Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

стрептомицинустойчивый штамм bacillus sp. вкпм в-9862 - продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы

Классы МПК:C12N9/22 рибонуклеазы
C12N9/54 из Bacillus
C12N1/20 бактерии; питательные среды для них
C12R1/07 Bacillus
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-07-08
публикация патента:

Изобретение касается микробиологической промышленности и может быть использовано в биотехнологии, генетической инженерии и медицине. Штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - высокостабильный продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеазы, обладающий высокой устойчивостью к стрептомицину, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика под номером В-9862. Изобретение позволяет избежать микробиологического загрязнения в период хранения и подготовки посевного материала для ферментации в условиях производства и повысить выход внеклеточной рибонуклеазы. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, устойчивого к стрептомицину продуценту щелочной внеклеточной рибонуклеазы.

Бактериальная щелочная внеклеточная рибонуклеаза может быть использована в биоорганической химии и молекулярной биологии в качестве реактива для изучения структуры и функции белков, синтезе олигонуклеотидов, в генной инженерии при выделении плазмид и генов (1), а также в медицине как противовирусный (2-4) и противоопухолевый препарат (5).

Известно, что наиболее активными в отношении синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы являются различные микроорганизмы из группы бацилл, в частности различные штаммы Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus. Bacillus asterosporus (6). Однако известные штаммы обладают недостаточно высокой активностью синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы.

Ближайшим известным аналогом изобретения является штамм Bacillus intermedius 7p - продуцент щелочной внеклеточной рибонуклеазы (7). При культивировании на среде, содержащей 0,5% глюкозы, 2% пептона, 0,24% Трис, 0.3% NaCl, 0.03% MgSO2*7H2O, 0.01% CaCl 2*2Н2О, 0.01% MnSO4, pH 7.5, указанный штамм продуцирует внеклеточную щелочную рибонуклеазу с активностью 2000-2500 единиц.

Однако недостатком данного штамма является отсутствие устойчивости к антибиотикам, что значительно затрудняет хранение штамма и подготовку посевного материала для инокуляции в условиях производства.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является получение нового стрептомицинустойчивого штамма Bacillus, отличающегося устойчивостью к различным дозам стрептомицина (от 10 до 500 мкг/мл) и значительно повышенной по сравнению с аналогом рибонуклеолитической активностью.

Техническое решение, которое может быть получено при осуществлении изобретения, заключается в получении штамма, обладающего повышенной способностью синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы, устойчивого к высоким дозам стрептомицина.

Сущность объекта изобретения - штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - устойчивый к стрептомицину продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика под номером В-9862.

Штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 был получен методом клонирования штамма Bacillus intermedius 7p на среде, содержащей стрептомицин, и последующего трехступенчатого отбора колоний с наибольшим уровнем устойчивости к стрептомицину и высокой продуктивностью в отношении рибонуклеазы.

Характеристика штамма

Морфологические признаки

Величина клеток односуточной культуры на мясо-пептонном бульоне 3-6*0,9 мкм. Клетки палочковидные, в основном одиночные, реже соединены в короткие цепочки, подвижные, перитрихи, грамположительные. Образуют овальные споры, не превышающие диаметра клеток.

Культуральные признаки

Мясо-пептонный агар (24 часа, 30°С). Блестящие, тестообразные полупрозрачные слегка выпуклые колонии с ровными краями, пигмента не образует.

Мясо-пептонный бульон (24 часа, 30°С). В процессе роста среда мутнеет, появляется осадок. Пленка на поверхности не образуется.

Физиологические признаки

Аэроб, оптимальная температура роста - 32-37°С, pH оптимум проста - 9.0-9.2. Молоко пептонизирует и свертывает. Желатин разжижает. Крахмал гидролизует. Глюкозу, сахарозу, лактозу усваивает с образованием кислоты без выделения газа. Слабо растет на синтетических средах. Восстанавливает нитраты. Активность внеклеточной фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы остается на уровне родительского штамма, активность щелочной внеклеточной рибонуклеазы выше, чем у родительского штамма в 5-6 раз. Основной метод хранения штамма - метод лиофилизации. Штамм может храниться без потери полезных свойств при комнатной температуре на косяках с агаризованной средой, содержащей стрептомицин в концентрации 500 мкг/мл.

Активность внеклеточной щелочной рибонуклеазы определялась по кислоторастворимым продуктам гидролиза РНК (8). За единицу активности фермента принимали то количество, которое вызывает увеличение оптической плотности на единицу за 1 час инкубации в пересчете на 1 мл раствора фермента.

Изобретение иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ним.

Пример 1. Выделение штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862

Культуру 7р выращивают на среде 1 следующего содержания: 1% глюкозы, 2% пептона, 0.03% MgSO4*7H2 O, 0.03% CaCl2*2Н2О, 0.01% MnSO4 , pH 8.5. Культивирование проводят на вибростенде (2-3 с -1). При температуре 30+/-1°С. Соотношение среда в колбе : воздух - 1:7.5. Выращивание проводят в течение 24 часов. Инокулят центрифугируют, осадок клеток суспендируют в 1 мл свежей питательной среды и высевают на агаризованную среду 2 следующего состава: 2% агар-агар, 1% глюкозы, 2% пептона, 0.03% MgSO 4*7H2O, 0.03% CaCl2*2H2 O, 0.01% MnSO4. Чашки с агаризованной средой инкубируют в термостате при температуре 30+/-1°С. Выросшие через 18 часов колонии проверяют на рибонуклеазную активность методом кислотной преципитации в агаре продуктов гидролиза рибонуклеиновой кислоты (8). С этой целью колонии со среды 2 методом реплик переносят на 2 чашки Петри: первая чашка содержит среду 2 с добавлением 2 мг/мл РНК, вторая - среду 2 с добавлением стрептомицина (10-500 мкг/мл). Через 18-24 часа инкубации чашек в термостате при температуре 30+/-1°С, чашку. Содержащую питательную среду с РНК заливают 1М раствором соляной кислоты. РНКазную активность определяют по величине зон просветления агара, содержащих кислоторастворимые продукты гидролиза РНК. Отбирают колонии, имеющие зоны просветления, большие, чем у исходного штамма, и выросшие на среде с антибиотиком.

Процедуру отбора устойчивых к стрептомицину клонов повторяют трижды на средах, содержащих 10, 250 и 500 мкг/мл стрептомицина соответственно.

После третьего этапа был выделен штамм, устойчивый к стрептомицину в концентрации 500 мкг/мл и обладающий рибонуклеолитической активностью в 6 раз выше, чем штамм 7р.

Пример 2. Использование штамма Bacillus sp. BKПM B-9862 в качестве устойчивого к стрептомицину продуцента рибонуклеазы.

Лиофильно высушенную культуру Bacillus sp. BKПM B-9862 высевают на среду 2, содержащую 500 мкг/мл стрептомицина и выращивают на вибростенде (2-3 с-1) при температуре 30+/-1°С в течение 22-24 часов, соотношение среда в колбе:воздух - 1:7,5, исходный pH среды 8.5. Рибонуклеолитическую активность в культуральной жидкости определяют модифицированным методом Анфинсена по кислоторастворимым продуктам гидролиза РНК (8). Реакционную смесь из 0.1 мл культуральной жидкости, 0.5 мл раствора РНК (2 мг/мл) и 0.4 мл 0.25 М Трис-HCl буфера (pH 8.5) инкубируют 15 мин при температуре 37°С. Реакцию останавливают добавлением 0.2 мл охлажденного 0.75% раствора уранилацетата в 25% HCl. Выдерживают реакционную смесь на льду 10 минут и удаляют осадок центрифугированием. Параллельно ставят контрольные пробы на поглощение субстрата (вместо культуральной жидкости добавляют 0.1 мл дистиллированной воды) и поглощение фермента (вместо р-ра РНК добавляют 0.5 мл дистиллированной воды). Из надосадочной жидкости отбирают 0.2 мл раствора, разводят дистиллированной водой в 20 раз и спектрофотометрически измеряют оптическую плотность при длине волны 260 нм. Рибонуклеазную активность в пробах определяют по формуле:

А 260=(А260пробы-стрептомицинустойчивый штамм bacillus sp. вкпм в-9862 - продуцент   внеклеточной щелочной рибонуклеазы, патент № 2384619 А260контролей)*4*10*1.2*20,

где А260 - активность РНКазы, выраженная в условных единицах, означающая прирост оптической плотности в опытных пробах за 1 час инкубации на 1 мл культуральной жидкости (опт.ед./мл*час);

А260пробы - оптическое поглощение опытной пробы;

стрептомицинустойчивый штамм bacillus sp. вкпм в-9862 - продуцент   внеклеточной щелочной рибонуклеазы, патент № 2384619 А260контролей - сумма оптических плотностей контрольных проб;

4 - коэффициент пересчета на 1 час инкубации;

10 - коэффициент пересчета на 1 мл культуральной жидкости;

1.2 - коэффициент разведения при осаждении проб осадителем;

20 - коэффициент разведения для измерения на спектрофотометре.

Результаты определения величины и стабильности рибонуклеазной активности штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862 по сравнению с родительским штаммом представлены в таблице.

стрептомицинустойчивый штамм bacillus sp. вкпм в-9862 - продуцент   внеклеточной щелочной рибонуклеазы, патент № 2384619
Стабильность штаммов Bacillus intermedius 7p и Bacillus sp. ВКПМ В-9862 по продукции внеклеточной рибонуклеазы
Номер ферментации Рибонуклеазная активность, ед*103/мл в час
Bacillus intermedius 7pBacillus sp.ВКПМ В-9862
136 200
2 32 190
3 30 170
4 24 180
5 28 200

Из данных таблицы видно, что активность щелочной внеклеточной рибонуклеазы штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862 в 6 раз выше, чем у штамма Bacillus intermedius 7p, и остается на таком уровне в течение 5 ферментаций (срок наблюдения). При этом рибонуклеазная активность в культуральной жидкости штамма варьирует от 170 до 200 тыс. единиц при культивировании в указанных условиях. Таким образом, предел активности штамма составляет 170 тыс. единиц, что в 4.6 раза выше, чем максимальная активность ближайшего аналога.

Таким образом, полученный штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 отличается от ближайшего аналога способностью расти на среде со стрептомицином и имеет колонии, отличающиеся по морфологии от исходного штамма - полупрозрачные.

Использование штамма Bacillus sp. ВКПМ В-9862 в качестве стрептомицин-устойчивого продуцента щелочной внеклеточной рибонуклеазы позволит устранить возможность загрязнения культуры посторонней микрофлорой в период хранения штамма и подготовки инокулята для ферментации в условиях производства. Возможность добавления антибиотика в питательные среды для хранения культур позволит получить однородную популяцию продуцента. Использование штамма Bacillus sp.ВКПМ В-9862 для получения щелочной внеклеточной рибонуклеазы позволит увеличить активность получаемого за период одной ферментации фермента на 200-300% по сравнению с культивированием на той же среде штамма Bacillus intermedius 7p. Бациллярная рибонуклеаза является перспективным препаратом для терапии опухолевых заболеваний, поскольку она проявляет избирательную токсичность в отношении малигнизированных клеток, не обладает иммуногенностью и не подвержена инактивации в клетках млекопитающих (5, 9).

Литература

1. Castanotto D. Biological and functional aspects of catalytic RNAs. / D.Castanotto, J.J.Rossi, J.O.Deshler // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. - 1992. - V.2. - N.4. - P.331-357.

2. Алексеева И.И. Противовирусная активность модифицированных РНКаз / И.И.Алексеева, Б.М.Куриненко, Г.А.Пензикова, М.Г.Орешина // Антибиотики. - 1982. - Вып.4. - С.21-28.

3. Грибенча С.В. Противовирусная активность РНКазы Bacillus intermedius в экспериментах на мышах линии СВА, предварительно зараженных вирусом бешенства. / С.В.Грибенча, Л.А.Поцелуева, И.Ф.Баринский, Т.Г.Баландин, С.М.Деев, И.Б.Лещинская // Вопросы вирусологии. - 2004. - № 6. - С.38-41.

4. Шнейдер М.А. / М.А.Шнейдер, Е.Б.Штильбанс, Э.Г.Куприянов и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - Т.35. - Вып.3. - С.27-31.

5. Зеленихин П.В. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой. / П.В.Зеленихин, А.И.Колпаков, Г.В.Черепнев, О.Н.Ильинская // Молекулярная биология. - 2005. - Т.39. - № 3. - С.457-463.

6. Юсупова О.И. Ферменты микроорганизмов. / О.И.Юсупова // М.: Наука. - 1973. - 163 с.

7. Авторское свидетельство СССР 587156. Опубл. 11.01.1978.

8. Лещинская И.Б. Методы определения активности нуклеаз и родственных ферментов. / И.Б.Лещинская, Н.П.Балабан, М.Н.Капранова, И.А.Голубенко. // Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов. - Казань. - 1980. - С.53-60.

9. Зеленихин П.В. Биназа не индуцирует поликлональный Т-клеточный ответ. / П.В.Зеленихин, Г.В.Черепнев, Ф.Керн, О.Н.Ильинская // Доклады Академии Наук. - 2006. - Т.407. - № 3.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - стрептомицинустойчивый продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2384619

patent-2384619.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N9/22 рибонуклеазы

Патенты РФ в классе C12N9/22:
штамм бактерий serratia species, являющийся продуцентом внеклеточной рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью -  патент 2528064 (10.09.2014)
штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью -  патент 2520086 (20.06.2014)
конструкция на основе белковой пары барназа-барстар и способ ее получения -  патент 2480524 (27.04.2013)
контролируемая деградация структурированных полирибонуклеотидов -  патент 2458986 (20.08.2012)
способ получения панкреатической рибонуклеазы -  патент 2388821 (10.05.2010)
способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота -  патент 2311455 (27.11.2007)
олигонуклеотидпептидный конъюгат, обладающий способностью расщеплять фосфодиэфирные связи рнк в последовательностях 5'gpn3' -  патент 2305108 (27.08.2007)
способ разделения смеси человеческой днказы (варианты), очищенная дезамидированная человеческая днказа, очищенная недезамидированная человеческая днказа, фармацевтическая композиция для снижения вязкоупругости гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего скоплением гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего муковисцидозом, бронхитом, пневмонией -  патент 2238320 (20.10.2004)
способ получения инсерционных мутаций -  патент 2237715 (10.10.2004)
молекула каталитической днк, обладающая сайтспецифической эндонуклеазной активностью (варианты), композиция, расщепляющая нуклеиновую кислоту, способ расщепления фосфоэфирной связи в субстрате, способ селекции каталитической днк (варианты), молекула энзиматической днк (варианты) -  патент 2220204 (27.12.2003)

Класс C12N9/54 из Bacillus

Патенты РФ в классе C12N9/54:
cпособ мытья посуды -  патент 2509152 (10.03.2014)
применение и получение стабильной при хранении нейтральной металлопротеиназы -  патент 2433182 (10.11.2011)
вариант субтилизина (варианты), кодирующая его днк, экспрессирующий вектор, очищающая композиция, корм для животных, композиция для обработки ткани -  патент 2252958 (27.05.2005)
вариант субтилизина bacillus (варианты), кодирующая его днк, экспрессирующий вектор и очищающая композиция -  патент 2252254 (20.05.2005)
модифицированная термолизинподобная нейтральная металлопротеаза, способ синтеза бензилоксикарбонил--l- аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира, способ гидролиза бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланин метилового сложного эфира -  патент 2151186 (20.06.2000)
модифицированный субтилизин, днк, кодирующая модифицированный субтилизин, вектор экспрессии, кодирующий днк, и штамм культуры клетки хозяина -  патент 2136756 (10.09.1999)
модифицированная протеаза термолизин-подобной нейтральной металлопротеазы, способ синтеза метилового эфира бензилоксикарбонил--l-аспартил-l-фенилаланина и способ расщепления метилового эфира бензилоксикарбонил--l- аспартил-l- фенилаланина -  патент 2136750 (10.09.1999)

Класс C12N1/20 бактерии; питательные среды для них

Патенты РФ в классе C12N1/20:
способ определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам -  патент 2529711 (27.09.2014)
бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания бруцеллезного микроба -  патент 2529364 (27.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528874 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528873 (20.09.2014)
штамм lactobacillus fermentum, обладающий широким спектром антагонистической активности и пробиотический консорциум лактобактерий для изготовления бактериальных препаратов -  патент 2528862 (20.09.2014)
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
способ получения миллерита с использованием сульфатредуцирующих бактерий -  патент 2528777 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528744 (20.09.2014)
питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов -  патент 2528740 (20.09.2014)
питательная среда для культивирования легионелл -  патент 2528101 (10.09.2014)

Класс C12R1/07 Bacillus

Патенты РФ в классе C12R1/07:
изолированный штамм (варианты), обеспечивающий улучшение состояния здоровья жвачных животных, способ его получения, и способ его введения жвачным животным -  патент 2528859 (20.09.2014)
штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами -  патент 2528058 (10.09.2014)
способ очистки мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов спорообразующими бактериями bacillus vallismortis -  патент 2525930 (20.08.2014)
способ дифференциации возбудителя сибирской язвы от других близкородственных видов рода bacillus на основе определения различий в структуре хромосомных генов -  патент 2514663 (27.04.2014)
штамм бактерий bacillus vallismortis - деструктор нефти и нефтепродуктов -  патент 2513702 (20.04.2014)
способ очистки мерзлотных почв и водной среды спорообразующими бактериями bacillus atrophaeus вкпм в-10592 -  патент 2513699 (20.04.2014)
ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов -  патент 2509150 (10.03.2014)
штамм bacillus amyloliquefaciens вкм в-2714d, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к salmonella typhi, staphylococcus aureus, listeria monocytogenes и резистентностью к тетрациклину и триметоприму -  патент 2509148 (10.03.2014)
способ получения протективного антигена и белка s-слоя ea1 из аспорогенного рекомбинантного штамма b. anthracis 55 тпа-1spo- -  патент 2492241 (10.09.2013)
способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы и диагностический набор -  патент 2478647 (10.04.2013)

Наверх