способ получения депонированных лимфокин-активированных киллеров

Формула изобретения

Способ получения депонированных лимфокин-активированных киллеров (ЛАК), согласно которому выделяют мононуклеарные лимфоциты (МНЛ) из периферической крови или злокачественного выпота центрифугированием на одноступенчатом градиенте фиколла плотностью 1,06-1,08 г/см ³, генерируют и концентрируют ЛАК путем последовательного осаждения МНЛ центрифугированием, ресуспендирования его в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 2-10% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млнМЕ/мл и инкубирования в CO₂ инкубаторе в течение 48-72 ч, а затем депонируют взвесь полученных клеток ЛАК в культуральной среде из расчета 2 млн ЛАК на 200 мл среды на стерилизованные и промытые культуральной средой пористые титановые носители с пористостью 55-60%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам иммунореабилитации онкологических заболеваний.

Известные методы иммунотерапии позволяют получить из малоактивных фракций мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) крови больного значительное количество так называемых лимфокин-активированных киллеров (ЛАК). ЛАК-иммунотерапия расширяет спектр возможностей противоопухолевой терапии. Помимо того, она имеет преимущества по сравнению с традиционными методами: отсутствие токсичности, удовлетворительная переносимость лечения, возможность применения совместно с другими традиционными терапевтическими методами; в случаях лекарственной резистентности, стимуляция местного противоопухолевого клеточного иммунитета приводит к лизису опухоли, а также улучшает качество и продолжительность жизни пациентов. Однако, как показали исследования, биораспределения ЛАК в условиях системного введения активированных лимфоцитов преимущественно накапливаются в паренхиме легких и печени и определяются в области опухолевых узлов в данных органах не более 1 сут. Поэтому для повышения эффективности иммунотерапии использовали многократные введения больших доз ЛАК (до нескольких миллиардов за курс). Высокодозная ИЛ-2/ЛАК-терапия сопровождается выраженными побочными эффектами (лихорадка, озноб, артралгия, миалгия, тошнота, рвота, диарея, нарушения сосудистой проницаемости и нарушение дыхательной функции). В последние годы развиваются методы локальной и локорегиональной адаптивной иммунотерапии, позволяющие создать эффективную концентрацию ЛАК в области опухолевого процесса и минимизировать системные побочные эффекты. Поскольку далеко не во всех случаях имеется возможность адресной доставки ЛАК к опухолевым образованиям, перспективным является разработка методов, позволяющих формировать в различных тканях депо активированных клеток. Продуцируемые в процессе жизнедеятельности депонированных ЛАК цитокины могут оказывать длительное стимулирующее влияние на противоопухолевый иммунитет. Кроме того, в последнее время появились сведения о способности ЛАК, введенных в опухолевые узлы, оказывать не только прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки, но и за счет выделяемых цитокинов рекрутировать в область введения ЛАК другие эффекторы противоопухолевого иммунитета. Важно отметить, что ЛАК могут лизировать опухолевые клетки не только при непосредственном контакте, но и за счет дистантного действия цитокинов, индуцирующих высвобождение цитопатогенных факторов (например, оксида азота) из макрофагов. Структурной основой для создания такого депо могут служить пористые титановые пластинки, являющиеся продуктом скаффолд-технологий (от англ. «scaffold» - строительные леса), которые в настоящее время широко применяются в хирургической и ортопедической практике.

Наиболее близким к заявленному способу является способ получения клеточного трансплантата для лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний, характеризующийся тем, что кровь или взвесь костного мозга центрифугируют в одноступенчатом градиенте фиколла, проводят культивирование МНК в среде RPMI 1640 или DMEM с 5% человеческой сыворотки пациента или АВ сыворотки донора, далее клетки разделяют на моноциты/макрофаги, прикрепляющиеся к подложке, и лимфоциты, не прикрепляющиеся к подложке, МНК помещают в культуральную среду на 2-4 ч и затем сливают неприкрепившиеся лимфоциты для получения незрелых ДК, к оставшимся прикрепившимся клеткам моноцитам/макрофагам добавляют гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), далее для стимуляции созревания ДК используют провоспалительные факторы ИЛ-1 , ФНО- , ИЛ-6 (10 нг/мл), при этом полученные в экстракорпоральных условиях незрелые дендритные клетки (CD83^low, CD86 ^low, CD80^low) инкубируют с лизатом опухоли, или вирусными, или бактериальными антигенами и факторами индукции созревания ДК в течение 1 сут и получают зрелые пульсированные антигенами ДК (CB83^high, CD86^high, CD80 ^high), для получения ЛАК-клеток к лимфоцитам добавляют ИЛ-2 в концентрации 1000 МЕ/мл (см. патент RU 2309753, кл. А61К 35/14, опубл. 10.11.2007). Недостатками известного способа являются необходимость использования многократных введений больших количеств лимфоцитов, а также необходимость локального или локорегионарного введения. Это существенно затрудняет применение этого метода у онкологических больных с опухолями различной локализации.

Задачей изобретения является устранение указанных недостатков.

Технический результат заключается в повышении эффективности получаемого средства для локальной и локорегионарной иммунотерапии онкологических больных. Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что согласно способу получения депонированных лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) выделяют мононуклеарные лимфоциты (МНЛ) из периферической крови или злокачественного выпота центрифугированием на одноступенчатом градиенте фиколла плотностью 1,06-1,08 г/см³, генерируют и концентрируют ЛАК путем последовательного осаждения МНЛ центрифугированием, ресуспендирования его в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 2-10% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млн.МЕ/мл и инкубирования в СО₂-инкубаторе в течение 48-72 ч, а затем депонируют взвесь полученных клеток ЛАК в культуральной среде из расчета 2 млн. ЛАК на 200 мл среды на стерилизованные и промытые культуральной средой пористые титановые носители с пористостью 55-60%.

На фиг.1-4 изображены гистограммы, отражающие иммунофенотип ЛАК,

на фиг.1 - распределение для CD16⁺;

на фиг.2 - распределение для CD56⁺,

на фиг.3 - распределение для CD25⁺;

на фиг.4 - распределение для CD38⁺.

При этом приняты обозначения: Gm - среднегеометрическая отклонение сигнала, CV - коэффициент вариации; в квадратных скобках - регистрирующиеся каналы, после квадратных скобок - средний канал, в круглых скобках процент клеток, экспрессирующих данный антиген, линия M1 - уровень значений, отличных от контроля.

На фиг.5-8 изображена цитотоксическая активность ЛАК, депонированных в скаффолдах, при увеличении в 400 раз.

на фиг.5 - интактные клетки К-562;

на фиг.6 - инкубация интактных ЛАК с клетками К-562;

на фиг.7 - интактные клетки К-562 и пустой скаффолд;

на фиг.8 - инкубация ЛАК, депонированных в скаффолде, с клетками Л-562.

Выделение МНЛ из периферической крови может быть осуществлено различными способами, например центрифугированием в одноступенчатом градиенте фиколла. Для предотвращения свертывания кровь стабилизируют обычно применяемыми для этих целей консервантами, такими как, например, гепарин, цитрат натрия, ЭДТА.

Предлагаемый способ позволяет получать достаточное количество лимфоцитов из 100 мл периферической крови или из одной дозы лейкомассы донора, что значительно упрощает процедуру забора мононукларных лейкоцитов проведения аппаратной сепарации крови.

Культивирование МНЛ происходит в RPMI-1640 или DMEM с 2-10% человеческой сыворотки пациента (или АВ сыворотки донора) в одноразовых пластиковых флаконах объемом 250 мл фирмы Costar или аналогичных флаконах других фирм. Для получения лимфокин-активированных киллеров МНЛ культивируют с интерлейкином-2 в концентрации 0,5-1,0 МЕ/мл.

В качестве скаффолдов используют пористые титановые пластинки пористостью 55-60%, имеющие форму параллелепипедов (15×3×3 мм). Стерилизованные и промытые культуральной средой скаффолды интенсивно встряхивают для освобождения пор от остатков среды и на поверхность граней наносят 2 млн. ЛАК в 200 мкл культуральной среды.

Пример осуществления изобретения.

1. Выделение МНЛ из периферической крови.

МНЛ выделяют из стабилизированной гепарином (25 ед./мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла («Pharmacia», плотностью 1.077 г/см³ ) центрифугированием при 400 g в течение 30 минут. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирают пипеткой и трехкратно отмывают в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждают центрифугированием при 200 g.

2. Генерация ЛАК.

МНЛ подсчитывают, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в среде RPMI 1640 с добавками (HEPES, L-глютамин, гентамицин) в концентрации 1 млн./мл, с добавлением 5% АВ сыворотки человека, интерлейкина-2 в концентрации 0,5-1,0 млн.МЕ/мл и инкубируют в CO₂ -инкубаторе в течение 48-72 ч. Как показано на Фиг.1, популяция активированных МНЛ преимущественно представлена натуральными киллерами (CD16⁺, CD56⁺) и активированными формами лимфоцитов (CD25⁺, CD38⁺).

3. Депонирование ЛАК в пористых титановых скаффолдах.

Стерилизованные и промытые культуральной средой скаффолды интенсивно встряхивали для освобождения пор от остатков среды и наносили на поверхность граней 2 млн. ЛАК в 200 мкл культуральной среды.

4. Микроскопия.

Интактные ЛАК и ЛАК, депонированные в титановых скаффолдах и помещенные в 24-луночные планшеты, просматривают и фотографируют на инвертоскопе Axiovert (Zess, Германия). Как показано на Фиг.2 при микроскопическом исследовании, ЛАК, помещенные в скаффолд, вызывают более выраженный лизис клеток линии К 562, чем интактные ЛАК. При этом не было отмечено рассеивания ЛАК из скаффолда; в лунке наблюдались лишь единичные лимфоидные элементы.

5. Оценка противоопухолевого действия интактных ЛАК и ЛАК, депонированных в пористых титановых скаффолдах, на линии опухолевых клеток К 562.

В лунки 24-луночного планшета («Costar», USA) вносили по 2 млн. ЛАК или скаффолд с ЛАК и по 400000 клеток линии К 562. В контрольных сериях в лунки микропланшет добавляли только ЛАК, скаффолд, нагруженный ЛАК, либо клетки К 562. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 4,5% CO₂. Затем отбирали часть среды для последующего определения цитокинов.

Воздействие скаффолдов на противоопухолевые свойства ЛАК оценивали, используя МТТ-колориметрический тест. Индекс цитотоксической активности (ИЦА) ЛАК рассчитывали на основании данных оптической плотности в контрольных и опытных сериях. Оптическую плотность измеряли на мультискане MS (Labsystem, Финляндия). Цитотоксический эффект ЛАК в скаффолдах был результатом бесконтактного воздействия эффекторов на клетки-мишени. Представленные материалы свидетельствуют о том, что ЛАК в скаффолде дольше сохраняют свою цитотоксическую активность и через 10 сут культивирования проявляют достоверно более высокую киллерную активность по сравнению с интакными ЛАК (в среднем на 22%) (табл.1).

6. Определение продукции цитокинов интактных ЛАК и ЛАК, депонированных в пористых титановых скаффолдах.

Концентрацию цитокинов в культуральной среде определяли, используя набор для исследования концентрации цитокинов человека FlowCytomix human Th1/Th2 11plex BMS810 FF (Bender MedSystems) методом проточной цитофлуометрии на приборе FACSCalibur Systems.

В табл.2 представлены данные о продукции цитокинов ЛАК. Установлено, что воздействие металла скаффолда не влияет на секрецию цитокинов активированными лимфоцитами. ЛАК, помещенные в скаффолды, продолжают адекватно функционировать, так как концентрация цитокинов в среде инкубации, практически, идентична таковой для интактных ЛАК. Однако ЛАК, депонированные в скаффолдах, продуцируют противовоспалительный цитокин IL-10 в меньших количествах.

Таблица 1
Изменение индекса цитотоксической активности (ИЦА, %) интактных и помещенных в скаффолд ЛАК при испытании на клетках линии К 562
Эффекторы	Сроки культивирования ЛАК (сут)
2	5	10
Интактные ЛАК	88±3	74±4	62±5
ЛАК в скаффолде	89±1	86±2	84±2*
* достоверное (р<0,05) отличие от интактных ЛАК

Таблица 2
Продукция цитокинов ЛАК (пкг/мл)
Клетки-продуценты	INF	IL-6	IL-4	IL-5	IL-1	TNF	TNF	IL-10	IL-12p70	IL-2
Интактные ЛАК	6601±726,1	1751±1576,6	0	0±19	540±70,2	1508±90,5	64±3,8	887±79,8	16±3,0	1625±260,0
ЛАК в скаф.	5879±649,7	1878±1691,0	0	0±19	500±65,0	1630±97,8	43±2,6	243±21,9	20±2,5	1504±240,6
Пустой скаф.+ЛАК	4190±460,9	1045±938,3	0	0±18	485±63,1	987±59,2	20±1,2	791±71,2	13±10,2	1026±164,2
К 562	0±11,0	28±5,2	0	0±18	4±0,5	11±0,7	0±6,1	0±9,0	0±18,9	6±16,2
* достоверное (р<0,05) отличие от интаткных ЛАК