Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения панкреатической рибонуклеазы

Классы МПК:C12N9/22 рибонуклеазы
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-06-06
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химической и микробиологической промышленности. Способ предусматривает измельчение поджелудочной железы. Измельченную поджелудочную железу обрабатывают раствором хлорида натрия 4,5-6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа:раствор соли 1:(1,5-2,0) при температуре 25-35°С в течение 2,5-3,5 ч. Полученные клетки поджелудочной железы отделяют центрифугированием и обрабатывают 95% этиловым спиртом в течение 15-24 ч в объемном соотношении 1:(0,85-1,3) при температуре 15-25°С. Отделяют клетки поджелудочной железы центрифугированием с последующей обработкой этих клеток водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0-3,0, в течение 2,5-4,5 ч при температуре 25-35°С в объемном соотношении 1:(0,8:1,2). Полученные клетки поджелудочной железы отделяют центрифугированием с получением супернатанта. Из полученного супернатанта экстрагируют рибонуклеазу растворами серной кислоты с концентрацией 0,15-0,35 н. в течение 3-4 ч при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4-6°С. Отделяют взвешенные частицы центрифугированием с получением экстракта, содержащего рибонуклеазу. Полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией. Полученный концентрат охлаждают до 4-6°С и осаждают рибонуклеазу при pH 8,0-9,0. Полученный осадок промывают этиловым спиртом в объемном соотношении 1:5 и сушат. Изобретение позволяет повысить выход фермента. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству ферментов, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Известен способ получения рибонуклеазы (РНК-азы) [Kunitz M., J. Gen. Physiol, 24, 15 (1940); McDonald M.R., Methods in enzymology, Vol.2, p.427 (S.P.Colowick and N.O.Kaplan, Eds.), New York. Academic Press (1955)] путем экстрагирования из свежей бычьей поджелудочной железы 0,25 н. раствором серной кислоты в объемном отношении 1:2 в течение 24 ч с последующим осаждением из экстракта трипсиногена, химотрипсиногена и дезоксирибонуклеазы сернокислым аммонием при 0,6 насыщении, затем при 0,8÷0,85 насыщения фракционируют РНК-азу. Выделенный таким способом фермент обычно загрязнен следовыми количествами протеолитических ферментов. Очистку [Тугунов С.С., Константинов В.Л. и др. Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратов ферментов трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы из панкреатической железы / Труды Ленинградского химико-фармацевтического института, 1967, вып.20, с.9-18] производственного высола РНК-азы осуществляют повторным переосаждением сульфатом аммония. Обезвоживание осадка РНК-азы проводят этанолом. Сушку кристаллов РНК-азы проводят под вакуумом при температуре 50°С. Выход препарата, по предлагаемой технологии, составляет 0,1% от массы сухой поджелудочной железы. Недостатками данного способа выделения панкреатической РНК-азы являются низкий выход продукта из-за многостадийности процесса, длительность проведения, низкая степень осаждения РНК-азы вследствие ее малой концентрации в растворе.

Известен способ получения панкреатической РНК-азы из поджелудочной железы крупного рогатого скота [Пат. RU 2180918 C1, МПК7 C12N 9/22. Способ получения панкреатической рибонуклеазы. Дата публикации: 27.03.2002. Изобретатель: Красноштанова А.А., Баурина М.М., Кашкина Е.А., Крылов И.А. Патентообладатель: Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева]. Для увеличения выхода препарата была предложена следующая схема выделения. Фермент выделяется путем экстракции 0,25 н. раствором серной кислотой в отношении 1:2 в течение 24 ч. После отделения взвешенных частиц центрифугированием супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ 450 с диаметром пор 450 Å при давлении 0,2 МПа. Пермеат, полученный на данной стадии, используется при повторной экстракции. Осаждение проводят при pH среды 7,8÷8,0. Осадок технической РНК-азы растворяют в дистиллированной воде и раствор нагревают до температуры 85÷90°С с последующим выдерживанием 10 мин. После этого повторно осаждают РНК-азу при pH среды 7,8÷8,0. Выпавшие кристаллы очищенной РНК-азы промывают этанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают таким способом 1,2 г РНК-азы с 1 кг ПЖ с активностью 12000-14000 ед./мл. Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,6% от массы сухой поджелудочной железы.

Указанный способ обладает рядом недостатков, главным из которых является длительность процесса очистки - нагрев, выдержка и охлаждение занимает 30 мин, данная стадия заметно ухудшает качество препарата - в очищенном препарате содержится около 30% примесных инактивируемых белков, при этом выход препарата не превышает 0,6% от массы сухой поджелудочной железы.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода панкреатической РНК-азы в условиях комплексной переработки поджелудочной железы, с предварительным извлечением ферментов пищеварительной группы, таких как амилаза, липаза и комплекс протеаз.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ извлечения панкреатической рибонуклеазы из поджелудочной железы, предусматривающий измельчение, обработку измельченной поджелудочной железы раствором хлорида натрия 4,5÷6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа:раствор соли 1:(1,5÷2,0) при температуре 25÷35°С в течение 2,5÷3,5 ч, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы 95% этиловым спиртом в течение 15÷24 ч в объемном соотношении 1:(0,85÷1,3) при температуре 15÷25°С, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием; обработку клеток поджелудочной железы водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0÷3,0, в течение 2,5÷4,5 ч при температуре 25÷35°С в объемном соотношении 1:(0,8÷1,2), отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, экстракцию рибонуклеазы растворами серной кислоты с концентрацией 0,15÷0,35 н. в течение 3÷4 часов при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4÷6°С, отделение взвешенных частиц центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией, охлаждение экстракта до 4÷6°С, осаждение фермента при pH 8,0÷9,0, промывку полученного экстракта этиловым спиртом в объемном соотношении 1:5 и сушку. В отличие от прототипа, в данном способе выделения сокращается время экстракции РНК-азы из клеток ПЖ, а также не нужно проводить инактивацию белков, обладающих протеазной и ДНК-азной активностью, так как получаемый экстракт не содержит данных ферментов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 1000 г (250 г по абсолютно сухому веществу) измельченной поджелудочной железы обрабатывают раствором хлорида натрия 4,5 мас.% (объемное соотношение поджелудочная железа:раствор соли 1:1,5), в течение 2,5 ч при температуре 25°С, клетки ПЖ отделяют центрифугированием. Получают супернатант, содержащий амилазу 29,6 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 770 г, 167 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают 95% этиловым спиртом в течение 15 ч в объемном соотношении 1:0,85 при температуре 15°С, клетки ПЖ отделяют центрифугированием. Получают супернатант, содержащий липазу 8,77 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 400 г, 87 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0, в течение 2,5 часов, объемном соотношении 1:0,8 при температуре 25°С. Получают супернатант, содержащий комплекс протеаз 1252 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 350 г, 72 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают раствором серной кислоты с концентрацией 0,15 н. в течение 3 ч при температуре 4°С (объемное соотношение 1:0,8). Взвешенные частицы отделяют центрифугированием, в результате получают супернатант с активностью РНК-азы 100 ед./мл. Супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ 10 с отсечкой 10 кДа при давлении 0,2÷0,4 МПа. Получаемый на данном этапе пермеат используют повторно на стадии экстракции, ультраконцентрат с активностью РНК-азы 2100 ед./мл подвергают дополнительной очистке с использованием диафильтрации. После этого концентрат охлаждают до температуры 4÷6°С и доводят значение pH среды до 8,0÷9,0. Осадок РНК-азы перекристаллизовывают этиловым спиртом в отношении 1:5. Полученные очищенные кристаллы РНК-азы высушивают в вакуум-сушильном шкафу. В результате получают 0,75 г рибонуклеазы с активностью 12000-14000 ед./мг. Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,3% от массы сухих веществ исходной поджелудочной железы и 1,04% от массы сухих веществ на стадии.

Условия проведения предварительной обработки ПЖ и экстракции РНК-азы сведены в таблицу.

способ получения панкреатической рибонуклеазы, патент № 2388821

При осуществлении данного способа выделения РНК-азы из ПЖ происходит увеличение выхода ферментного препарата на стадии выделения РНК-азы в 1,3÷1,7 раза по сравнению с аналогом, при этом активность ферментного препарата РНК-азы не понижается. Также упрощается технологическая схема за счет исключения из технологического процесса стадий очистки ферментного препарата от примесных гидролаз и сокращения времени экстракции.

Проведенный расчет технико-экономических показателей получения РНК-азы по прототипу (в индивидуальном производстве) и в комплексном производстве показал, что в первом случае себестоимость 1 г фермента составляет 110 руб., а при комплексной переработке - 13 руб. Таким образом, при организации комплексного производства себестоимость препарата снижается в 8,5 раз, а срок окупаемости дополнительных капитальных вложений не превышает 1,5 года.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения панкреатической рибонуклеазы из поджелудочной железы, предусматривающий измельчение, обработку измельченной поджелудочной железы раствором хлорида натрия 4,5÷6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа : раствор соли 1 : (1,5÷2,0) при температуре 25÷35°С в течение 2,5÷3,5 ч, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы 95%-ным этиловым спиртом в течение 15÷24 ч в объемном соотношении 1 : (0,85÷1,3) при температуре 15÷25°С, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0÷3,0 в течение 2,5÷4,5 ч при температуре 25÷35°С в объемном соотношении 1 : (0,8÷1,2), отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, экстракцию рибонуклеазы растворами серной кислоты с концентрацией 0,15÷0,35 н. в течение 3÷4 ч при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4÷6°С, отделение взвешенных частиц центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией, охлаждение экстракта до 4÷6°С, осаждение фермента при pH 8,0÷9,0, промывку полученного экстракта этиловым спиртом в объемном соотношении 1 : 5 и сушку.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2388821

patent-2388821.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N9/22 рибонуклеазы

Патенты РФ в классе C12N9/22:
штамм бактерий serratia species, являющийся продуцентом внеклеточной рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью -  патент 2528064 (10.09.2014)
штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью -  патент 2520086 (20.06.2014)
конструкция на основе белковой пары барназа-барстар и способ ее получения -  патент 2480524 (27.04.2013)
контролируемая деградация структурированных полирибонуклеотидов -  патент 2458986 (20.08.2012)
стрептомицинустойчивый штамм bacillus sp. вкпм в-9862 - продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы -  патент 2384619 (20.03.2010)
способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота -  патент 2311455 (27.11.2007)
олигонуклеотидпептидный конъюгат, обладающий способностью расщеплять фосфодиэфирные связи рнк в последовательностях 5'gpn3' -  патент 2305108 (27.08.2007)
способ разделения смеси человеческой днказы (варианты), очищенная дезамидированная человеческая днказа, очищенная недезамидированная человеческая днказа, фармацевтическая композиция для снижения вязкоупругости гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего скоплением гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего муковисцидозом, бронхитом, пневмонией -  патент 2238320 (20.10.2004)
способ получения инсерционных мутаций -  патент 2237715 (10.10.2004)
молекула каталитической днк, обладающая сайтспецифической эндонуклеазной активностью (варианты), композиция, расщепляющая нуклеиновую кислоту, способ расщепления фосфоэфирной связи в субстрате, способ селекции каталитической днк (варианты), молекула энзиматической днк (варианты) -  патент 2220204 (27.12.2003)


Наверх