при образовании комплексов с группами ПЭГ. Например, образование комплекса смешанного 2'-F- и 2'-OMe-модифицированного аптамерного терапевтического средства с полимером ПЭГ с М.м. 20 кД препятствует почечной фильтрации и стимулирует распределение аптамера как в здоровые, так и воспаленные ткани. Кроме того, подтверждено, что конъюгат полимер ПЭГ 20 кД-аптамер почти также эффективен, как и полимер ПЭГ 40 кД в предотвращении почечной фильтрации аптамеров. Хотя один из эффектов, которые оказывает пегилирование, направлен на клиренс аптамеров, продолжительное системное воздействие, оказываемое присутствием остатка с М.м. 20 кД, также способствует распределению аптамера в ткани, особенно в ткани хорошо перфузируемых органов и в ткани в месте воспаления. Конъюгат аптамера с полимером ПЭГ 20 кД направляет аптамер при распределении в место воспаления, так что пегилированный аптамер предпочтительно накапливается в воспаленной ткани. В некоторых случаях конъюгат аптамера с 20 кД-ПЭГ способен проходить внутрь клеток, таких как, например, клетки почки.

В общем, влияние на фармакокинетику и распределение аптамера в тканях, оказываемое низкомолекулярными модифицирующими остатками, включая холестерин и проникающие в клетки пептиды, менее выражено, чем эффекты в результате пегилирования или модификации нуклеотидов (например, измененного химического состава). Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что опосредованное холестерином связывание с липопротеинами плазмы, предположительно происходящее в случае антисмыслового конъюгата, исключается в конкретном контексте подвергнутой фолдингу структуры конъюгата аптамер-холестерин и/или имеет отношение к липофильной природе группы холестерина. Подобно холестерину присутствие на конце Tat-пептида стимулирует клиренс аптамера из потока крови, при этом сравнительно высокие уровни конъюгата появляются в почках через 48 час. Другие пептиды (например, Ant, Arg₇), которые как сообщалось в данной области, опосредуют прохождение макромолекул через клеточные мембраны in vitro, по-видимому, не стимулируют клиренс аптамера из циркуляции. Однако подобно Tat конъюгат Ant в значительной степени по сравнению с другими аптамерами накапливается в почках. Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что вероятно неблагоприятная презентация модифицирующих остатков пептидов Ant и Arg₇ в контексте трехмерно упакованных аптамеров in vivo ухудшает способность указанных пептидов влиять на транспортные свойства аптамеров.

Модифицированные нуклеотиды также могут быть использованы для модулирования клиренса аптамеров из плазмы. Например, неконъюгированный аптамер, который содержит стабилизирующие химические группы 2'-F и 2'-OMe, который является типичным представителем аптамеров современного поколения, так как он обладает высокой степенью стабильности по отношению к нуклеазам in vitro и in vivo, быстро исчезает из плазмы (т.е. имеет быстрый клиренс из плазмы) и имеет быстрое распределение в ткани, главным образом в почки, по сравнению с немодифицированным аптамером.

Нуклеиновые кислоты, дериватизированные ПЭГ

Как описано выше, дериватизация нуклеиновых кислот высокомолекулярными неиммуногенными полимерами дает возможность изменять фармакокинетические и фармакодинамические свойства нуклеиновых кислот, делая их более эффективными терапевтическими средствами. Предпочтительные изменения активности могут включать повышенную резистентность к разрушению нуклеазами, пониженную фильтрацию почками, меньшее влияние на иммунную систему и измененное распределение терапевтического средства в организме.

Композиции аптамеров согласно изобретению могут быть дериватизированы остатком полиалкиленгликоля («PAG»). Примеры PAG-дериватизированных нуклеиновых кислот приведены в заявке на выдачу патента США с регистрационным No. 10/718833, поданной 21 ноября 2003, которая включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Типичные полимеры, используемые в изобретении, включают поли(этиленгликоль) («ПЭГ»), также известный как поли(этиленоксид) («PEO») и полипропиленгликоль (включая полиизопропиленгликоль). Кроме того, во многих применениях могут быть использованы случайные или блок-сополимеры разных алкиленоксидов (например, этиленоксида и пропиленоксида). В наиболее общей форме полиалкиленгликоль, такой как ПЭГ, является линейным полимером, заканчивающимся на каждом конце гидроксильными группами: HO-CH₂CH ₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂ CH₂-OH. Такой полимер, альфа-, омега-дигидроксилполи(этиленгликоль), также можно представить в виде HO-ПЭГ-OH, где подразумевают, что символ -ПЭГ- означает следующую структурную единицу: -CH ₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n -CH₂CH₂-, где n обычно находится в диапазоне примерно от 4 до примерно 10000.

Как показано, молекула ПЭГ является бифункциональной и ее иногда называют «ПЭГ-диол». Концевыми частями молекулы ПЭГ являются относительно химически неактивные гидроксильные остатки, OH-группы, которые могут быть активированы или превращены в функциональные остатки для связывания ПЭГ с другими соединениями в активных участках соединения. Такие активированные ПЭГ-диолы в данном описании называют биактивированными ПЭГ. Например, концевые остатки ПЭГ-диола были функционализированы в виде активного сложного карбонатного эфира для избирательного взаимодействия с аминоостатками замещением относительно неактивных гидроксильных остатков, -OH, на активные сложноэфирные остатки сукцинимидила из N-гидроксисукцинимида.

Во многих случаях применения желательно кэпировать молекулу ПЭГ на одном конце по существу неактивным остатком, так чтобы молекула ПЭГ был монофункциональной (или моноактивированной). В случае терапевтических белков, которые обычно имеют множество сайтов взаимодействия с активированными ПЭГ, бифункциональные активированные ПЭГ приводят к обширному поперечному сшиванию, давая недостаточно функциональные агрегаты. Чтобы создать моноактивированные ПЭГ, один гидроксильный остаток на конце молекулы ПЭГ-диола обычно замещают неактивной концевой метоксигруппой, -OCH₃. Другой, некэпированный конец молекулы ПЭГ обычно превращают в активный концевой остаток, который может быть активирован для связывания с активным участок на поверхности или с такой молекулой, как белок.

PAG являются полимерами, которые обычно обладают свойствами растворимости в воде и во многих органических растворителях, не обладают токсичностью и являются неиммуногенными. Одно из применений PAG заключается в ковалентном связывании полимера с нерастворимыми молекулами, чтобы сделать полученный в результате «конъюгат» PAG-молекула растворимым. Например, было показано, что не растворимое в воде лекарственное средство паклитаксел при связывании с ПЭГ становится водорастворимым. Greenwald, et al., J. Org. Chem., 60: 331-336 (1995). Конъюгаты PAG часто используют не только для повышения растворимости и стабильности, но также для увеличения времени полужизни молекул в кровообращении.

Полиалкилированные соединения согласно изобретению обычно имеют размер от 5 до 80 кД, однако можно использовать любой размер, выбор зависит от аптамера и применения. Другие соединения PAG согласно изобретению имеют размер от 10 до 80 кД. Другие соединения PAG согласно изобретению имеют размер от 10 до 60 кД. Например, полимер PAG может иметь размер по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 80 кД. Такие полимеры могут быть линейными или разветвленными.

В отличие от биологически экспрессированных терапевтических белков терапевтические нуклеиновые кислоты обычно химически синтезируют из активированных мономеров нуклеотидов. Конъюгаты ПЭГ-нуклеиновая кислота могут быть получены введением ПЭГ с использованием такого же повторяющегося синтеза из мономеров. Например, ПЭГ, активированные превращением в фосфорамидитную форму, могут быть введены в ходе твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Альтернативно синтез олигонуклеотидов может заканчиваться сайт-специфичным включением активного сайта связывания ПЭГ. В большинстве случаев это можно осуществить добавлением свободного первичного амина к 5'-концу (вводимого с использованием модифицированного фосфорамидита на последней стадии связывания в ходе твердофазного синтеза). Используя указанный способ, активный ПЭГ (например, ПЭГ, который активируют так, чтобы он взаимодействовал и образовывал связь с амином) объединяют с очищенным олигонуклеотидом и реакцию связывания осуществляют в растворе. В некоторых вариантах полимеры представляют собой разветвленные молекулы ПЭГ. В следующих вариантах полимеры представляют собой разветвленный ПЭГ с М.М. 40 кД, см., например, (1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])-пропил-2-(4'-бутамид), изображенный на фиг.4. В некоторых вариантах разветвленный 40 кД-ПЭГ (1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-2-(4'-бутамид) связывают с 5'-концом аптамера, как изображено на фиг.5.

Способность ПЭГ-конъюгатов изменять биораспределение терапевтического средства связана с рядом факторов, включая кажущийся размер (например, измеряемый в виде гидродинамического радиуса) конъюгата. Известно, что более крупные конъюгаты (>10 кД) более эффективно блокируют фильтрацию почками и, следовательно, увеличивают время полужизни в сыворотке небольших макромолекул (например, пептидов, антисмысловых олигонуклеотидов). Показано что способность ПЭГ-конъюгатов блокировать фильтрацию возрастает с увеличением размера ПЭГ примерно до 50 кД (дальнейшее увеличение имеет минимальное целебное действие, так как определяющим время полужизни становится опосредованный макрофагами метаболизм, а не элиминация через почки).

Получение ПЭГ с высокой молекулярной массой (>10 кД) может быть трудным, неэффективным и дорогостоящим. В качестве пути синтеза конъюгатов высокомолекулярный ПЭГ-нуклеиновая кислота, предыдущая работа была сфокусирована на создании активированных ПЭГ с высокой молекулярной массой. Один из способов создания таких молекул заключается в образовании разветвленного активированного ПЭГ, в котором два или более ПЭГ связаны с центральным ядром, несущим активированную группу. Концевые части таких молекул ПЭГ с высокой молекулярной массой, т.е. относительно неактивные гидроксильные (-OH) остатки, могут быть активированы или превращены в функциональные остатки для связывания одного или нескольких ПЭГ с другими соединениями в активных участках соединения. Разветвленные активированные ПЭГ должны иметь более двух концов, и в случаях, когда два или более конца активированы, такие активированные молекулы ПЭГ с высокой молекулярной массой называют в данном описании мультиактивированными ПЭГ. В некоторых случаях не все концы в разветвленной молекуле ПЭГ активированы. В случаях, когда активированы любые два конца разветвленной молекулы ПЭГ, такие молекулы ПЭГ называют биактивированными ПЭГ. В некоторых случаях, когда активирован только один конец в разветвленной молекуле ПЭГ, такие молекулы ПЭГ называют моноактивированными. В качестве примера такого способа описан активированный ПЭГ, полученный связыванием двух монометокси-ПЭГ с лизиновым ядром, который затем активируют для взаимодействия (Harris et al., Nature, vol. 2: 214-221, 2003).

Настоящее изобретение относится к другому рентабельному пути синтеза конъюгатов высокомолекулярный ПЭГ-нуклеиновая кислота (предпочтительно аптамер), включая многократно пегилированные нуклеиновые кислоты. Настоящее изобретение также охватывает связанные с ПЭГ мультимерные олигонуклеотиды, например димеризованные аптамеры. Настоящее изобретение также относится к композициям с высокой молекулярной массой, в которых стабилизирующий остаток ПЭГ представляет собой линкер, который разделяет разные части аптамера, например, ПЭГ конъюгируют в одну последовательность аптамера, так чтобы линейное расположение высокомолекулярной композиции аптамера было, например, нуклеиновая кислота - ПЭГ - нуклеиновая кислота (- ПЭГ - нуклеиновая кислота)_n , где n больше или равно 1.

Высокомолекулярные композиции согласно изобретению включают композиции, имеющие молекулярную массу по меньшей мере 10 кД. Композиции обычно имеют молекулярную массу от 10 до 80 кД. Высокомолекулярные композиции согласно изобретению имеют размер по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 80 кД.

Стабилизирующим остатком является молекула или часть молекулы, которая улучшает фармакокинетические и фармакодинамические свойства композиции аптамера с высокой молекулярной массой согласно изобретению. В некоторых случаях стабилизирующим остатком является молекула или часть молекулы, которая делает два или более аптамеров или доменов аптамеров пространственно близкими или обеспечивает пониженную общую свободу вращения композиции аптамера с высокой молекулярной массой согласно изобретению. Стабилизирующим остатком может быть полиалкиленгликоль, например полиэтиленгликоль, который может быть линейным или разветвленным, гомополимером или гетерополимером. Другие стабилизирующие остатки включают такие полимеры, как пептидонуклеиновые кислоты (PNA). Олигонуклеотиды также могут быть стабилизирующими остатками; такие олигонуклеотиды могут содержать модифицированные нуклеотиды и/или модифицированные связи, такие как фосфоротиоаты. Стабилизирующий остаток может быть составной частью композиции аптамера, т.е. его ковалентно связывают с аптамером.

Композиции согласно изобретению включают композиции аптамера с высокой молекулярной массой, в которых два (или более) остатка нуклеиновой кислоты ковалентно конъюгированы по меньшей мере с одним остатком полиалкиленгликоля. Остатки полиалкиленгликоля служат в качестве стабилизирующих остатков. Говорят, что к композиции, в которой остаток полиалкиленгликоля ковалентно связан каждым концом с аптамером, так что полиалкиленгликоль связывает остатки нуклеиновой кислоты вместе в одну молекулу, полиалкиленгликоль является связывающим остатком. В таких композициях первичная структура ковалентной молекулы имеет линейное расположение нуклеиновая кислота-PAG-нуклеиновая кислота. Одним из примеров является композиция, имеющая первичную структуру нуклеиновая кислота-ПЭГ-нуклеиновая кислота. Другим примером является линейное расположение: нуклеиновая кислота - ПЭГ - нуклеиновая кислота - ПЭГ - нуклеиновая кислота.

Чтобы получить конъюгат нуклеиновая кислота - ПЭГ - нуклеиновая кислота, нуклеиновую кислоту исходно синтезируют так, чтобы она несла один активный участок (например, она является моноактивированной). В предпочтительном варианте таким активным участком является аминогруппа, введенная в 5'-конец присоединением модифицированного фосфорамидита в качестве последней стадии твердофазного синтеза олигонуклеотида. После удаления защиты и очистки модифицированного олигонуклеотида его перерастворяют в высокой концентрации в растворе, что минимизирует гидролиз активированного ПЭГ. В предпочтительном варианте концентрация олигонуклеотида составляет 1 мМ, и полученный раствор содержит 200 мМ NaHCO₃-буфера, pH 8,3. Синтез конъюгата начинают медленным поэтапным добавлением высокоочищенного бифункционального ПЭГ. В предпочтительном варианте ПЭГ-диол активируют на обоих концах (биактивированный) дериватизацией сукцинимидилпропионатом. После взаимодействия конъюгат ПЭГ-нуклеиновая кислота очищают гель-электрофорезом или жидкостной хроматографией, чтобы разделить полностью, частично или неконъюгированные виды. Множественные соединенные в цепочки молекулы PAG (например, в виде случайных или блок-сополимеров) или меньшие по размеру цепи PAG могут быть связаны для получения различной длины (или молекулярной массы). Между цепями PAG различной длины можно использовать линкеры, не являющиеся PAG.

2'-OMe, 2'-фтор и другие модификации нуклеотидов стабилизируют аптамер по отношению к нуклеазам и увеличивают время его полужизни in vivo. Кэп 3'-3'-dT также увеличивает резистентность к нуклеазам. См., например, патенты США 5674685, 5668264, 6207816 и 6229002, каждый из которых включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме.

PAG-дериватизация химически активной нуклеиновой кислоты

Конъюгаты PAG-нуклеиновая кислота-PAG с высокой молекулярной массой могут быть получены в результате взаимодействия монофункционального активированного ПЭГ с нуклеиновой кислотой, содержащей более одного химически активного участка. В одном варианте нуклеиновая кислота является биактивной или биактивированной и содержит два активных участка: 5'-аминогруппу и 3'-аминогруппу, введенную в олигонуклеотид посредством обычного синтеза фосфорамидита, например: 3'-5'-дипегилирование, которое показано на фиг.6. В альтернативных вариантах активные участки могут быть введены во внутренние положения с использованием, например, 5-положения пиримидинов, 8-положения пуринов или 2'-положения рибозы в качестве участков связывания первичных аминов. В таких вариантах нуклеиновая кислота может иметь несколько активированных или активных участков, и говорят, что она многократно активирована. После синтеза и очистки модифицированный олигонуклеотид объединяют с моноактивированным ПЭГ в условиях, которые стимулируют избирательное взаимодействие с активными участками олигонуклеотида, при этом минимизируя спонтанный гидролиз. В предпочтительном варианте монометокси-ПЭГ активируют сукцинимидилпропионатом и реакцию связывания осуществляют при pH 8,3. Для стимуляции синтеза двухзамещенных ПЭГ обеспечивают стехиометрический избыток ПЭГ по сравнению с олигонуклеотидом. После взаимодействия конъюгат ПЭГ-нуклеиновая кислота очищают гель-электрофорезом или жидкостной хроматографией, чтобы разделить полностью, частично или неконъюгированные виды.

Связывающие домены также могут иметь один или несколько связанных с ними остатков полиалкиленгликоля. Такие PAG могут иметь разную длину и могут быть использованы в подходящих комбинациях для получения требуемой молекулярной массы композиции.

Влияние конкретного линкера может зависеть как от его химического состава, так и от длины. Линкер, который является слишком длинным, слишком коротким или вступает в неблагоприятные стерические и/или ионные взаимодействия с мишенью, будет препятствовать образованию комплекса между аптамером и мишенью. Линкер, который является более длинным, чем необходимо, чтобы покрыть расстояние между нуклеиновыми кислотами, может уменьшать стабильность связывания в результате снижения эффективной концентрации лиганда. Таким образом, часто бывает необходимо оптимизировать состав и длину линкера, чтобы максимизировать аффинность аптамера по отношению к мишени.

Все публикации и патентные документы, цитированные в данном описании, включены в данное описание в виде ссылки также как в случае, когда специально указано, что каждая такая публикация или документ включены в данное описание в виде ссылки. Подразумевают, что цитирование публикаций и патентных документов не является допущением того, что любой из них является материалом, относящимся к предшествующему уровню техники, при этом цитирование также не является допущением ни в отношении содержания, ни в отношении даты. На основании приведенной в письменном виде характеристики изобретения специалистам в данной области будет понятно, что изобретение может быть осуществлено на практике в различных вариантах и что приведенное выше описание и приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения формулы изобретения, которая следует далее.

ПРИМЕР 1

Активность анти-C5-аптамера в классическом и альтернативном путях комплемента

Пример 1A: Анализ гемолиза

В тесте CH50 измеряют способность системы комплемента в тестируемом образце сыворотки лизировать 50% клеток в стандартизованной суспензии покрытых антителами эритроцитов барана. Раствор 0,2% сыворотки человека смешивали с покрытыми антителами эритроцитами барана (Diamedix EZ набор для анализа комплемента CH50, Diamedix Corp., Miami, FL) в присутствии или в отсутствие различных анти-C5-аптамеров. Анализ проводили согласно протоколу, прилагаемому к набору, в забуференном вероналом физиологическом растворе, содержащем кальций, магний и 1% желатин (буфер для комплемента GVB⁺⁺) и инкубировали в течение 30 минут при 37°C. После инкубации образцы центрифугировали, чтобы осадить интактные эритроциты. Регистрировали оптическую плотность надосадка при 412 нм (OD ₄₁₂), чтобы количественно оценить высвобождение растворимого гемоглобина, которое пропорционально степени гемолиза (Green et al., (1995) Chem. Biol. 2: 683-95). Чтобы подтвердить, что аптамеры блокировали активацию C5, некоторые надосадки после гемолиза анализировали в отношении присутствия C5a и C5b-9 с помощью ELISA (набор для ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA; набор для ELISA C5a, BD Biosciences, San Diego, CA), следуя протоколам, прилагаемым к наборам для ELISA.

Добавление непегилированного анти-C5-аптамера (ARC186) (SEQ ID NO: 4) к реакционной смеси ингибировало гемолиз зависимым от дозы образом, как показано на графике, представленном на фиг.7A, с IC₅₀, составляющей 0,5±0,1 нМ (см. фиг.7B), значение, которое согласуется с K_D, определяемой фильтрацией на нитроцеллюлозе. При очень высоких концентрациях аптамера (>10 нМ) степень гемолиза существенно не отличается от фона (без добавления сыворотки), свидетельствуя о том, что ARC186 (SEQ ID NO: 4) способен полностью блокировать активность комплемента. Конъюгирование аптамера ARC186 (SEQ ID NO: 4) с 20 кД- (ARC657; SEQ ID NO: 61), 30 кД- (ARC658; SEQ ID NO: 62), разветвленным 40 кД (1,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-2-(4'-бутамидом) (ARC187; SEQ ID NO: 5), разветвленным 40 кД (2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])-пропил-1-карбамоилом) (ARC1905; SEQ ID NO: 67), линейной 40 кД- (ARC1537; SEQ ID NO: 65) и линейной 2Ч20 кД- (ARC 1730; SEQ ID NO: 66) группами ПЭГ мало влияло на ингибирующую активность аптамера в анализе гемолиза CH50 (фиг.7A-фиг.7D).

В дополнительном исследовании ингибирующую активность пегилированного анти-C5-аптамера ARC1905 (разветвленный 40 кД (2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоил); SEQ ID NO: 67) сравнивали с его непегилированным предшественником ARC672 (SEQ ID NO: 63), который содержит концевой 5'-амин, в анализе гемолиза CH50, описанном выше. Раствор сыворотки человека (Innovative Research, Southfield, MI) смешивали с покрытыми антителами эритроцитами барана (Diamedix EZ набор для комплемента CH50, Diamedix Corp., Miami, FL) в присутствии или в отсутствие различных концентраций ARC1905 и ARC627 соответственно, так чтобы конечная концентрация сыворотки в каждом анализе составляла 0,1%, и анализ проводили согласно протоколу, рекомендованному производителем. Реакционные смеси для гемолиза инкубировали в течение 1 часа при 37°C при встряхивании, чтобы гарантировать, что клетки оставались в суспензии. В конце инкубации интактные клетки осаждали центрифугированием (2000 об/мин, 2 мин, при комнатной температуре), 200 мкл надосадка переносили в полистироловый планшет с плоским дном (VWR, № в каталоге 62409-003). Регистрировали оптическую плотность надосадка при 415 нм (OD₄₁₅), чтобы количественно оценить высвобождение растворимого гемоглобина. Измеряемое ингибирование в % при каждой концентрации аптамера рассчитывали, используя уравнение % ингибирования = 100 - 100 Ч (A_{образца} - A_{без сыворотки})/(A_{без аптамера} - A _{без сыворотки}), где A_{образца} означает оптическую плотность образца при разных концентрациях аптамера, A_{без сыворотки} означает оптическую плотность вследствие фонового гемолиза в отсутствие сыворотки (контроль 100% ингибирования) и A_{без аптамера} означает оптическую плотность вследствие основной активности комплемента в отсутствие аптамера (контроль 0% ингибирования). Значения IC₅₀ определяли на основании графика ингибирования в % против [ингибитора], используя уравнение % ингибирования = (% ингибирования)_{максимальный} Ч [ингибитор]ⁿ/(IC₅₀ ⁿ + [ингибитор]ⁿ) + фон. Значения IC₉₀ и IC₉₉ рассчитывали на основе значений IC₅₀, используя уравнения IC₉₀ = IC ₅₀ Ч [90/(100-90]^1/n и IC₉₀ = IC ₅₀ Ч [99/(100-99]^1/n. Значения IC₅₀ для ARC1905 и ARC627 в данном параллельном исследовании составляли 0,648±0,0521 и 0,913±0,0679 соответственно (см. также фиг.58), что дополнительно подтверждает, что пегилирование мало влияет или совсем не влияет на функцию аптамера.

Анализ ELISA надосадков после гемолиза показал, что такое функциональное ингибирование коррелировало с блокадой высвобождения C5a. Таким образом, данные гемолиза показывают, что ARC186 (SEQ ID NO: 4) и его пегилированные конъюгаты являются очень сильными ингибиторами комплемента, которые функционируют, блокируя катализируемую конвертазой активацию C5.

Анализы гемолиза с использованием непегилированного материала показали, что анти-C5-аптамер перекрестно не взаимодействует с C5 нескольких видов, отличных от приматов, включая крысу, морскую свинку, собаку и свинью. Однако значительную ингибирующую активность наблюдали при скрининге сыворотки приматов, включая сыворотку макак-крабоедов, макак-резус и шимпанзе. Эффективность анти-C5-аптамера in vitro дополнительно исследовали на сыворотке макак-крабоедов, используя ARC658 (SEQ ID NO: 62), содержащий 30 кД-ПЭГ аналог ARC186 (SEQ ID NO: 4). При параллельном сравнении (n=3) ARC658 ингибировал активность комплемента человека с IC ₅₀ 0,21±0,0 нМ, а активность комплемента макак-крабоедов с IC₅₀ 1,7±0,4 нМ (фиг.8). Таким образом ARC658 (SEQ ID NO: 62) в 8±3 раза слабее действует в сыворотке макак-крабоедов по сравнению с сывороткой человека при таком измерении.

В родственном исследовании исследовали влияние анти-C5-аптамера, пегилированного разветвленным 40 кД (2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоилом), ARC1905 (SEQ ID NO: 67), на активацию классического пути комплемента, которую анализировали по гемолизу эритроцитов барана, в присутствии сыворотки человека (Innovative Research, Southfield, MI), макаки-крабоеда (Bioreclamation, Hicksville, NY) или крысы (Bioreclamation, Hicksville, NY). Указанные анализы проводили в сильно разбавленной сыворотке, 0,1% в случае сыворотки человека и макаки-крабоеда и 0,3% в случае сыворотки крысы, в таких же условиях, как условия, используемые для сравнения ингибирующего действия ARC1905 по сравнению с ARC672 на гемолиз эритроцитов барана, как описано выше. При параллельном сравнении полное ингибирование (90-99%) активности комплемента in vitro можно было достичь при использовании ARC1905 как в сыворотке человека, так и в сыворотке макаки-крабоеда, тогда как ARC1905 проявляет слабую или не проявляет специфичной ингибирующей активности в образце комплемента крысы (Фиг.59A). Подобно ARC658, ARC1905 был в ~10 раз слабее против активности комплемента макаки-крабоеда в условиях анализа, что нашло отражение в значениях IC₉₀ и IC₉₉, указанных на фиг.59B.

Анализы связывания на нитроцеллюлозных фильтрах

Отдельные аптамеры метили ³²P на 5'-конце посредством инкубации с -³²P-ATP и полинуклеотидкиназой (New England Biolabs, Beverly, MA). Радиоактивно-меченный аптамер очищали от свободного ATP гель-фильтрацией с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле. Чтобы измерить аффинность анти-C5-аптамера радиоактивно меченный аптамер ( 10 пМ) инкубировали с возрастающими концентрациями (0,05-100 нМ) очищенного белка C5 (Quidel, San Diego, CA) в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 мМ MgCl₂, при комнатной температуре (23°C) и при 37°C в течение временных интервалов 15 мин и 4 часа. Реакции связывания анализировали фильтрацией через нитроцеллюлозу, используя 96-луночный коллектор для вакуумного дот-блот-фильтрования Minifold I (Schleicher and Schuell, Keene, NH). Использовали трехслойный фильтрующий материал, состоящий (сверху вниз) из нитроцеллюлозы Protran (Schleicher and Schuell), нейлона Hybond-P (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) и бумаги для блоттинга из геля GB002 (Schleicher and Schuell). Нитроцеллюлозный слой, который избирательно связывает белок по сравнению с нуклеиновой кислотой, предпочтительно удерживал анти-C5-аптамер в комплексе с белком-лигандом, тогда как не образовавший комплекса анти-C5-аптамер проходил через нитроцеллюлозу и прилипал к нейлону. Бумагу для блоттинга из геля применяли просто в качестве подложки для других фильтров. После фильтрования слои фильтра разделяли, сушили и подвергали скринингу в отношении фосфора (Amersham Biosciences) и количественно оценивали, используя систему визуализации блотов Storm 860 Phosphorimager® (Amersham Biosciences).

Как показано на фиг.9 и 10, возрастающие концентрации C5 увеличивают долю ARC186, улавливаемого на нитроцеллюлозной мембране. Зависимость количества связанного ARC186 от возрастающих концентраций C5 хорошо описывается моделью связывания в одном участке (C5+ARC186 C5 ARC186; % связанного = C_max/(1+K_D /[C5]); C_max означает максимальный % связанного при насыщении [C5]; K_D означает константу диссоциации). Кривые связывания ARC186 при двух температурах либо после 15 мин, либо после 4 час инкубации показаны на фиг.9 и 10 соответственно. После 15-минутной инкубации кривые связывания ARC186 при 23 и 37°C по существу не отличаются, отличия находятся в пределах ошибки, соответствуя значениям K_D 0,5-0,6 нМ (Фиг.9). Различия между кривыми связывания при 23 и 37°C становятся более выраженными при удлинении времени инкубации. После 4-часовой инкубации (фиг.10) K_D, наблюдаемая при 23°C, снижается до 0,08±0,01 нМ, тогда как K_D, наблюдаемая при 37°C, остается неизменной (0,6±0,1 нМ).

Чтобы обосновать потребность в длительной инкубации при комнатной температуре, аффинность при данной температуре дополнительно исследовали, используя кинетические способы. Скорость обратной реакции, описывающей диссоциацию C5 ARC186, равна v_rev = k_-1[C5 ARC186], где v_rev означает скорость (единицы М·мин^-1) и k_-1 означает константу скорости диссоциации первого порядка (единицы мин^-1 ). Скорость прямой реакции, описывающей образование комплекса C5 ARC186, равна V_for = k₁[C5][ARC186], где V_for означает скорость (единицы М·мин ^-1) и k₁ означает константу скорости ассоциации второго порядка (единицы М·мин^-1). Данные анализировали, используя аппроксимацию псевдопервого порядка, где концентрация одного реагента (в данном случае C5) поддерживается в большом избытке по сравнению с другим ([C5]>>[ARC186] и, таким образом, остается по существу неизменной в ходе реакции. В указанных условиях прямая реакция описывается уравнением скорости для процесса первого порядка, V_for=k₁'[ARC 186], где k₁'=k₁[C5].

Чтобы проанализировать диссоциацию C5-ARC186, радиоактивно меченный ARC186 ( 10 пМ) предварительно уравновешивали с 5 нМ белка C5 в фосфатно-солевом буферe, содержащем 1 мМ MgCl₂, при комнатной температуре (23°C). Реакцию диссоциации инициировали добавлением немеченого ARC186 (1 мкМ), который действует в качестве ловушки для свободного C5, и останавливали фильтрованием через нитроцеллюлозу, разделяющим связанный и свободный радиоактивно меченный ARC186. Временной ход диссоциации ARC186 получали, варьируя продолжительность периода между инициацией реакции диссоциации и фильтрованием. Временной ход диссоциации, выявляемый в виде снижения процента радиоактивно меченного ARC186, улавливаемого на нитроцеллюлозном фильтре (равного проценту связанного с C5), хорошо описывается одноэкспоненциальным распадом, где % связанного ARC186= (см. фиг.11). Значение константы скорости диссоциации, k_-1, определяемое данным способом, составляет 0,013±0,02 мин^-1, что соответствует времени полужизни (t _1/2=ln2/k_-1) 53±8 мин.

Чтобы проанализировать реакцию ассоциации, измеряли равновесную константу скорости (k_eq) образования C5 ARC186 в присутствии различных концентраций белка C5 (1-5 нМ). Образование комплекса инициировали смешиванием вместе белка C5 и радиоактивно меченого ARC186 в PBS, содержащем 1 мМ MgCl ₂, при комнатной температуре (23°C) и останавливали разделением с помощью фильтрования через нитроцеллюлозу. Как описано для реакций диссоциации, временной ход образования комплекса получали, варьируя продолжительность периода между инициацией реакции и фильтрованием. Временной ход установления равновесия, наблюдаемый в виде увеличения процента радиоактивно меченного ARC186, улавливаемого на нитроцеллюлозном фильтре, хорошо описывается одноэкспоненциальным распадом, где % связанного ARC186= . Временной ход установления равновесия для 1, 2 и 4 нМ C5 показан на фиг.12. Как предполагалось, значение k_eq возрастает линейно с увеличением [C5] (k_eg (1 нМ)=0,19±0,02 мин^-1; k_eq (2 нМ)=0,39±0,03 мин ^-1; k_eq (3 нМ)=0,59±0,05 мин^-1 ; k_eq (4 нМ)=0,77±0,06 мин^-1; k _eq (5 нМ)=0,88±0,06 мин^-1). В условиях эксперимента имеет место следующая взаимосвязь между k_eq , k₁ и k_-1: k_eq=k₁ [C5]+k_-1. Таким образом, оценку k₁ получают исходя из наклона графика зависимости k_eq от [C5] (см. вставку на фиг.12), в данном случае 0,18±0,01 нМ ^-1·мин^-1.

Приведенные данные свидетельствуют, что в условиях низкой концентрации C5 (например, 0,1 нМ) требуется длительная инкубация, чтобы достичь равновесия для смеси C5 и радиоактивно меченного ARC186. В указанных условиях k_eg=(0,18±0,01 нМ^-1·мин^-1 ) (0,1 нМ)+0,013 мин^-1=0,03 мин^-1, соответствуя времени полужизни 22 мин. Таким образом требуется инкубация около 2 часов при комнатной температуре (~5 времен полужизни) для полного (>95%) равновесия. При коротком периоде инкубации (например, 15 мин) будет существенная недооценка действительной аффинности комплекса, как показано выше в виде различия аффинностей, наблюдаемых для 15-минутной инкубации (K_D=0,5 нМ) по сравнению с 4-часовой инкубацией (K_D=0,08 нМ). Альтернативная оценка K_D при комнатной температуре может быть рассчитана на основе кинетических данных согласно зависимости K_D =k_-1/k₁. В данном случае рассчитанная K _D составляет 0,07±0,01 нМ, что полностью соответствует K_D, определенной выше термодинамическими способами.

Специфичность ARC186 (SEQ ID NO: 4) для C5 также оценивали в анализе фильтрования через нитроцеллюлозу посредством сравнения с компонентами комплемента, расположенными выше и ниже C5 в каскаде комплемента. Очищенные белки человека и комплексы белков приобретали из Complement Technologies (Tyler, TX), включая: C1q ( № в каталоге A099.18; 2,3 мкМ), C3 ( № в каталоге A113c.8; 27 мкМ), C5 ( № в каталоге A120.14; 5.4 мкМ), C5a des-Arg ( № в каталоге A145.6; 60 мкМ), sC5b-9 ( № в каталоге A127.6; 1 мкМ), фактор B ( № в каталоге A135.12; 11 мкМ) и фактор H ( № в каталоге A137.13P; 6,8 мкМ). Реакции связывания проводили, осуществляя серийные разведения белка в PBS плюс 1 мМ MgCl ₂, 0,02 мг/мл БСА и 0,002 мг/мл тРНК, инкубируя в течение 1-4 часов при 25°C или 37°C, и затем применяли устройство для фильтрования через нитроцеллюлозу, как описано выше. Константы диссоциации K_D определяли на основании полулогарифмических графиков зависимости % связывания на нитроцеллюлозе от [C5] посредством подгонки данных к уравнению: % связывания на нитроцеллюлозе = амплитуда × [C5]/(K_D+[C5]).

Результаты, изображенные на фиг.13, показывают, что аптамер по существу не узнает C5a (K_D>>3 мкМ), хотя он проявляет слабую аффинность по отношению к растворимому C5b-9 (K_D>0,2 мкМ), по-видимому, вследствие взаимодействий с компонентом C5b. Другие компоненты комплемента проявляют от умеренной до слабой аффинности по отношению к аптамеру. Неактивированный C3 по существу не связывается с аптамером; однако фактор H (K_D~100 нМ) и во много раз в меньшей степени C1q (K_D>0,3 мкМ) связываются. Вместе взятые данные показывают, что ARC186 (SEQ ID NO: 4) связывается с высокой аффинностью с C5 человека, главным образом посредством узнавания домена C5b. Таким образом, ARC186 и его пегилированные производные, например ARC1905, не должны мешать образованию C3b, который является важным для опсонизации бактерий, или естественной регуляции активации C регуляторными факторами.

Конъюгирование аптамеров с остатками ПЭГ с высокой молекулярной массой создает возможность для стерических помех, приводящих к пониженной аффинности. ПЭГ-модифицированные аптамеры трудно оценивать в отношении прямого связывания при анализе фильтрования через нитроцеллюлозу вследствие тенденции таких аптамеров прилипать к нитроцеллюлозе даже в отсутствие белка-мишени. Однако относительные аффинности таких аптамеров можно оценить на основании их сравнительной способности конкурировать с радиоактивно-меченным непегилированным аптамером ( 10 пМ) за связывание с мишенью, которое измеряют посредством анализа на основе фильтрования через нитроцеллюлозу, известного как анализ конкурентного связывания, проводимого при 37°C. По мере того как концентрация холодного (т.е. не меченного радиоактивно) конкурента увеличивается, процент радиоактивно меченного аптамера, связанного с белком-мишенью, уменьшается. Как показано на фиг.14, возрастающие концентрации холодного ARC186 (SEQ ID NO: 4) или пегилированного аптамера (ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5)) (0,05-1000 нМ) легко конкурируют с радиоактивно меченным ARC186 (SEQ ID NO: 4) за связывание в присутствии 2 нМ белка C5. Кроме того, кривые титрования для всех четырех аптамеров почти перекрываются, свидетельствуя что ПЭГ-конъюгирование в случае ARC657, ARC658 и ARC187 мало влияет или совсем не влияет на аффинность аптамера по отношению к C5.

В сходном исследовании тестировали влияние ПЭГ-конъюгирования на связывание с C5 посредством сравнения ARC672 (ARC186 с 5'-концевым амином; SEQ ID NO: 63) с ARC1905 (ARC627, конъюгированный с разветвленным ПЭГ 40 кД (2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])-пропил-1-карбамоилом)), используя анализ конкурентного связывания. 10 мкМ исходные растворы каждого аптамера готовили в PBS плюс 1 мМ MgCl₂, 0,01 мг/мл БСА, 0,002 мг/мл тРНК и серийно разводили, чтобы получить серию 10 образцов, охватывающих >100-кратный диапазон концентрации аптамера. Затем аликвоты объемом 12 мкл каждого образца добавляли в 96-луночный планшет к 96 мкл радиоактивно меченного ³² P ARC186, чтобы получить 1,1 × раствор метки и холодного конкурента. Затем 90 мкл раствора метки/конкурента добавляли к 10 мкл 10× белка C5, чтобы инициировать реакции. Конечную концентрацию радиоактивно-меченного ARC186 в каждой реакции поддерживали постоянной. Реакционные смеси для связывания уравновешивали в течение 15-30 мин при 37°C и затем фильтровали в устройстве с нитроцеллюлозными фильтрами, описанном выше. В целях анализа данных холодные конкурентные аптамеры считали конкурирующими ингибиторами взаимодействия ARC186/C5; % ингибирования рассчитывали посредством нормализации данных по отношению к контрольным реакциям в отсутствие конкурента (контроль 0% ингибирования). Значения IC₅₀ определяли на основании полулогарифмических графиков зависимости % ингибирования от [ARC672] или [ARC1905] посредством подгонки данных к уравнению: % ингибирования = амплитуда Ч [конкурент] ⁿ/(IC₅₀ ⁿ + [конкурент]ⁿ).

Как показано на фиг.60, добавление разветвленного 40 кД ПЭГ (2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоила) оказывает слабое влияние или не влияет на аффинность аптамера, которую измеряли в анализе конкурентного связывания. Значения K_D 0,46±0,149 нМ и 0,71±0,130 нМ аппроксимировали для ARC672 и ARC1905 соответственно по отрезку, отсекаемому на оси линией подгонки к данным зависимости IC ₅₀ от C5 на фиг.60. Оба значения близки к значению K _D, определенному для ARC186 при 37°C.

Зависимость от температуры взаимодействия между ARC1905 и C5 также оценивали в конкурентном анализе. ARC1905 серийно разводили, получая серию 10 образцов, как описано выше. Реакционные смеси для связывания уравновешивали в течение 1-4 часов при 25°C или 37°C и затем фильтровали в устройстве с нитроцеллюлозными фильтрами. Ингибирование в процентах рассчитывали посредством нормализации данных по отношению к контрольным реакциям в отсутствие конкурента (контроль 0% ингибирования) или в отсутствие белка C5 (контроль 100% ингибирования). Значения IC₅₀ определяли на основании полулогарифмических графиков зависимости % ингибирования от [ARC672] или [ARC1905] подгонкой данных к уравнению: % ингибирования = амплитуда х [конкурент]ⁿ/(IC₅₀ ⁿ + [конкурент]ⁿ). Как показано на фиг.61, ARC1905 связывается с C5 с высокой аффинностью как при 25°C, так и при 37°C. Значения K_D 0,15±0,048 нМ и 0,69±0,148 нМ получали при 25°C и 37°C соответственно на пересечении с осью графика данных зависимости IC₅₀ от C5. Оба значения соответствовали значениям K_D, определенным для взаимодействия ARC186/C5, как описано выше.

Пример 1B: Анализ цельной крови.

Влияние анти-C5-аптамера на альтернативный путь системы комплемента анализировали с использованием следующего анализа цельной крови. Кровь брали у здоровых людей-добровольцев без антикоагулянта. Аликвоты крови (не содержащие антикоагулянта) инкубировали с возрастающими концентрациями ARC186 (SEQ ID NO: 4) в течение 5 часов при комнатной температуре или при 37°C. Образцы центрифугировали, чтобы отделить сыворотку, и регистрировали присутствие C5b в сыворотке посредством ELISA sC5b-9 (набор для ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA). Как показано на фиг.15, направленная против комплемента активность, которая отражается в продукции C5b-9, расходилась в образцах, инкубированных при разных температурах, при 3 мкМ. Данные, полученные при комнатной температуре, показали, что концентрация аптамера, необходимая для количественного ингибирования, находится в диапазоне 3-6 мкМ, тогда как сообщенная концентрация C5 составляет примерно 400 нМ. Полученные результаты свидетельствуют, что более чем 10-кратный молярный избыток анти-C5-аптамера (ARC186; SEQ ID NO: 4) может требоваться для полного ингибирования активности C5.

Пример 1C: Активация комплемента зимозаном.

Зимозан является полисахаридным компонентом клеточной стенки дрожжей и сильным активатором альтернативного каскада комплемента. Добавление зимозана к образцам крови, плазмы или сыворотки ex vivo приводит к накоплению продуктов активации комплемента, включая C5a и растворимый вариант C5b-9 (sC5b-9). Образцы неразбавленной сыворотки человека (Center for Blood Research, Boston, MA), цитратной цельной крови человека (Center for Blood Research, Boston, MA) или сыворотки макак-крабоедов (Charles River Labs, Wilmington, MA) импульсно обрабатывали возрастающими концентрациями ARC658 (SEQ ID NO: 62), содержащего 30 кД-ПЭГ аналога ARC186 (SEQ ID NO: 4). Чтобы активировать комплемент, к образцам добавляли зимозан (Sigma, St. Louis, MO) в 10×-суспензии до конечной концентрации 5 мг/мл. После 15-минутной инкубации при 37°C частицы зимозана удаляли центрифугированием и определяли степень активации комплемента посредством анализа ELISA C5a и/или sC5b-9 (набор для ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA; набор для ELISA C5a, BD Biosciences, San Diego, CA).

В отсутствие аптамера обработка зимозаном активирует ~50% C5 сыворотки или цельной крови по сравнению с ~1% активации в необработанном образце. Добавление анти-C5-аптамера до 50 нМ (~10% от концентрации C5 в крови) оказывало небольшое влияние на образование sC5b-9. Однако дальнейшее титрование C5 возрастающими концентрациями ARC658 (SEQ ID NO: 62) ингибировало активацию C5 зависимым от дозы образом, видно на фиг.16. В сыворотке или цельной крови человека количественное ингибирование (~99%) наблюдали при концентрации 0,8-1 мкМ ARC658 (SEQ ID NO: 62), соответствующей ~2 молярным эквивалентам аптамера по сравнению с C5. Более высокие концентрации аптамера требовались для достижения сравнимого ингибирования в сыворотке макак-крабоедов. В данном случае 99% ингибирование достигали только в присутствии 10 мкМ аптамера или ~20 молярных эквивалентов аптамера по сравнению с C5.

В сходном исследовании тестировали ингибирующее влияние ARC1905 (пегилированный разветвленным 40 кД (2,3-бис(мПЭГ-[20 кД])пропил-1-карбамоилом) вариант ARC186) на образцы человека и макак-крабоедов с использованием зимозана для активации комплемента посредством альтернативного пути следующим образом. Зимозан A из Saccharomyces cerevisiae получали из Sigma-Aldrich, Inc. ( № в каталоге Z4250-1G, St. Louis, MO). Зимозан A поставляется в виде порошка, и его ресуспендировали в PBS Dulbecco (Gibco, Carlsbad, CA, № в каталоге 14190-144), получая суспензию 50 мг/мл. Замороженную объединенную сыворотку здоровых людей ( № в каталоге IPLA-SER) приобретали из Innovative Research (Southfield, MI). Замороженную объединенную сыворотку макак-крабоедов ( № в каталоге CYNSRM) приобретали из Bioreclamation (Hicksville, NY). Флаконы, содержащие по 5-10 мл сыворотки, получаемые от поставщика в замороженном виде, размораживали при 37°C, делили на аликвоты (~1 мл) и хранили при -20°C. Аликвоты размораживали при необходимости непосредственно перед использованием посредством инкубации при 37°C и хранили на льду во время экспериментов. Конечная концентрация сыворотки в каждом анализе составляла ~100%. Исходный 20 мкМ раствор ARC1905 готовили в 0,9% растворе соли и серийно разводили, получая серию 10 образцов, охватывающих ~90-кратный диапазон концентраций аптамера. Образец без аптамера (только раствор соли) также включали в качестве негативного контроля (0% ингибирования).

По 90 мкл сыворотки пипеткой разносили в лунки 96-луночного планшета для ПЦР (VWR, № в каталоге 1442-9596). 10 мкл образца аптамера разбавляли непосредственно в сыворотке при комнатной температуре и смешивали. По 8 мкл 50 мг/мл раствора зимозана пипеткой разносили в лунки отдельного 96-луночного планшета для ПЦР. Оба планшета одновременно предварительно инкубировали при 37°C в течение 15 минут. Сразу после предварительной инкубации 80 мкл смеси сыворотка/аптамер добавляли непосредственно к 8 мкл зимозана и смешивали, получая конечную концентрацию зимозана 5 мг/мл. Планшет с реакционной смесью герметично закрывали и инкубировали в течение 15 минут при 37°C. В конце инкубации реакцию гасили, добавляя в лунки пипеткой 8 мкл 0,5М EDTA и смешивая. Зимозан осаждали центрифугированием (3700 об/мин, 5 мин при комнатной температуре) и ~80 мкл погашенного надосадка переносили в новый 96-луночный планшет для ПЦР и герметично закрывали. Надосадки мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -20°C. Для контроля независимой от зимозана фоновой активации образцы сыворотки готовили и обрабатывали точно так же, как описано выше, за исключением того, что вместо зимозана добавляли 8 мкл физиологического раствора.

Степень активации C5 определяли на основании относительных уровней C5a, образованного в каждом активированном зимозаном образце, которые измеряли в анализе ELISA C5a (ALPCO Diagnostics, Windham, NH, № в каталоге EIA-3327), следуя протоколу, прилагаемому к набору для ELISA C5a. Набор для ELISA C5a содержит специфичные для человека реагенты и поставляется в форме для анализа C5a человека (hC5a) в образцах плазмы или сыворотки. Поэтому необходимо охарактеризовать ответ ELISA на C5a макак-крабоедов, используя стандарты концентраций для макак-крабоедов. Чтобы приготовить набор специальных стандартов, аликвоты объемом 0,5 мл сыворотки человека или макак-крабоедов инкубировали с 5 мг/мл зимозана в течение 15 мин при 37°C, гасили 12,5 мкл 0,5М EDTA и центрифугировали, чтобы удалить зимозан. Определили концентрацию C5a в образце активированной зимозаном сыворотки человека, составляющую примерно 2 мкг/мл hC5a, при сравнении со стандартами hC5a в плазме, поставляемыми в наборе. Определили, что концентрация C5a в образце макаки-крабоеда, выраженная в эквивалентах C5a человека (экв. hC5a), составляла примерно 0,6 мкг/мл экв. hC5a. Готовили серию стандартов, охватывающую диапазон от 0,4 до 400 нг/мл hC5a или 0,12-120 нг/мл экв. hC5a, разведением в сыворотке крысы (которая не мешает ELISA). Стандарты предварительно обрабатывали преципитирующим белок реагентом, как указано в протоколе к набору для ELISA, и вносили без дополнительного разбавления в планшет для ELISA. Регистрацию оптической плотности в планшете для ELISA осуществляли при максимуме 450 нМ (A ₄₅₀), используя устройство для считывания оптической плотности в планшетах в УФ/видимой области VersaMax (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). A₄₅₀ изменялась с изменением концентрации C5a от низкой 0,1-0,2 при низкой концентрации C5a с выходом на плато ~3,5 при высокой концентрации C5a. В целях количественной оценки C5a в анализируемых образцах верхние и нижние пределы количественной оценки составляли соответственно 25 и 0,78 нг/мл hC5a для человека и 15 и 0,94 нг/мл экв. hC5a для макак-крабоедов. Зависимость A₄₅₀ от концентрации hC5a в нг/мл или экв. hC5a изображали графически, как показано на фиг.62, и стандартную кривую получали на основании подгонки по 4 параметрам к данным, используя уравнение y = ((A - D)/(1 + (x/C)^B)) + D.

Непосредственно перед анализом C5a анализируемые образцы (включая контроль, содержащий только физиологический раствор, и контроль, не содержащий зимозана) предварительно обрабатывали преципитирующим белок реагентом, как указано в протоколе, прилагаемом к набору для ELISA, затем серийно разводили в 0,9% растворе соли. Уровни C5a в неразбавленных анализируемых образцах (включая некоторые контроли без зимозана) обычно превышали верхний предел количественной оценки (ULOQ). Поэтому тестировали разведения 1/5, 1/50 и 1/250, чтобы обеспечить полный диапазон концентраций C5a в анализируемых образцах. Уровни C5a количественно оценивали посредством сравнения с соответствующей стандартной кривой (для человека или макак-крабоедов) и корректировали в отношении разведения. % ингибирования для каждой концентрации аптамера рассчитывали, используя уравнение % ингибирования = 100 - 100 × (C5a_{образца} - C5a _{без замозана})/(C5a_{только физиологический раствор} - C5a_{без зимозана}). Значения IC₅₀ определяли на основании графика зависимости % ингибирования от [ARC1905], используя уравнение % ингибирования = (% ингибирования)_{максимальный} × [ARC1905]ⁿ/(IC₅₀ ⁿ + [ARC1905]ⁿ) + фон. Значения IC ₉₀ и IC₉₉ рассчитывали на основании значений IC₅₀, используя уравнения IC₉₀ = IC ₅₀ × [90/(100-90]^1/n и IC₉₉ = IC₅₀ × [99/(100-99]^1/n.

Степень активации C3 (стадия в общем пути комплемента непосредственно перед C5) определяли исходя из относительных уровней C3a, образованного в каждом активированном зимозаном образце, которые измеряли в ELISA C3a (набор для ELISA C3a Becton-Dickinson OptiEIA, № в каталоге 550499, Franklin Lakes, NJ), следуя протоколу, прилагаемому к набору для ELISA C3a.

Непосредственно перед анализом C3a образцы (включая контроль, содержащий только физиологический раствор, и контроль, не содержащий зимозана) серийно разводили в 0,9% растворе соли. ELISA C3a более чувствителен, чем ELISA в случае C5a; поэтому были необходимы разведения 1/500, 1/5000 и 1/25000, чтобы обеспечить полный диапазон концентраций C3a в образцах. Стандарты из набора, полученные из сыворотки человека, использовали вместо специальных стандартов, полученных для анализа C5a. Так как уровни C3a не сильно варьировали, то специфичные для человека стандарты обеспечивали достаточный показатель относительных уровней C3a.

Данные, полученные в результате обоих анализов ELISA C5a и C3, анализировали, используя Microsoft Excel, и средние значения ингибирования в % изображали графически, используя Kaleidagraph (v. 3.51, компьютерная программа Synergy). Значения IC₅₀, IC₉₀ и IC ₉₉ определяли, используя XLfit 4.1, встроенный в Excel. Сравнительное влияние ARC1905 на активацию комплемента человека и макак-крабоедов, которое измеряли указанным способом, суммировано на фиг.63 и фиг.64. Как можно видеть на указанных фигурах, полное ингибирование активации C5 посредством альтернативного пути достигается in vitro с использованием ARC1905 в сыворотке человека и в сыворотке макак-крабоедов. В сыворотке человека концентрация ARC1905, необходимая для 90% ингибирования активации C5 в неразбавленном образце, составляла 442±23 нМ, что примерно эквивалентно средней молярной концентрации C5. Однако ARC1905 действовал в 4-6-раз слабее против активности комплемента макак-крабоедов в условиях анализа, что отражено в значениях IC₉₀ и IC₉₉ .

Влияние ARC1905 на активацию C3, которое измеряли по уровню C3a, суммировано на фиг.65. Обоснованием специфичного целенаправленного воздействия на хвостовой конец пути комплемента является блокирование провоспалительных функций C5a и мембраноатакующего комплекса (MAC) без создания препятствий для функций борьбы с патогенами расположенных выше факторов, завершающихся образованием C3a и C3b. Данные, приведенные на фиг.65, показывают, что ARC1905 вплоть до 2 мкМ не ингибирует образование C3a, и свидетельствуют, что ARC1905 не оказывает негативного влияния на активацию комплемента в каскаде выше. По существу полная блокада активации C5 в альтернативном пути достигается в образцах сыворотки человека и макак-крабоедов с использованием ARC1905. ARC1905 действует примерно на порядок слабее в ингибировании активации C5 макак-крабоедов, чем активации C5 человека в условиях данного анализа. Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что ингибирующее влияние ARC1905 на активацию комплемента специфично по отношению к C5, так как активация C3 не была ингибирована.

Пример 1D: Модель активации комплемента, основанная на использовании петли из трубки

Чтобы тестировать способность анти-C5-аптамера блокировать активацию комплемента, индуцированную воздействием чужеродных материалов, которая встречается в случае искусственного кровообращения, авторы использовали модель на основе петли из трубки, описанную Nilsson с соавторами (Gong et al., (1996) Journal of Clinical Immunology 16, 222-9; Nilsson et al., (1998) Blood 92, 1661-7). Медицинскую/хирургическую трубку Tygon S-50-HL (с внутренним диаметром 1/4 дюйма) (United States Plastic Corp. ((Lima, OH), № в каталоге 00542) нарезали на кусочки длиной примерно 300 мм (объем примерно 9 мл) и заполняли 5 мл донорской крови человека, содержащей 0,4 единицы/мл гепарина (Celsus) и различные концентрации ARC658 (SEQ ID NO: 62) (0 - 5 мкМ). Каждый кусочек трубки Tygon замыкали в петлю с помощью коротких кусочков (~50 мм) соединительной трубки из нехирургического силикона (с внутренним диаметром 3/8 дюйма) (United States Plastic Corp. (состав R-3603, № в каталоге 00271), как описано в Gong et al. Петли из трубок вращали в течение 1 часа примерно при 30 об/мин на водяной бане при 37°C. Затем содержимое петель выливали в полипропиленовые конические пробирки, содержащие EDTA (конечная концентрация 10 мМ), чтобы погасить активацию комплемента. Плазму с низким содержанием тромбоцитов выделяли центрифугированием и анализировали в отношении C5a и C3a, используя ELISA (набор для ELISA C3a, Quidel, San Diego, CA; набор для ELISA C5a, BD Biosciences, San Diego, CA).

Общая активация комплемента в отсутствие аптамера была небольшой по сравнению с анализом с использованием зимозана. Обычно уровни C5a возрастали примерно на 6 нг/мл после 1 часа инкубации, что соответствовало активации <1% имеющегося C5. Однако такое увеличение было воспроизводимо и ингибировалось титрованием ARC658 (SEQ ID NO: 62). Как показано на фиг.17, 300-400 нМ ARC658 (SEQ ID NO: 62) было достаточно для достижения 99% ингибирования активации C5, уровня, который примерно эквивалентен или немного ниже молярной концентрации C5 в крови. Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что хотя требуется меньше аптамера для получения 99% ингибирования активации C5 в данной модели, чем в модели с зимозаном, полученные данные могут отражать существенные различия активирующих комплемент стимулов, используемых в двух анализах. Также наблюдали за образованием C3a в качестве контроля, чтобы подтвердить, что ARC658 (SEQ ID NO: 62) не блокировал более ранние стадии активации, чем C5, в каскаде комплемента. Уровни C3a возрастали примерно на 4000 нг/мл после 1 часа инкубации, что соответствует активации примерно 10% имеющегося C3. В отличие от образования C5a наблюдали небольшое зависимое от дозы ингибирование образования C3a при титровании ARC658 (SEQ ID NO: 62), что свидетельствует о том, что ARC658 (SEQ ID NO: 62) специфично блокирует расщепление C5.

Исследование в модели на основе петель из трубок повторяли с использованием анти-C5-аптамера ARC1905 (SEQ ID NO: 67). ARC1905 серийно разводили в 0,9% растворе соли, получая серию 20 образцов, охватывающую 100-кратный диапазон концентраций аптамера (конечная концентрация в анализе 10-1000 нМ). Образцы, содержащие нерелевантный аптамер (ARC127), включали для контроля неспецифичного действия олигонуклеотидов. Образец без аптамера (только физиологический раствор) также включали в качестве негативного контроля. Образцы крови от отдельных доноров отбирали стандартными способами флеботомии у добровольцев. Цельную кровь брали у 5 разных доноров непосредственно в шприц объемом 60 мл (Becton-Dickinson, (Franklin Lakes, NJ), № в каталоге 309653) и сразу делили на аликвоты в бивалирудин (конечная концентрация 20 мкМ) (Prospec-Tany Technogene Ltd., (Israel), партия № 105BIV01) +/-аптамер. Антикоагулянт бивалирудин, прямой ингибитор тромбина, использовали вместо гепарина, который мешает активации комплемента.

Модель петель из трубок осуществляли по существу, как описано выше. ~300 мм кусочки трубки (диаметр 1/4 дюйма, объем ~9 мл) заполняли 5 мл образцов кровь/аптамер/бивалирудин сразу после взятия крови у донора. Затем трубки надежно фиксировали в виде петель короткими кусочками (~50 мм) силиконовой соединительной трубки, получая объем газа ~4 мл. Петли из трубок вращали вертикально при 32 об/мин во время инкубации на водяной бане при 37°C в течение 1 часа. После инкубации все 5 мл образца переносили в коническую пробирку объемом 15 мл (Corning, (Corning, NY), № в каталоге 430766), содержащую 100 мкл 0,5М EDTA, получая конечную концентрацию EDTA 10 мМ. 1 мл надосадка плазмы собирали из каждого погашенного образца после центрифугирования (Eppendorf Centrifuge 5804) при 4°C (3300 об/мин, 20 минут). Надосадки мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -20°C. Для контроля фоновой активации готовили образец до CPB добавлением 5 мл свежей крови непосредственно в коническую пробирку объемом 15 мл на льду, содержащую 100 мкл 0,5М EDTA. Указанный образец обрабатывали для получения плазмы и хранили, как описано выше.

Степень активации C5 определяли на основании относительных уровней C5a, образованных в каждом активированном образце, которые измеряли в ELISA C5a, как описано выше. ELISA C5a осуществляли на неразбавленных образцах плазмы согласно протоколу, прилагаемому к набору для ELISA, и уровни C5a в образцах количественно определяли посредством сравнения со стандартами C5a, поставляемыми производителем. % ингибирования образования C5a при каждой концентрации аптамера рассчитывали, используя уравнение % ингибирования = 100 - 100 × (C5a_{образца} - C5a_пре-CPB)/(C5a _{только физиологический раствор} - C5a_пре-CPB). Значения IC₅₀ определяли на основании графика зависимости % ингибирования от [ARC1905], используя уравнение % ингибирования = (% ингибирования)_{максимальный} x [ARC1905]ⁿ /(IC₅₀ ⁿ + [ARC1905]ⁿ) + фон. Значения IC ₉₀ и IC₉₉ рассчитывали на основании значений IC₅₀, используя уравнения IC₉₀ = IC ₅₀ × [90/(100-90]^1/n и IC₉₉ = IC₅₀ × [99/(100-99]^1/n.

Степень активации C3 определяли исходя из относительных уровней C3a, образованных в каждом активированном образце, которые измеряли в ELISA C3a, как описано выше. Непосредственно перед анализом C3a образцы (включая контроль, содержащий только физиологический раствор, и контроль, полученный перед CPB) серийно разводили в 0,9% растворе соли. ELISA C3a более чувствителен, чем ELISA в случае C5a; поэтому были необходимы разведения 1/5000, чтобы обеспечить полный диапазон концентраций C3a в образцах. Уровни C3a в образцах количественно оценивали посредством сравнения со стандартами в наборе и % ингибирования рассчитывали, как описано для C5a. Данные анализировали, используя Microsoft Excel, и средние значения % ингибирования изображали графически, используя Kaleidagraph (v3.5, компьютерная программа Synergy). Значения IC₅₀ , IC₉₀ и IC₉₉ определяли, используя XLfit 4.1, встроенный в Excel.

Средние значения воздействия ARC1905 и нерелевантного аптамера ARC127 на активацию комплемента у пяти доноров суммированы на фиг.66. Как показано на фиг.67, полную блокаду активации C5, которая отражается в образовании C5a, достигали с использованием <500 нМ ARC1905, тогда как нерелевантный аптамер не оказывал ингибирующего влияния вплоть до 1 мкМ. Средние значения IC₅₀, IC₉₀ и IC₉₉ для цельной крови составляли 119±28,6 нМ, 268±39,2 нМ и 694±241 нМ соответственно (фиг.66). Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, считают справедливым полагать, что ARC1905 не содержится в объеме, занимаемом клетками крови, который составляет примерно 45% общего объема. Поэтому значения IC₅₀, IC₉₀ и IC₉₉, скорректированные так, чтобы они отражали ингибирование C5 в плазме, составляли 216±52,0 нМ, 487±71 нМ и 1261±438 нМ. Приведенные значения согласуются с параметрами, рассчитанными для ингибирования ARC1905 индуцированной зимозаном активации комплемента в сыворотке, что свидетельствует о том, что клеточные компоненты крови существенно не мешают анти-C5-активности ARC1905. Образование C3a не было ингибировано ни ARC1905, ни нерелевантным аптамером вплоть до 1 мкМ. Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, полагают, что это свидетельствует о том, что ARC1905 не ингибирует конвертазную реакцию C3 и не блокирует другие стадии, которые вносят вклад в альтернативный каскад активации, такие как отложение C3 и сборку конвертазы.

ПРИМЕР 2

Селекции de novo и последовательности

Селекция C5 с использованием пула dRmY

Проводили две селекции, чтобы идентифицировать аптамеры dRmY к полноразмерному белку C5 человека. Белок C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA или Advanced Research Technologies, San Diego, CA) использовали в полноразмерной форме («FL») и частично обработанной трипсином форме («TP»), и обе селекции представляли собой прямой отбор против белковых мишеней, которые были иммобилизованы на гидрофобном планшете. Обе селекции давали пулы, в значительной степени обогащенные в отношении связывания с полноразмерным C5 по сравнению с нативным, не подвергнутым селекции пулом. Все последовательности, указанные в данном примере, показаны в направлении 5'-3'.

Получение пула: ДНК-матрицу, имеющую последовательность TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN ₍₃₀₎GGTCGATCGATCGATCATCGATG (ARC520; SEQ ID NO: 70), синтезировали, используя синтезатор ДНК ABI EXPEDITE^TM, и удаляли защиту стандартными способами. Матрицы амплифицировали, используя 5'-праймер TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 71) и 3'-праймер CATCGATGATCGATCGATCGACC (SEQ ID NO: 72), и затем использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro РНК-полимеразой T7, имеющей одиночную мутацию Y639F. Транскрипции осуществляли, используя 200 мМ HEPES, 40 мМ DTT, 2 мМ спермидин, 0,01% тритон X-100, 10% ПЭГ-8000, 9,5 мМ MgCl ₂, 2,9 мМ MnCl₂, 2 мМ NTP, 2 мМ GMP, 2 мМ спермин, 0,01 единиц/мл неорганической пирофосфатазы и одиночный мутант Y639F полимеразы T7.

Селекция: В раунде 1 стадию позитивной селекции осуществляли на колонках для связывания, содержащих нитроцеллюлозные фильтры. Коротко, 1×10¹⁵ молекул (0,5 нмоль) из пула РНК инкубировали в 100 мкл буфера для связывания (1×DPBS) с 3 мкМ полноразмерного C5 или 2,6 мкМ частично трипсинизированного C5 в течение 1 часа при комнатной температуре. Комплексы РНК:белок и свободные молекулы РНК разделяли, используя центрифужные колонки с нитроцеллюлозой 0,45 мкм из Schleicher and Schuell (Keene, NH). Колонки предварительно промывали 1 мл 1× DPBS и затем в колонки добавляли растворы, содержащие РНК:белок и вращали в центрифуге при 1500 g в течение 2 мин. Осуществляли три промывки буфером по 1 мл, чтобы удалить неспецифичные связывающиеся вещества с фильтров, затем комплексы РНК:белок, связанные с фильтрами, дважды элюировали, промывая 200 мкл элюирующего буфера (7 M мочевина, 100 мМ ацетат натрия, 3 мМ EDTA, предварительно нагретый до 95°C). Элюированную РНК преципитировали (2 мкл гликогена, 1 объем изопропанола, 1/2 объема этанола). РНК обратно транскрибировали, используя систему для ОТ-ПЦР ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA), согласно инструкциям производителя, используя 3'-праймер, описанный выше в SEQ ID NO: 72, с последующей ПЦР-амплификацией (20 мМ трис pH 8,4, 50 мМ KCl, 2 мМ MgCl ₂, 0,5 мкМ праймеров SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72, 0,5 мМ каждого dNTP, 0,05 единиц/мкл полимеразы Taq (New England Biolabs, Beverly, MA)). ПЦР-матрицы очищали, используя колонки Centricep (Princeton Separations, Princeton, NJ), и использовали для транскрибирования пула для следующего раунда.

В последующих раундах селекции разделение связанной и свободной РНК осуществляли на гидрофобных планшетах Nunc Maxisorp (Nunc, Rochester, NY). Раунд начинали иммобилизацией 20 пмоль полноразмерного C5 и частично трипсинизированного C5 на поверхности планшета в течение 1 часа при комнатной температуре в 100 мкл 1×DPBS. Затем надосадок удаляли и лунки промывали 4 раза 120 мкл буфера для промывки (1X DPBS). Затем лунки с белком блокировали буфером 1×DPBS, содержащим 0,1 мг/мл дрожжевой тРНК и 0,1 мг/мл ДНК спермы лосося в качестве конкурентов. Концентрация используемого пула всегда была по меньшей мере в пятикратном избытке по сравнению с концентрацией белка. РНК пула также инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в пустых лунках, чтобы удалить любые связывающиеся с пластиком последовательности, и затем инкубировали в блокированной лунке без белка, чтобы удалить любые конкурентно связывающиеся последовательности из пула перед стадией позитивной селекции. Затем РНК пула инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и РНК, связанную с иммобилизованным C5, обратно транскрибировали непосредственно в планшете для селекции, добавляя смесь для ОТ (3'-праймер, SEQ ID NO: 72 и Thermoscript RT, Invitrogen), с последующей инкубацией при 65°C в течение 1 часа. Полученную в результате кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР (полимераза Taq, New England Biolabs). Амплифицированные ДНК-матрицы пула обессоливали, используя колонку Centrisep (Princeton Separations), в соответствии с рекомендованными производителем условиями и использовали для программирования транскрипции РНК-пула для следующего раунда селекции. Транскрибированный пул очищали в 10% полиакриламидном геле в каждом раунде.

Ход селекции контролировали, используя анализ связывания на фильтре типа «сэндвич» (дот-блот). 5'-³²P-меченую РНК пула (следовая концентрация) инкубировали с C5, 1× DPBS плюс 0,1 мг/мл тРНК и 0,1 мг/мл ДНК спермы лосося в течение 30 минут при комнатной температуре и затем наносили на состоящий из нитроцеллюлозы и нейлона фильтр типа «сэндвич» в устройстве для дот-блоттинга (Schleicher and Schuell). Рассчитывали процент РНК пула, связанной с нитроцеллюлозой, и контролировали примерно каждые 3 раунда, проводя скрининг в одной точке (+/-300 нМ C5). Измерения K _d пула получали, используя титрование белка и устройство для дот-блоттинга, как описано выше.

Результаты селекции: В двух селекциях получали обогащение после 10 раундов по сравнению с нативным пулом. См. фиг.18. В 10 раунде K _d пула составляла примерно 115 нМ для селекции на полноразмерном белке и 150 нМ для селекции на трипсинизированном белке, но степень связывания составляла только примерно 10% при выходе на плато в двух селекциях. R10-пулы клонировали, используя набор для клонирования TOPO TA (Invitrogen) и секвенировали.

Информация о последовательностях: 45 клонов из каждого пула секвенировали. В R10-пуле для полноразмерного белка доминировал один клон ARC913 (SEQ ID NO: 75), который составлял 24% пула, 2 набора дуплицированных и одиночных последовательностей составляли остальную часть. R10-пул для трипсинизированного белка содержал 8 копий одной и той же последовательности ARC913 (SEQ ID NO: 75), но в пуле доминировала другая последовательность (AMX221.A7; 46%). Клон ARC913 (SEQ ID NO: 75) имел K_d примерно 140 нМ и степень связывания приближалась к 20%. См. фиг.19.

Отдельная последовательность, приведенная в таблице 5, показана в 5'-3'-направлении и соответствует рибонуклеотидной последовательности аптамера, который был отобран в предложенных условиях dRmY SELEX^TM . В вариантах согласно изобретению, полученных в результате такой селекции (и отраженных в списке последовательностей), пурины (A и G) являются дезоксинуклеотидами, а пиримидины (U и C) являются 2'-OMe-нуклеотидами. Последовательность, указанная в таблице 5, может содержать или не содержать кэпирования (например, 3'-инвертированный dT). Уникальная последовательность приведенного ниже аптамера начинается с нуклеотида 23 сразу после фиксированной последовательности GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO: 73) и продолжается до встречи с 3'-фиксированной последовательностью нуклеиновой кислоты GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG (SEQ ID NO: 74).

Таблица 5

Нуклеотидная последовательность C5-dRmY-аптамера

Анализ гемолиза: Влияние ARC913 (SEQ ID NO: 75) на классический путь системы комплемента анализировали, используя анализ гемолиза, описанный ранее, по сравнению с ARC186 (SEQ ID NO: 4) (анти-C5-аптамер, позитивный контроль) и не подвергнутым селекции dRmY-пулом (негативный контроль). В анализе ингибирования гемолиза раствор 0,2% цельной сыворотки человека смешивали с покрытыми антителами эритроцитами барана (тест для анализа комплемента Diamedix EZ CH50, Diamedix Corporation, Miami, FL) в присутствии титруемого ARC913 (SEQ ID NO: 75). Анализ проводили в забуференном вероналом физиологическом растворе, содержащем кальций, магний и 1% желатин (буфер для комплемента GVB⁺⁺) и инкубировали в течение 1 часа при 25°C. После инкубации образцы центрифугировали. Регистрировали оптическую плотность надосадка при 415 нм (OD ₄₁₅). Ингибирование активности гемолиза выражено в % активности гемолиза по сравнению с контролем. См. фиг.20. Рассчитали IC ₅₀ аптамера, составляющую примерно 30 нМ.

ПРИМЕР 3

Состав и оптимизация последовательностей

Пример 3A: Минимизация ARC913:

Шесть конструкций, основанных на ARC913 (SEQ ID NO: 75), транскрибировали, очищали в геле и тестировали на дот-блотах в отношении связывания с C5. ARC954 был похож на исходный клон с K_d 130 нМ и степенью связывания 20%, тогда как ARC874 (SEQ ID NO: 76) был единственным другим клоном, который связывался с C5 с K_d 1 мкМ.

Отдельные последовательности, перечисленные в таблице 6, указаны в 5'-3'-направлении, и они получены из аптамеров, которые были отобраны в предложенных условиях SELEX dRmY. В вариантах согласно изобретению, полученных в результате такой селекции (и отраженных в списке последовательностей), пурины (A и G) являются дезоксинуклеотидами, а пиримидины (U и C) являются 2'-OMe-нуклеотидами. Каждая из последовательностей, перечисленных в таблице 6, может содержать или может не содержать кэпирования (например, 3'-инвертированный dT).

Таблица 6

Нуклеотидные последовательности минимизированных клонов ARC913

Пример 3B: Оптимизация ARC913: повторная селекция с введенными примесями

Чтобы оптимизировать клон ARC913 (SEQ ID NO: 75) в отношении аффинности связывания C5 и определить ключевые элементы связывания, проводили повторную селекцию с введенными примесями. Повторную селекцию с введенными примесями использовали для исследования требований, предъявляемых к последовательности в активном клоне или минимере. Селекции проводили с использованием синтетического вырожденного пула, который был сконструирован на основе одной последовательности. Уровень вырожденности обычно варьирует от 70% до 85% нуклеотидов дикого типа. В общем, наблюдают нейтральные мутации, но в некоторых случаях изменения последовательности могут приводить к улучшению аффинности. Информацию о комбинированной последовательности затем можно использовать для идентификации минимального мотива связывания, и она может помочь при оптимизации.

Получение пула: Последовательность матрицы taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN₍₃₀₎GTTACGACTAGCATCGATG (SEQ ID NO: 82) основана на ARC913 (SEQ ID NO: 75) и ее синтезировали так, чтобы каждый остаток из случайной области был примесным на уровне 15%, т.е. в каждом случайном («N») положении существует 85% вероятность того, что остаток будет нуклеотидом, встречающимся в последовательности дикого типа CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG (SEQ ID NO: 83), и 15% вероятность того, что будет одним из трех других нуклеотидов.

Матрицу и пул РНК для повторной селекции с введенными примесями готовили по существу, как описано выше. Матрицы амплифицировали с использованием праймеров taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 84) и CATCGATGCTAGTCGTAAC (SEQ ID NO: 85). Проводили две селекции с использованием полноразмерного C5, при этом одну селекцию проводили с использованием более высокой концентрации соли на стадии промывки. Следовали протоколу селекции, который описан выше, с двумя исключениями: 1) раунд 1 осуществляли на гидрофобных планшетах (так же, как все последующие раунды), используя только стадию положительной селекции; и 2) совсем не использовали конкурента во время селекции. Концентрация C5 и концентрация пула РНК сохранялись постоянными на уровне 200 нМ и 1 мкМ соответственно.

Данные повторной селекции с введенными примесями

При нормальной селекции и селекции в условиях высокой концентрации соли получали обогащение после 5 раундов по сравнению с нативным пулом. K_d пула в раунде 5 составляла примерно 165 нМ для селекции при высокой концентрации соли и 175 нМ для селекции при нормальной концентрации соли. Степень связывания составляла примерно 20% при выходе на плато в обоих случаях. R4-пулы клонировали, используя набор для клонирования TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), и 48 клонов из каждого пула секвенировали. 12 клонов из каждого пула транскрибировали и анализировали в дот-блот-анализе в одной точке при 500 нМ C5. Константы диссоциации (K_d) снова измеряли, используя дот-блот-анализ, описанный ранее. K_d оценивали для 11 лучших клонов, идентифицированных при скрининге в одной точке, подгонкой данных к уравнению: доля связанной РНК=амплитуда*K_d/(K_d+[C5]). Следующие клоны имели три наилучших значения K_d: SEQ ID NO: 91 (73 нМ), SEQ ID NO: 96 (84 нМ) и SEQ ID NO: 95 (92 нМ). Последовательности указанных 11 клонов приведены ниже в таблице 7.

Последовательности, перечисленные в таблице 7, указаны в 5'-3'-направлении и представляют нуклеотидные последовательности аптамеров, которые были отобраны в предложенных условиях dRmY-SELEX. В вариантах согласно изобретению, полученных при такой селекции (и отраженных в списке последовательностей), соответствующие последовательности содержат комбинации остатков dRmY, которые указаны в тексте, где пурины (A и G) являются дезоксинуклеотидами, а пиримидины (U и C) являются 2'-OMe-нуклеотидами. Каждая из последовательностей, перечисленных в таблице 7, может содержать или может не содержать кэпирование (например, 3'-инвертированный dT). Уникальные последовательности каждого приведенного ниже аптамера начинаются с нуклеотида 23 сразу после 5'-фиксированной последовательности GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO: 86) и продолжаются вплоть до встречи с 3'-фиксированной последовательностью нуклеиновой кислоты GUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 87).

Таблица 7

Нуклеотидные последовательности клонов, полученных при повторной селекции с введенными примесями

Пример 3C: Модификация ARC186 разветвленным ПЭГ с молекулярной массой 40 кД

Олигонуклеотид

UmGfCmG-3T-3' (ARC672, SEQ ID NO: 63) синтезировали в синтезаторе ДНК Expedite (ABI, Foster City, CA) согласно способам, рекомендованным производителем, используя стандартные коммерчески доступные 2'-OMe-РНК- и 2'-F-РНК- и TBDMS-защищенные РНК-фосфорамидиты (Glen Research, Sterling, VA) и содержащую инвертированный дезокситимидин подложку CPG. Концевую аминную функцию связывали с 5'-амино-модификатором, 6-(трифторацетиламино)гексил-(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)фосфорамидитом, C6-TFA (Glen Research, Sterling, VA). После удаления защиты олигонуклеотиды очищали ионообменной хроматографией на смоле Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences) и преципитировали этанолом.

Модифицированный амином аптамер после синтеза конъюгировали с разными остатками ПЭГ. Аптамер растворяли в растворе вода/ДМСО (1:1) до концентрации от 1,5 до 3 мМ. Добавляли натрий-карбонатный буфер, pH 8,5, до конечной концентрации 100 мМ и олигонуклеотид подвергали взаимодействию в течение ночи с 1,7 молярным избытком требуемого ПЭГ-реагента (например, ARC1905 - 40 кД Sunbright GL2-400NP пара-нитрофенилкарбонат [NOF Corp, Japan], или ARC187 - 40 кД мПЭГ₂-NHS-сложный эфир [Nektar, Huntsville AL]), растворенного в равном объеме ацетонитрила. Полученные в результате продукты очищали ионообменной хроматографией на смоле Super Q 5PW (30) (Tosoh Biosciences) и обессоливали, используя обращенно-фазовую хроматографию, осуществляемую на смоле Amberchrom CG300-S (Rohm and Haas), и лиофилизировали. Структура ARC187 (SEQ ID NO:5) показана на фиг.21, а структура ARC1905 (SEQ ID NO:67) показана на фиг.22.

ПРИМЕР 4

Модель изолированного перфузируемого сердца

Пример 4A: Доказательство принципа с использованием ARC186

Средняя концентрация компонента комплемента C5 в плазме человека составляет примерно 500 нМ. При воздействии на изолированные сердца мышей, перфузируемые буфером Кребса-Хензелайта, 6% плазмой человека, активируется каскад комплемента человека, приводя к расщеплению C5 на C5a и C5b. Компонент C5b затем образует комплекс с компонентами комплемента C6, C7, C8 и C9, также известный как «мембраноатакующий комплекс» («MAC» или C5b-9), который повреждает кровеносные сосуды сердца и кардиомиоциты, таким образом приводя к дисфункции миокарда (повышенному конечному диастолическому давлению, аритмиям) и асистолии (Evans et. al., Molecular Immunology, 32, 1183-1195 (1995)). Ранее в данной модели тестировали моноклональные и одноцепочечные антитела, которые блокируют расщепление C5 человека (пекселизумаб или одноцепочечный scFv-вариант пекселизумаба) и показали, что они ингибируют повреждение и дисфункцию миокарда (Evans et al., 1995).

Данную модель использовали для установления того, что блокирующий C5 аптамер ARC186 (SEQ ID NO: 4) подобно пекселизумабу ингибировал опосредованное C5 человека повреждение комплементом изолированных перфузируемых сердец мышей. Мышей C57B1/6 приобретали из Charles River Laboratories, (Wilmington, MA). Коротко, после индукции глубокой анестезии у каждой мыши извлекали сердце и закрепляли на тупой игле, вставленной в аорту, через которую сердце непрерывно перфузировали буфером Кребса-Хензелайта. Датчик давления (Mouse Specifics, Boston, MA) вставляли в левый желудочек, обеспечивая возможность непрерывного измерения частоты сердечных сокращений и внутрижелудочкого давления. После 15-минутного периода уравновешивания, во время которого получали измерения исходного уровня, сердца перфузировали буфером и 6% плазмой человека +/- аптамер в различных концентрациях (см. фиг.23). Во время таких исследований и как описано в Evans et al. авторы показали, что сердца, которые перфузировали буфером Кребса-Хензелайта + 6% плазмой человека, прекращали работать в течение 5 минут после добавления плазмы к перфузату, тогда как сердца, которые непрерывно перфузировали только буфером, продолжали биться более двух часов. Поэтому продолжительность каждого эксперимента произвольно выбирали равной 15 минутам. План данного исследования с использованием ARC186 представлен на фиг.23.

Внутрижелудочковое давление непрерывно наблюдали и регистрировали, получая кривую волны давления (фиг. 24 и 25). Самая низкая точка отклонения представляет конечно-диастолическое давление («EDP») и самая высокая точка отклонения представляет систолическое давление («SP»). Волны давления исходного уровня показаны слева от вертикальной черной линии, обозначенной «0», показанной на каждой кривой. Как описано ранее (Evans et al., 1995), сердца, которые перфузировали 6% плазмой человека, претерпевали быстрое увеличение конечно-диастолического давления в левом желудочке, в конечном итоге завершающееся асистолией (остановкой сердца) в течение 5 минут (Фиг.24). При добавлении к плазме нерелевантного аптамера в 50-кратном молярном избытке также наблюдали повышенное EDP и асистолию (фиг.24).

Когда в систему добавляли ARC186 в молярно-эквивалентном количестве, также имело место стремительное увеличение EDP, завершающееся асистолией (фиг.25). Во всех трех группах сердец, которые испытывали опосредованное комплементом повреждение, повышенное EDP и асистолию, сердце выглядело отечным и набухшим к концу эксперимента. Когда ARC186 добавляли к плазме в 10-кратном или 50-кратном (фиг.25) молярном избытке, волны желудочкового давления оставались в норме, и асистолия не наблюдалась. Кроме того, в таких группах не наблюдали описанного ранее отека и набухания.

Во время каждого эксперимента регистрировали частоту сердечных сокращений с 5-минутными интервалами, и среднюю частоту сердечных сокращений для группы в течение каждого интервала изображали графически. Как показано на фиг.26, в сердцах, перфузируемых без аптамера или с нерелевантным аптамером, быстро развивалась асистолия, обычно в течение 5 минут. ARC186, добавляемый в систему в молярно эквивалентном количестве, немного замедлял наступление асистолии. Однако сердца в такой группе в конце концов останавливались. ARC186, добавляемый к плазме в 10-кратном или 50-кратном молярном избытке, сохранял частоту сердечных сокращений на протяжении каждого эксперимента.

Увеличение массы сердца в процентах по сравнению с исходным уровнем рассчитывали для типичного образца прекративших работу сердец (без аптамера или при 50-кратном молярном избытке нерелевантного аптамера) и сравнивали с защищенными ARC186 сердцами (10-кратным и 50-кратным молярным избытком ARC186). Как показано на фиг.27, масса защищенных ARC186 сердец возрастала значительно меньше, чем масса прекративших работу сердец в контрольной группе.

Так как ARC186 ингибирует C5, но не ингибирует расщепление C3, то в экссудате, вытекающем из изолированных сердец, защищенных ARC186, должны обнаруживаться продукты расщепления C3 (C3a), а не продукты расщепления C5 (C5a или C5b). Чтобы непосредственно показать, что ARC186 ингибировал расщепление C5 плазмы человека, измеряли относительные уровни белков комплемента человека C5a и C5b (продукты расщепления C5) и C3a (продукт расщепления C3) в забуференном экссудате в разных группах, используя коммерчески доступные наборы для ELISA (набор для ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA; набор для ELISA C5a и C3a, BD Biosciences, San Diego, CA). ARC186 ингибировал расщепление C5 в плазме человека и продукцию C5a (фиг.28) и C5b-9 (фиг.29) зависимым от дозы образом. Напротив, ARC186 не оказывал влияния на расщепление C3 человека на C3a и C3b (фиг.30), что дополнительно свидетельствует о специфичности молекулы по отношению к C5.

После образования фрагменты комплемента C3b и C5b откладываются локально в тканях вблизи места активации комплемента. После завершения экспериментов сердца мышей замораживали в среде OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), делали срезы и затем красили, используя стандартную иммуногистохимию, в отношении присутствия C3b человека (клон H1l, Chemicon, Temecula, CA), C5b-9 человека (клон aE11, DAKO, Carpinteria, CA) или контрольного IgG мыши (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Результаты исследования представлены на фиг.31.

Как описано в данном исследовании, блокирующий C5 аптамер ARC186 тестировали в модели ex vivo опосредованного компонентом комплемента C5 повреждения ткани, в которой использовали изолированные сердца мышей, перфузируемые буфером Кребса-Хензелайта и 6% гепаринизированной плазмой человека, и которая основана на модели, описанной в ранее опубликованном исследовании, в котором тестировали влияние анти-C5-антитела пекселизумаба на систему комплемента (Evans, Molecular Immunol 32: 1183, (1995). Используя такую модель, было показано, что блокирующий C5 аптамер (a) ингибировал расщепление C5 плазмы человека (но не C3), (b) ингибировал отложение C5b человека (но не C3b) на ткани мышиных сердец и (c) ингибировал опосредованную C5b-9 человека дисфункцию миокарда при клинически соответствующих концентрациях (5 мкМ, 10-кратном молярном избытке аптамера по сравнению с C5). Полученные данные показывают, что, когда каскад комплемента человека активируется физиологически соответствующим образом, блокирующие C5 аптамеры способны ингибировать расщепление C5 в плазме и предотвращать повреждение и дисфункцию миокарда.

Пример 4B: Эффективность пегилированного аптамера

Материалы и способы, используемые в данном исследовании, были точно такими же, как описано в примере 4A выше. Дизайн эксперимента и результаты представлены на фиг.32. В первой половине эксперимента использовали гепаринизированную плазму человека (Center for Blood Research, Harvard Medical School, Boston, MA) в качестве источника комплемента, а во второй половине использовали гепаринизированную плазму макак-крабоедов (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) в качестве источника комплемента. Пегилированный аптамер (ARC658; SEQ ID NO: 62) добавляли в систему в возрастающих молярных соотношениях. Хотя собирали все соответствующие кривые давления в желудочке, в таблице указано наличие или отсутствие возрастания конечно-диастолического давления (EDP), наступала ли асистолия или не наступала и время до прекращения работы сердца (определяемое как наличие повышенного EDP и асистолии).

В ходе экспериментов с использованием плазмы человека определили, что оптимальная доза AR658 (SEQ ID NO: 62) равна молярно эквивалентному количеству (500 нМ), тогда как в ходе экспериментов с использованием плазмы приматов, отличных от человека, был необходим 50-кратный молярный избыток (25 мкМ), чтобы защитить сердце от опосредованного C5b повреждения (см. фиг.32).

Полученные данные согласуются с различиями в аффинности анти-C5-аптамера по отношению к C5 человека и к C5 приматов, отличных от человека, о которых свидетельствуют данные, полученные in vitro. Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, в последующих ФК/ФД-исследованиях на макаках-крабоедах, описанных в примере 5, авторы дополнительно показали, что 30-кратный молярный избыток аптамера был необходим для ингибирования опосредованного зимозаном расщепления C5 в плазме, что дополнительно подтверждает точку зрения о том, что аптамер связывает C5 приматов с меньшей аффинностью, чем C5 человека.

Описанные исследования вместе взятые показывают, что блокирующие C5 аптамеры ARC 186 (SEQ ID NO: 4) и в большей степени ARC658 (SEQ ID NO: 62) являются эффективными в модели изолированного перфузируемого сердца мыши. Указанная модель также демонстрирует, что необходимо использовать значительно больше ARC658 (SEQ ID NO: 62) для ингибирования повреждения сердца, опосредованного C5 плазмы макак-крабоедов (30-кратный молярный избыток) по сравнению с ингибированием повреждения сердца, опосредованного C5 человека (молярный эквивалент), что дополнительно подтверждает данные in vitro, которые показали, что аптамер имеет более низкую аффинность по отношению к C5 приматов. Наконец, полученные данные свидетельствуют, что макакам-крабоедам необходимо вводить дозу, превышающую 30-кратный молярный избыток, чтобы продемонстрировать блокаду C5 in vivo во время ФК/ФД-исследований.

ПРИМЕР 5

Метаболизм и фармакокинетика анти-C5-аптамеров у животных

В примерах 5A-5G все основанные на массе данные о концентрациях отражают только молекулярную массу олигонуклеотидной части аптамера, безотносительно к массе, добавляемой конъюгированием с ПЭГ.

Пример 5A: Метаболическая стабильность ингибитора C5 ARC186 в плазме приматов и крыс

Непегилированный олигонуклеотидный предшественник аптамеров (т.е. ARC186; SEQ ID NO: 4) тестировали в плазме крыс и макак-крабоедов (Charles River Labs, Wilmington, MA), чтобы оценить его стабильность, кинетические параметры скорости и пути разрушения. Тестирование осуществляли, используя радиоактивно меченный на 5'-конце (³²P) аптамер, инкубируемый при 37°C в 95% объединенной плазме (цитратной) в течение 50 часов. В выбранных временных точках отбирали аликвоты содержащей аптамер плазмы, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C. Выявление и анализ аптамера и его метаболитов в плазме осуществляли, используя экстракцию смесью жидкость-жидкость (фенол-хлороформ) с последующим гель-электрофорезом (в 10% денатурирующем полиакриламидном секвенирующем геле) и авторадиографией высокого разрешения.

На фиг.33 показан линейно-логарифмический график процентного содержания остаточного полноразмерного аптамера как функции времени инкубации в плазме крыс и макак-крабоедов. Профиль разрушения в плазме обоих видов имеет по существу монофазный вид, при этом константа скорости составляет примерно k~0,002 час^-1.

Пример 5B: Фармакокинетика ARC657, ARC658 и ARC187 у крыс после внутривенного введения

Чтобы оценить фармакокинетический профиль ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) и оценить требуемый уровень дозы и частоту введения дозы у приматов и человека, проводили фармакокинетическое исследование у крыс Sprague-Dawley (Charles River Labs, Wilmington, MA), которым вводили катетер. Аптамеры готовили для инъекции в концентрации 10 мг/мл (масса олигонуклеотида) в стандартном физиологическом растворе и стерильно фильтровали (0,2 мкМ) в предварительно простерилизованный флакон в асептических условиях. Путь введения, используемый в исследовании на крысах, представлял собой введение внутривенного болюса через хвостовую вену в дозе 10 мг/кг. Ветви исследования состояли из 3 животных на группу, от которых многократно брали кровь перед введение дозы и в указанных временных точках на протяжении 48 часов. Дизайн исследования в общих чертах представлен на фиг.34. Образцы крови получали через хирургически имплантированные в яремные вены катетеры, сразу переносили в покрытые EDTA пробирки, перемешивали переворачиванием и помещали на лед вплоть до обработки для получения плазмы.

Плазму собирали центрифугированием пробирок, содержащих смесь кровь-EDTA, при 5000 об/мин в течение 5 минут и надосадок (плазму) переносили в новую предварительно помеченную пробирку. Образцы плазмы хранили при -80°C вплоть до анализа. Анализ образцов плазмы в отношении ARC187 осуществляли, применяя форму гомогенного анализа с использованием прямого добавления аликвот плазмы в лунки для анализа, содержащие коммерчески доступный флуоресцентный реагент для выявления нуклеиновой кислоты Oligreen ^TM (Molecular Probes, Eugene, OR). После короткого периода инкубации (5 мин) при комнатной температуре с защитой от света анализируемые планшеты подвергали регистрации с помощью устройства для регистрации флуоресценции в планшетах (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Сигнал флуоресценции из каждой лунки был пропорционален концентрации аптамера в лунке, и концентрацию в образце рассчитывали интерполяцией значений флуоресценции на основе стандартной кривой флуоресценция-концентрация (средние значения на основе кривых в двух повторах или трех повторах). Средние концентрации в плазме получали для каждой временной точки на основании данных для трех животных в каждой группе. Данные зависимости концентрации в плазме от времени подвергали некамерному анализу (NCA), используя промышленную стандартную компьютерную программу фармакокинетического моделирования WinNonLin^TM v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Получали оценки следующих первичных фармакокинетических параметров: максимальной концентрации в плазме C_max; площади под кривой концентрация-время AUC; конечного времени полужизни t_1/2; конечного клиренса Cl и объема распределения в стационарном состоянии V_ss .

Данные зависимости средней концентрации в плазме от времени показаны на фиг.35 и графически изображены на фиг.36. Данные зависимости концентрации от времени подвергали некамерному анализу (NCA), используя WinNonLin^TM v.4.0. Указанный анализ давал значения, представленные на фиг.37.

Как предполагалось, 40 кД-аптамер ARC187 (SEQ ID NO: 5) имел самое длительное время полужизни, а 20 кД-аптамер, ARC657 (SEQ ID NO: 61) - самое короткое. Наблюдаемый V_ss относительно известного объема плазмы (~40 мл/кг) свидетельствовал об умеренной степени связывания/секвестрации ARC187 (SEQ ID NO: 5) с белками и/или тканевым матриксом во внесосудистом пространстве. Исходя из необходимости поддержания 5-кратного молярного избытка аптамера результаты данного исследования свидетельствуют, что ARC187 (SEQ ID NO: 5) обеспечивает значительное преимущество в отношении частоты введения доз и общего количества аптамера, необходимого для поддержания требуемых уровней в плазме.

Предыдущие исследования (данные не показаны) на грызунах и приматах с использованием аптамеров сходного состава показали пропорциональность/линейность доз при дозах до 30 мг/кг, так что можно предполагать, что такой уровень доз не будет приводить к нелинейному поведению фармакокинетических параметров.

Пример 5C: Фармакокинетика ARC187 и ARC1905 у мышей после внутривенного введения

Чтобы оценить фармакокинетический профиль олигонуклеотидного остова ARC186 (SEQ ID NO: 4), конъюгированного с другим разветвленным ПЭГ с М.м. 40 кД, отличным от ARC187 (SEQ ID NO: 5), проводили фармакокинетическое исследование на самках мышей CD-1 (полученных из Charles River Labs, Wilmington, MA). Аптамеры готовили для инъекции в концентрации 2,5 мг/мл (масса олигонуклеотида) в стандартном физиологическом растворе и стерильно фильтровали (0,2 мкМ) в предварительно простерилизованный флакон в асептических условиях. Путь введения, используемый в исследовании на мышах, представлял собой введение внутривенного болюса через хвостовую вену в дозе 10 мг/кг. Ветви исследования состояли из 3 животных на группу, от которых брали кровь перед введением дозы (т.е. в контрольной группе, не получавшей дозы) и в указанных временных точках на протяжении 72 часов. Дизайн исследования в общих чертах представлен на фиг.38A.

Образцы крови получали посредством терминальной пункции сердца, сразу переносили в покрытые EDTA пробирки, перемешивали переворачиванием и помещали на лед вплоть до обработки для получения плазмы. Плазму собирали центрифугированием пробирок, содержащих смесь кровь-EDTA, при 5000 об/мин в течение 5 минут, и надосадок (плазму) переносили в новую предварительно помеченную пробирку. Образцы плазмы хранили при -80°C вплоть до анализа. Анализ образцов плазмы в отношении ARC187 и -1905 осуществляли, применяя форму гомогенного анализа с использованием прямого добавления аликвот плазмы в лунки для анализа, содержащие коммерчески доступный флуоресцентный реагент для выявления нуклеиновой кислоты Oligreen^TM (Molecular Probes, Eugene, OR). После короткого периода инкубации (5 мин) при комнатной температуре с защитой от света анализируемые планшеты подвергали регистрации с помощью устройства для регистрации флуоресценции в планшетах (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Сигнал флуоресценции из каждой лунки был пропорционален концентрации аптамера в лунке, концентрации в образцах рассчитывали интерполяцией значений флуоресценции на основе стандартной кривой флуоресценция-концентрация (средние значения на основе кривых в двух повторах или трех повторах). Средние концентрации в плазме получали для каждой временной точки на основании данных для трех животных в каждой группе. Данные зависимости концентрации в плазме от времени подвергали некамерному анализу (NCA), используя промышленную стандартную компьютерную программу фармакокинетического моделирования WinNonLin^TM v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Получали оценки следующих первичных фармакокинетических параметров: максимальной концентрации в плазме, C_max; площади под кривой концентрация-время AUC; конечного времени полужизни t_1/2; конечного клиренса Cl и объема распределения в стационарном состоянии V_ss . Данные зависимости средней концентрации в плазме от времени графически изображены на фиг.38B.

Данные зависимости концентрации от времени подвергали некамерному анализу (NCA), используя WinNonLin^TM v.4.0. Указанный анализ давал значения, представленные на фиг.38C. Как предполагалось, ПЭГ с М.м. 40 кД от обоих поставщиков были фармакокинетически эквиваленты у мышей.

Те же самые образцы для ARC187 и -1905, которые использовали в анализе oligreen, описанном выше, анализировали, используя утвержденный анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с УФ-регистрацией.

Средние значения концентрации в плазме для ARC187 и ARC1905 рассчитывали, используя Microsoft Excel 2003. Когда значения концентрации в плазме были ниже LLOQ биоаналитического анализа перед введением дозы (время 0), брали нулевое значение. Значения ниже LLOQ для образцов, взятых после введения дозы, не включали в расчеты средней концентрации в плазме. Данные о средней концентрации в плазме использовали в независимом от модели ФК-анализе с применением WinNonlin, версия 5.1 (Pharsight Corporation, Mountainview, CA). Площадь под кривой концентрация в плазме-время (AUC_{0-последнее}) оценивали, используя правило трапеций для линейной функции. При расчетах любое значение, которое было ниже LLOQ анализа, за исключением образца, взятого перед введением дозы, исключали из расчетов оценки ФК-параметра. Кажущееся конечное время полужизни рассчитывали, используя формулу t_1/2=0,693/ _z, где _z означает константу скорости элиминации, оцениваемую на основании конечного наклона линии регрессии для кривой зависимости концентрации от времени. По меньшей мере три значения концентрации в плазме после пиковой концентрации в конечной фазе использовали для определения _z, и требовалось, чтобы коэффициент детерминации (r²) был 0,85.

В общем анализ ВЭЖХ подтверждает анализ олигонуклеотидов, описанный выше, свидетельствуя об обнаружении того, что ARC1905 и ARC187 были биологически эквивалентными на основе сравнения средних оценок параметров Cmax, AUC_{0-последнее} и AUC_0- . Различия в значениях AUC_{0-последнее} и AUC_0- для ARC1905 по сравнению с ARC187 (которые измеряли посредством ВЭЖХ) хорошо соответствовали критериям допустимости биоэквивалентности ± 20%.

Пример 5D: Исследование накопления в тканях ингибиторов C5 ARC657, ARC658 и ARC187 у мышей после внутривенного болюсного введения

Самок мышей CD-1 получали из Charles River Labs (Wilmington, MA). Препараты ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) готовили для инъекций в физиологическом растворе в концентрации 5 мг/мл. Препараты для введения доз стерильно фильтровали (0,2 мкМ) в предварительно стерилизованный флакон для доз в асептических условиях и вводили животным в виде внутривенного болюса через хвостовую вену в дозе 25 мг/кг. В исследование включали группы по 3 животных для каждой из четырех временных точек, t = перед введением дозы, через 3, 6, 12 часов. После обескровливания сосудистую сеть каждого животного тщательно промывали (V~30 мл) физиологическим раствором, чтобы удалить всю кровь, оставшуюся в сосудистой системе. Ткани (сердце, печень, почки) собирали, взвешивали, затем гомогенизировали при 50% масс./об. в стандартном физиологическом растворе и хранили при -80°C вплоть до момента анализа.

Анализ ткани в отношении ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) осуществляли с использованием анализа типа ELISA, основанном на гибридизации. В данном анализе биотинилированный улавливающий зонд предварительно иммобилизовали в лунках 96-луночного микропланшета при концентрации раствора для связывания 125 нМ в течение 3 час. Лунки планшета 5 раз промывали 1×PBS. Затем планшеты блокировали 150 мкл/лунку 1X SuperBlock в TBS (Pierce Chemical, Rockford, IL). Планшеты снова промывали, закрывали и хранили при 4°C вплоть до использования. В отдельных пробирках образцы отжигали в буфере, содержащем FAM-меченный (5'-флуоресцеин) зонд для выявления образца, при 200 нМ при 90°C в течение 10 мин, затем гасили на льду. Стандарты концентрации и контрольные образцы плазмы/ткани также предварительно отжигали, используя растворы зонда для регистрации образца, и затем пипеткой разносили в лунки планшета для анализа, содержащие иммобилизованный биотинилированный улавливающий зонд и отжигали при 45°C в течение 2,5 час. Затем планшеты снова промывали и заполняли 100 мкл/лунку раствора, содержащего 1×PBS, содержащий 1 мкг/мл моноклонального антитела против флуоресцеина, конъюгированного с пероксидазой хрена (анти-ФИТЦ-мАт-HRP, Molecular Probes, Eugene, OR), в 1×PBS и инкубировали в течение примерно 1 часа. Планшеты снова промывали, как описано выше. Лунки планшета для анализа затем заполняли 100 мкл раствора, содержащего флуорогенный субстрат HRP (QuantaBlu, Pierce Chemical, Rockford, IL), и инкубировали в течение 20-30 мин, защищая от света. После 45-минутной инкубации добавляли 100 мкл/лунку раствора для остановки реакции, чтобы погасить реакцию, продуцирующую флуоресцентный преципитат. Планшеты сразу же регистрировали в устройстве для регистрации флуоресценции в микропланшетах (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), используя возбуждение флуоресценции при 325 нМ и регистрацию эмиссии при 420 нМ. Каждую лунку регистрировали 10 раз. Все три аптамера выявляли в ткани сердца в трех временных точках (фиг.39).

Пример 5E: Фармакокинетика и фармакодинамика C5-ингибиторов ARC657, ARC658 и ARC187 у макак-крабоедов после внутривенного введения

Исследование 1

Препараты ARC657 (SEQ ID NO: 61), ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) для инъекции готовили в стандартном физиологическом растворе в концентрации 10 мг/мл и дозированные препараты стерильно фильтровали (0,2 мкМ) в предварительно простерилизованные флаконы для доз в асептических условиях. Путь введения, используемый в исследовании на макаках, представлял собой введение внутривенного болюса через хирургически имплантированный в бедренную вену катетер в дозе 30 мг/кг (примерно 50-кратный молярный избыток). Дизайн исследования в общих чертах представлен на фиг.40. Образцы крови получали через имплантированные в бедренные вены катетеры, сразу переносили в покрытые цитратом натрия пробирки, перемешивали переворачиванием и помещали на лед вплоть до момента центрифугирования для отделения плазмы (3000 об/мин в течение 5 минут). Затем плазму делили на аликвоты по 250 мкл, которые хранили при -80°C, и одну аликвоту каждого образца оценивали в отношении концентрации аптамера, используя основанный на флуоресценции анализ Oligreen ^TM, описанный выше в разделе ФК у крыс.

Данные зависимости первичной концентрации в плазме от времени представлены в форме таблицы на фиг.41. как предполагалось, 40 кД-ПЭГ-аптамер ARC187 (SEQ ID NO: 5) оставался в плазме в течение наиболее длительного периода времени, тогда как 20 кД-ПЭГ-аптамер ARC657 (SEQ ID NO: 61) сохранялся в течение наиболее короткого периода времени. Просмотр данных, показанных на фиг.41, свидетельствует, что данные лучше всего соответствуют двухкамерной модели. Таким образом, оценки фармакокинетических параметров, приведенные на фиг.42, были получены на основании двухкамерной модели с использованием промышленной стандартной компьютерной программы моделирования фармакокинетики WinNonLin^TM v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).

Как показано на фиг.42, все аптамеры имели сходное значение C_max, от 23 до 30 мкМ, что свидетельствует о том, что доза аптамера (30 мг/кг) была достаточной для достижения 50-кратного молярного избытка аптамера в плазме по сравнению с концентрацией C5 (50-кратный молярный избыток, примерно 25 мкМ). Хотя аптамеры ARC657 (20 кД ПЭГ) (SEQ ID NO: 61) и ARC658 (30 кД ПЭГ) (SEQ ID NO: 62) отличались по молекулярной массе на 10000, они имели сходные значения экспозиции (AUC), t_1/2( ) и t_1/2( ). В отличие от этого ARC187 (SEQ ID NO: 5) имел значительно более высокие значения экспозиции (AUC), длительное t_1/2 ( ) и немного более длительное t_1/2 ( ), чем другие молекулы.

Дополнительные аликвоты образцов плазмы, собранные во время исследования фармакокинетики, затем анализировали in vitro, чтобы определить эффективность блокады C5 приматов. Анализ активации зимозаном осуществляли, как описано выше, чтобы определить количество образованных C5b-9 и C5a приматов соответственно. Данные представляли графически в нескольких разных формах, включая зависимость концентрации C5b-9 от времени взятия образца (фиг.43a), зависимость концентрации C5b-9 от концентрации аптамера (фиг.43b), зависимость концентрации C5a от времени взятия образца (фиг.43c) и зависимость концентрации C5a от концентрации аптамера (фиг.43d).

40 кД-ПЭГ-аптамер ARC187 (SEQ ID NO: 5) ингибировал расщепление C5 приматов (концентрация C5b-9 и C5a) в течение наиболее длительного периода времени (фиг.43a и 43c). Когда данные о C5b-9 и C5a откладывали на графике против концентрации аптамера, они показали, что концентрация аптамера, блокирующего C5, должна превышать 30-кратный молярный избыток независимо от размера молекул ПЭГ, чтобы полностью ингибировать расщепление C5 (фиг.43b и 43d).

В заключение, данные, полученные в ФК/ФД-исследовании на макаках-крабоедах, показывают, что (a) как предполагалось, по меньшей мере 30-кратный молярный избыток аптамера (концентрация аптамера в плазме примерно 15 мкМ) была необходима для ингибирования расщепления C5 in vivo у макак-крабоедов независимо от размера группы ПЭГ, (b) C5-блокирующие аптамеры не вызывают явной токсичности у данного вида, и (c) в том случае, когда животным вводили относительно высокие уровни доз (50-кратный молярный избыток), уровни аптамера в плазме попадали в пределы подходящего для анализа диапазона во время периода отбора образцов, что обеспечивало возможность расчета фармакокинетических параметров.

Пример 5F: Фармакокинетика и фармакодинамика C5-ингибиторов ARC658 и ARC187 у макак-крабоедов после внутривенного введения

Исследование 2

Исследование 2 было сходным по дизайну с исследованием 1, описанным выше, со следующими исключениями: a) оценивали только два соединения (ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5); b) количество животных увеличивали до четырех в группе; и c) образец плазмы во временной точке 1 минута исключали и заменяли образцом во временной точке 144 часа, чтобы обеспечить возможность расчета конечного времени полужизни, основанного на большем количестве точек получения данных. Способы приготовления и дозирования указанных двух аптамеров, взятия образцов крови и выделения плазмы были идентичными способам, описанным выше для исследования 1. Дизайн исследования 2 суммирован на фиг.44.

После завершения исследования 2 аликвоты плазмы анализировали, как описано в исследовании 1, чтобы определить a) концентрацию аптамера в плазме в разных временных точках после внутривенного введения, и b) эффективность блокады C5.

Концентрацию аптамера в плазме изображали графически как функцию времени (фиг.45), и первичные данные для ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) представлены в форме таблицы на фиг.39 и 40 соответственно. 40 кД-ПЭГ-аптамер ARC187 (SEQ ID NO: 5) сохранялся в плазме в течение наиболее длительного периода времени. Просмотр фиг.45 показывает, что данные лучше всего соответствуют двухкамерной модели. Таким образом, оценки фармакокинетических параметров, приведенные на фиг.46, были получены на основании двухкамерной модели с использованием WinNonLin^TM v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).

При сравнении фармакокинетических параметров, полученных в ходе ФК/ФД-исследования 1 и исследования 2, описанных выше, данные для ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5) были сходными за исключением измерения t_1/2( ) для ARC187. Не имея намерения быть связанными какой-либо теорией, предполагают, что расхождения в измерениях t_1/2 ( ) для ARC187 в двух исследованиях вероятно являются следствием небольшой выборки в пилотном исследовании.

Как показано на фиг.46, значения C_max были сходными для ARC658 (SEQ ID NO: 62) и ARC187 (SEQ ID NO: 5). В отличие от этого экспозиция с лекарственным средством (AUC) была значительно больше у животных, обработанных ARC187 (SEQ ID NO: 5). Также ARC187 имел более длительные значения t_1/2( ) и t_1/2( ) по сравнению с ARC658 (SEQ ID NO: 62). Приведенные данные наряду с данными, полученными в ходе ФК/ФД-исследования 1, показывают, что C5-блокирующие аптамеры ARC187 могут обеспечивать наиболее эффективную блокаду C5 in vivo для данной дозы.

Дополнительные аликвоты образцов плазмы, собранные во время исследования фармакокинетики, затем анализировали in vitro, чтобы определить эффективность блокады C5 приматов. Как и ранее, осуществляли анализ активации зимозаном, чтобы определить количество образованных C5b-9 и C5a приматов соответственно. Данные представляли графически в виде зависимости концентрации C5b-9 от концентрации аптамера (фиг.47) и зависимости концентрации C5a от концентрации аптамера (фиг.48). Как показано ранее в ходе ФК/ФД-исследования 1, концентрация C5-блокирующего аптамера должна превышать 30-кратный молярный избыток (аптамера к концентрации C5 в плазме) или примерно 15 мкМ независимо от размера молекулы ПЭГ, чтобы полностью ингибировать расщепление C5 приматов (фиг.41 и 42).

При просмотре данных в таблицах на фиг.39 и 40 очевидно, что после введения в/в-болюса 30-мг/кг ARC658 (SEQ ID NO: 62) сохранялся в концентрации выше 15 мкМ в течение примерно 4 часов, тогда как ARC187 сохранялся в концентрации выше 15 мкМ в течение примерно 8 часов. Таким образом, при введении сходной дозы лекарственного средства 40 кД-аптамер ARC187 обеспечивает клиническую эффективность в течение примерно в два раза более длительного периода, чем 30 кД-аптамер ARC658 (SEQ ID NO: 62).

В заключение, макак-крабоедов необходимо лечить по меньшей мере 30-кратным молярным избытком аптамера по сравнению с C5 в плазме, чтобы блокировать превращение C5 in vivo. Полученные данные согласуются с предыдущими исследованиями in vitro (гемолиз) и ex-vivo (изолированное перфузируемое сердце мыши), которые свидетельствуют, что связывающие C5 аптамеры имели более низкую аффинность по отношению к C5 приматов, чем к C5 человека. Было показано, что C5-блокирующие аптамеры могут быть безопасным образом доставлены в виде внутривенного болюса в дозе до 30 мг/кг, которая примерно равна 50-кратному молярному избытку аптамера по сравнению с концентрацией C5.

Пример 5G: ARC1905 у макак-крабоедов после в/в введения болюса

Фармакодинамику ингибитора C5 ARC1905 оценивали у макак-крабоедов после внутривенного введения. Препараты ARC1905 для инъекции готовили в стандартном физиологическом растворе в концентрации 7,5 мг/мл и препараты для введения дозы стерильно фильтровали (0,2 мкМ) в предварительно простерилизованные флаконы в асептических условиях. Макакам-крабоедам (n=4) вводили дозу в концентрации 0 (контроль в виде физиологического раствора) или 30 мг/кг посредством внутривенного болюсного введения. Образцы крови получали из периферической вены или порта доступа к артерии и образцы крови (0,5 мл) переносили в пробирки, содержащие дикалий (K₂)- EDTA, помещали на лед с водой и центрифугировали в пределах 30 минут сбора примерно при 4°C.

Образцы плазмы анализировали in vitro, чтобы определить эффективность ARC1905 в отношении блокады C5 у приматов. Анализ с применением зимозана, описанный ранее для ARC1905 в примере 1C, использовали для определения количества образованного C5a приматов. Снижение значений C5a после активации зимозаном через 0,5 и 2 часа после введения дозы свидетельствует, что ARC1905 ингибирует расщепление C5 in vivo у макак-крабоедов сходным с ARC187 образом при введении дозы примерно в такой же концентрации и таким же путем введения, как было измерено in vitro с использованием анализа активации зимозаном.

Пример 5H: Фармакокинетика и фармакодинамика ингибитора C5 ARC187 у макак-крабоедов после в/в введения болюса и инфузии

Фармакокинетические (ФК) и фармакодинамические (ФД) профили ARC187 (SEQ ID NO: 5) также оценивали у макак-крабоедов после внутривенного ударного болюса с последующим немедленным началом внутривенной инфузии. Дизайн данного исследования показан на фиг.49.

Ударную болюсную дозу и скорость инфузии, необходимые для достижения целевой устойчивой концентрации в плазме 1 мкМ, рассчитывали с использованием фармакокинетических параметров, полученных на основании исследования только с использованием в/в-болюса, показанных на фиг.50.

Всего трем макакам-крабоедам вводили в/в болюс ARC187 в дозе 1 мг/кг с последующим немедленным началом в/в-инфузии со скоростью 0,0013 мг/кг/мин в течение периода времени 48 час. Образцы цельной крови собирали от 0 до 192 часов после обработки, хранили на льду с водой, обрабатывали для получения плазмы и затем хранили в замороженном виде при -80°C. Концентрацию ARC187 в образцах плазмы определяли, используя анализ флуоресцентного окрашивания нуклеиновой кислоты (описанный в примере 5B) и одобренный GLP анализ высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Способ ВЭЖХ-анализа для определения ARC187 в плазме обезьян подтвержден в ClinTrials Bio-Research (Montreal, Canada). Подтверждающее исследование соответствовало требованиям положений надлежащей практики лабораторных исследований (GLP) Управления по надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) (21 CFR §58). Способ анализа ВЭЖХ подтверждали в отношении избирательности, линейности, более низкого предела количественной оценки (LLOQ), переноса, точности и достоверности внутри анализа, точности и достоверности при сравнении разных анализов, стабильности исходного раствора, стабильности инъекционной среды, кратковременной стабильности матрикса, стабильности при замораживании-оттаивании, долговременной стабильности матрикса и целостности при разбавлении. Определяли приемлемый линейный динамический диапазон концентраций, составляющий от 0,080 до 50,0 мкМ.

Измеренный ФК-профиль ARC187 в указанных условиях хорошо соответствовал рассчитанному профилю, созданному с использованием ФК-параметров для случая введения только в/в-болюса (см. фиг.51). Целевая концентрация в плазме 1 мкМ устанавливалась спустя <5 мин после введения дозы и сохранялась на всем протяжении инфузии. После прекращения инфузии аптамер имел конечный период полувыведения t_1/2( ) ~40-60 час.

Фармакодинамическую активность ARC187 (SEQ ID NO: 5) у макак-крабоедов оценивали ex vivo, используя образцы плазмы, собранные во время ФК-исследования, в описанном ранее анализе активации зимозаном, модифицированном таким образом, что плазму в образцах макак-крабоедов разбавляли в 10 раз в 10% плазме человека и затем обрабатывали 5 мг/мл зимозана. Активацию C5, отражением которой является появление продукта расщепления C5a, измеряли в ELISA, специфичном по отношению к C5a человека (набор для ELISA C5a, BD Biosciences, San Diego, CA). Затем концентрацию активного ARC187 в каждом образце количественно оценивали посредством сравнения со стандартной кривой, полученной в результате анализов активации зимозаном с использованием образцов, приготовленных с известными уровнями ARC187 (см. фиг.52). Данное исследование показывает, что ARC187 сохраняет свою активность, направленную против комплемента, на протяжении и после окончания инфузии на уровнях, по существу совпадающих с фармакокинетическим профилем, описанным выше.

Пример 5I: Прогнозирование доз, необходимых для человека

Дозы, необходимые для профилактики, ослабления или лечения осложнений у человека, связанных с CABG-операцией, основаны на следующих предположениях: во-первых, пациентам с CABG должны вводить одну внутривенную болюсную дозу анти-C5-аптамера до начала операции с последующей непрерывной инфузией для установления и поддержания стационарной концентрации в плазме 1,5 мкМ в течение 24-48 часов после CABG-операции. Оценки болюсной дозы и скорости инфузии основаны на расчетах с использованием фармакокинетических параметров, полученных в ходе описанных выше исследований с введением только в/в-болюса и введением болюса плюс инфузии у макак-крабоедов. Определенная болюсная доза ARC187 составляет 1 мг/кг, и соответствующая скорость инфузии составляет 0,0013 мг/кг/мин. Для такой схемы - болюс плюс 48-часовая инфузия прогнозируемая общая потребность в лекарственном средстве составляет 0,4 г для ARC187, при этом масса относится только к массе олигонуклеотида (см. колонку 7 в таблице на фиг.53). Колонка 2 таблицы, показанной на фиг.53, относится к массе группы ПЭГ, конъюгированной с олигонуклеотидной частью ARC187, колонка три относится к молекулярной массе олигонуклеотидной части ARC187 (и будет такой же для всех аптамеров согласно изобретению, которые содержат ARC186 (SEQ ID NO: 4) в качестве олигонуклеотидной последовательности), колонка 4 относится к молекулярной массе 40 кД-ПЭГ, конъюгированного с ARC186 (SEQ ID NO: 4) посредством химических групп, активных по отношению к амину, как описано в примере 3C выше, колонка 5 относится ко времени полужизни ARC187 в фазе в двухкамерной модели, и колонка шесть относится ко времени полужизни ARC187 в фазе в двухкамерной модели.

ПРИМЕР 6

Взаимодействие анти-C5-аптамеров и гепарина/протамина

Одним из предполагаемых применений анти-C5-аптамера является применение в качестве профилактического средства для предотвращения или уменьшения воспалительных побочных эффектов, связанных с трансплантационной хирургией по шунтированию коронарных артерий (CABG). Высокие концентрации антикоагулянта гепарина (3-5 единиц/мл или 1-2 мкМ) обычно вводят во время CABG, чтобы предотвратить тромбоз и сохранить проходимость через насос для шунтирования; устранение эффекта, вызываемого гепарином, после процедуры и восстановление нормального гомеостаза достигается введением также высоких концентраций протамина (~5 мкМ). Принимая во внимание потенциальную опасность для пациентов любого вмешательства в эффективность каждого из указанных лекарственных средств, было необходимо показать, что анти-C5-аптамеры (1) не изменяют активности каждого из лекарственных средств и (2) не оказывают собственного влияния на гомеостаз, которое может осложнять антикоагуляционное лечение пациентов.

Гепарин является сульфатированным полисахаридом с результирующим отрицательным зарядом и средней молекулярной массой примерно 15 кД, который оказывает ингибирующее влияние на ряд протеаз в каскаде коагуляции, стимулируя взаимодействия с антитромбином. Протамин, полипептид с высоким положительным зарядом, способен блокировать активность гепарина посредством плохо охарактеризованного взаимодействия, которое по меньшей мере отчасти является электростатическим по своей природе. Функциональное ядро ARC187 (SEQ ID NO: 5) подобно гепарину является в значительной степени анионным. Таким образом, возможно, что ARC187 мог бы неспецифично связываться с участками связывания гепарина или протамином и мешать активностям указанных молекул. В следующих исследованиях изучали природные антикоагуляционные свойства ARC187 (подобные свойствам гепарина), влияние ARC187 на функцию гепарина, влияние ARC187 на нейтрализацию гепарина протамином и влияние протамина на ингибирующие комплемент свойства ARC187.

Пример 6A: Влияние ARC187 на коагуляцию in vitro

Исследовали влияние ARC187 (SEQ ID NO: 5) на способность плазмы к коагуляции, используя стандартные клинические тесты внешнего и внутреннего путей каскада коагуляции, протромбинового времени (PT) и активированного частичного тромбопластинового времени (aPTT) соответственно. Как показано на фиг.54, титрование цитратной плазмы человека концентрациями, соответствующими большому избытку планируемых доз (до 20 мкМ), не приводило к изменению PT и приводило только к небольшому увеличению aPTT.

Чтобы оценить влияние ARC187 на функции гепарина и протамина in vitro, у 3 человек брали кровь, добавляя 4-5 единиц/мл гепарина, дозы, соответствующие уровням гепарина, используемым при CABG-операциях. Способность таких образцов к коагуляции оценивали, используя время активного свертывания (ACT) - тест на коагуляцию цельной крови, обычно используемый для контроля активности гепарина во время операции. При указанных концентрациях гепарина в отсутствие других добавок ACT значительно увеличивается по сравнению с исходным уровнем от ~150 секунд до ~500 секунд в присутствии 4 ед./мл гепарина или ~800 секунд в присутствии 5 ед./мл гепарина. Добавление 10 мкМ ARC187 к указанным образцам мало влияло на время свертывания, что свидетельствует о том, что ARC187 не мешает антикоагуляционной активности гепарина.

Антикоагулирующее действие гепарина легко нейтрализовали титрованием протамином до 6-8 мкМ (4 ед./мл гепарина) или 12 мкМ (5 ед./мл гепарина). Значения ACT в присутствии гепарина и нейтрализующих концентраций протамина по существу не отличаются от исходного уровня. Так как состоящее из нуклеиновой кислоты ядро ARC187 (12 кД) имеет большую молекулярную массу, чем протамин (5 кД), то можно ожидать, что эквимолярные концентрации ARC187, добавляемые к протамину, могли бы в достаточной степени или полностью отменить нейтрализующую активность протамина. Однако предварительная инкубации протамина примерно с эквивалентными концентрациями ARC187 мало влияла на ACT. В образцах крови, содержащих нейтрализующие концентрации протамина, наблюдали одинаковые значения ACT в присутствии или в отсутствие 10 мкМ ARC187, что свидетельствует о том, что ARC187 оказывает только слабое влияние или вообще не влияет на прокоагулирующую активность протамина. Полученные результаты суммированы на фиг.55.

Пример 6B: Влияние ARC187 на коагуляцию in vivo

Исследовали взаимодействия между функцией гепарина и протамина при сопутствующем введении анти-C5-аптамера ARC187 (SEQ ID NO: 5) при клинических дозах гепарина и клинических/субклинических/сверхклинических дозах протамина, чтобы определить, может ли мешать присутствие субклинических/сверхклинических концентраций в плазме ARC187 отмене антикоагулирующего действия гепарина протамином. Результаты исследования суммированы на фиг.56. Коротко, на значения ACT исходного уровня не влияло добавление 10 мкМ (т.е. 10-кратного молярного избытка клинической дозы) ARC187 при всех тестированных дозах гепарина. Подобным образом, 10 мкМ ARC187 не влиял на степень антикоагулирующего действия гепарина. В отсутствие ARC187 минимальная эффективная доза протамина составляла ~30% (клиническая доза = 100%). Кроме того, на отмену антикоагулирующего действия гепарина 30% протамином не влиял 10-кратный молярный избыток клинической дозы (т.е. 10 мкМ) ARC187. Таким образом, применение ARC187 для ингибирования комплемента в клинических условиях (например, CABG) не должно подвергаться влиянию одновременного применения гепарина и протамина в обычных дозах.

Пример 6C: Влияние гепарина и протамина на направленную против комплемента функцию ARC187

Исследовали влияние гепарина и протамина на направленную против комплемента активность ARC187 (SEQ ID NO: 5) в образцах цитратной цельной крови, активированных зимозаном, как описано в примере 1. Непосредственно перед активацией зимозаном ARC187 титровали в образцы цитратной крови, обработанные в четырех условиях: 1) без обработки (без гепарина или протамина); 2) 4 ед./мл гепарина; 3) 6 мкМ протамина; 4) 4 ед./мл гепарина 4+6 мкМ протамина. После активации зимозаном активацию C5 количественно оценивали посредством ELISA-измерения sC5b-9 в плазме (набор для ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA). Для каждого условия результаты, выраженные в виде процента ингибирования активации C5 в зависимости от концентрации ARC187, были неотличимы, различия были в пределах ошибки (см. фиг.57). Во всех случаях полное ингибирование достигали при 1-2 мкМ ARC187. Таким образом, гепарин и протамин, отдельно или в комбинации при концентрациях, соответствующих их применению при CABG-операциях, по-видимому, не влияют на активность ARC187, направленную против комплемента.

Хотя изобретение охарактеризовано с помощью описания и примеров, специалистам в данной области будет понятно, что изобретение может быть осуществлено на практике в различных вариантах и что приведенное выше описание и примеры предлагаются в целях иллюстрации, а не ограничения следующей далее формулы изобретения.