сывороточный иммунобиологический препарат для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы

Формула изобретения

Сывороточный иммунобиологический препарат для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы, представляющий собой стерильные жидкие или сухие специфически активные F(аb')₂-фрагменты противосибиреязвенных антител, содержащие (35±5) мг·см ^-3 белка, не менее 96% F(ab')₂-фрагментов антител и имеющие индекс иммунитета в тесте пассивной защиты белых мышей не менее 4,0, выделенные из иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкого, приготовленного из сыворотки крови лошадей, предварительно иммунизированных штаммами B.anthracis СТИ-1 и Ихтиман, а также сибиреязвенным токсином, полученным методом спиртового осаждения по Кону.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинским иммунобиологическим препаратам, предназначенным для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы у людей.

Известен «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий» (ФСП 42-3770-99, ФСП 42-0095-4537-03). Препарат представляет собой 8-10% раствор иммуноактивных гамма- и бета-глобулиновых фракций сыворотки крови гипериммунных против сибирской язвы лошадей и используется для экстренной профилактики и лечения тяжелых форм сибирской язвы (Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов. / Под ред. С.Г.Дзагурова, Ф.Ф.Резепова. - М., Медицина, 1975. - 223 с.).

Наиболее близким к предложенному решению является «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный сухой» (Патент РФ № 2214836), полученный из 10-11% (по содержанию белка) раствора иммуноглобулиновых гамма- и бета-глобулиновых фракций, выделенных из белков сыворотки крови иммунизированных лошадей.

Эти препараты являются сывороточными гетерогенными препаратами и применяются для профилактики и лечения сибирской язвы, они обладают специфической преципитирующей, агглютинирующей и токсиннейтрализующей активностью.

Причина, препятствующая широкому использованию известного препарата, - его высокая реактогенность. Белки, входящие в его состав, в силу своей гетерогенности обладают выраженными антигенными для человека свойствами. Введение данного препарата в организм пациента может сопровождаться признаками сенсибилизации вплоть до развития сывороточной болезни и анафилактического шока.

Одним из путей снижения риска осложнений и повышения эффективности применения иммуноглобулинов при лечении и экстренной специфической профилактике является разработка низкомолекулярных сывороточных иммунологически активных препаратов, позволяющих использовать их в больших количествах для быстрого достижения терапевтического эффекта при значительно более низкой вероятности развития осложнений. Совершенствование эффективности специфических сывороточных препаратов возможно путем получения F(аb') ₂-фрагментов иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного, которые в отличие от известных препаратов не содержат Fc-фрагментов, бета- и альфа-глобулинов.

Задачей настоящего изобретения является получение готовой лекарственной формы препарата для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы, обладающего низкой реактогенностью и высокой эффективностью по сравнению с известными препаратами.

Указанный результат при осуществлении изобретения достигается тем, что препарат содержит F(аb')₂-фрагменты иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного, сохраняющие активность специфических антител (преципитирующую, агглютинирующую, токсиннейтрализующую). Препарат представляет собой стерильную специфически активную фракцию F(аb') ₂-фрагментов иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного, содержащую (35±5) мг·см^-3 белка, не менее 96% F(аb')₂-фрагментов антител и имеющую индекс иммунитета в тесте пассивной защиты белых мышей не менее 4,0, выделенную из иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкого, приготовленного из сыворотки крови лошадей, предварительно иммунизированных штаммами B.anthracis СТИ-1 и Ихтиман, а также сибиреязвенным токсином, полученным методом спиртового осаждения по Кону.

Иммунную сыворотку крови лошадей с активностью в реакции диффузионной преципитации с сибиреязвенным цитоплазматическим антигеном (РДП с ЦПА) не менее 1:20 (титр) используют для приготовления иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного, активность которого в РДП с ЦПА должна составлять не менее 1:60 (титр).

Для выделения противосибиреязвенных F(аb') ₂-фрагментов в качестве исходного сырья используют специфический иммуноглобулин или его полуфабрикат, полученный спиртовым методом по Кону из гипериммунной сыворотки крови лошадей. Проводится дополнительная очистка иммуноглобулина от балластных 1 и 2 глобулиновых белковых фракций, представляющих собой наиболее макромолекулярную, лабильную и антигенную часть сывороточных глобулинов. Выделение иммуноглобулинов G осуществляется сульфатом аммония при концентрации 31-35% насыщения и нейтральном значении рН. Проводится гидролиз иммуноглобулинов G при концентрации пепсина, равной 2% при температуре 33-37°С в кислой среде. Очистку F(аb')2-фрагментов иммуноглобулина от неспецифических белков проводят гель-фильтрацией на ультрагеле АсА-34 и сефакриле SH-200. Концентрирование - с помощью высаливания сульфатом аммония. Ресуспендирование проводят в 0,9% растворе натрия хлорида до концентрации белка 30-40 мг·см^-3, диализ - до отрицательной реакции на ионы NH4+. Стерилизацию сконцентрированных F(аb') ₂-фрагментов противосибиреязвенного иммуноглобулина проводят на установке стерилизующей фильтрации через ацетатцеллюлозную мембрану с размером пор 0,2 мкм при давлении 0,2 мПа.

Высушивание препарата проводят на сублимационных установках (МАСС-25, МАСС-5, УЛЛ-1,0 и др.) при температуре материала минус 35-45°С, при градиенте не более 3°С в час, досушивание материала ведут при температуре (30±1)°С в течение (5±1) ч. Состав среды высушивания: концентрация сахарозы (7,0±0,1)%, концентрация полиглюкина (1,0±0,1)%.

F(аb') ₂-фрагменты иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкие и сухие предназначены для лечебно-профилактического применения при сибирской язве. Препарат является значительно менее реактогенным для человеческого организма по сравнению с глобулином противосибиреязвенным лошадиным за счет значительного уменьшения (в 3 раза по белку) объема вводимого чужеродного белка и отсутствием в своем составе наиболее реактогенной белковой фракции (Fc-фрагментов), что позволяет его введение в больших по сравнению с ближайшим аналогом дозах. Препарат позволяет эффективно и более безопасно проводить экстренную профилактику и лечение больных сибиреязвенной инфекцией различной степени тяжести. F(аb')₂-фрагменты иммуноглобулина сохраняют преципитирующую, агглютинирующую и токсиннейтрализующую активность антител, не связывают комплемент, не фиксируются в почках благодаря отсутствию Fc-фрагментов, образующих связи с тканями гетерологичного вида. Помимо антитоксического действия F(аb')₂-фрагменты иммуноглобулина ингибируют процесс прорастания спор, а также процесс капсулообразования. По этой характеристике они превосходят аналогичные свойства лечебных иммуноглобулинов в 1,5-2,0 раза. Препарат обладает более высокой удельной активностью и низкой реактогенностью за счет значительного уменьшения доли балластных примесей и молекулярного веса вводимого «чужеродного» белка.

Рекомендованные нами величины человеко-доз F(аb')₂-фрагментов для профилактики сибирской язвы составляют 40-50 см³ (1,2-2,0 г белка), с лечебной целью 60-100 см³ (1,8-4,0 г белка). Указанные дозы по белку в три и более раз ниже, чем при внутримышечном применении глобулина противосибиреязвенного лошадиного сухого (Патент РФ № 2214836), что значительно снижает реактогенность F(аb') ₂-фрагментов.

Физико-химические и биологические свойства препарата F(аb')₂-фрагментов иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного представлены в таблице.

Физико-химические и биологические свойства препарата F(аb') 2-фрагментов иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного
Наименование показателя, единицы измерения	Требования проекта ФСП	Экспериментальные образцы препарата
1	2	3	4	5	6
Прозрачность, ед. опт. пл.	0,05, не более	0,01	0,005	0,005	0,022	0,026	0,03
Цветность, ед. опт. пл.	0,15, не более	0,001	0,015	0,001	0,036	0,043	0,075
Содержание белка, мг·см-3	30, не менее	30	35	40	30	37	30
Электрофоретическая однородность - содержание F(ab')2-фрагментов, %	96, не менее	98	97	98	96	97	98
рН, ед. рН	6,6-7,0	6,8	6,8	6,6	7,0	7,0	7,0
Стерильность	Стерилен	Стерильны
Пирогенность	Непирогенен	Непирогенны
Токсичность	Нетоксичен	Нетоксичны
Активность в реакции диффузионной преципитации с сибиреязвенным цитоплазматическим антигеном, титр	1:8, не менее	1:16	1:16	1:8	1:32	1:16	1:32
Индекс иммунитета в тесте пассивной защиты белых мышей, усл. ед.	4,0, не менее	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0	4,0