способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека

Классы МПК:C12N1/16 дрожжи; питательные среды для них
C12N15/21 альфа-интерферон
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет (RU),
Общество с ограниченной ответственностью "БИОТЕХ" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-11-29
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека. Рекомбинантный альфа 16-интерферон получают путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2949 в питательной среде. Затем проводят индукцию синтеза целевого белка и удаление клеток. Потом осуществляют концентрирование культуральной среды и проводят осаждение целевого белка при 60% насыщении сульфата аммония. После чего целевой белок очищают последовательно на Сефакриле HR 100 и на диэтиламиноэтил-целлюлозе в присутствии 0,5% детергента Твин-20. Изобретение позволяет упростить технологию получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека и повысить эффективность очистки целевого белка. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, включающий концентрирование культуральной среды, осаждение целевого белка и его хроматографическую очистку с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что культивируют рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris Y-2949, который является продуцентом альфа 16-интерферона человека, осаждение целевого белка проводят при 60%-ном насыщении сульфата аммония, а хроматографическую очистку проводят последовательно на Сефакриле HR 100 с использованием в качестве уравновешивающего и элюирующего раствора 50 мМ аммоний-ацетатного буфера с рН 5,5, содержащего 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,5% Твин-20, и диэтиламиноэтил-целлюлозе с использованием в качестве уравновешивающего раствора 50 мМ аммоний-ацетатного буфера с рН 7,0, содержащего 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% Твин-20, а отмывку примесных белков осуществляют последовательным использованием уравновешивающего буферного раствора и уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,1 М хлористого натрия, элюцию проводят градиентом концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере с рН 5,5, содержащем 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% Твин-20, при необходимости полученный целевой белок лиофильно высушивают.

2. Фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, содержащая этилендиаминтетрауксусную кислоту и солевую буферную систему, отличающаяся тем, что она содержит альфа 16-интерферон человека, полученный способом по п.1, и Твин-20 при следующем соотношении ингредиентов:

Рекомбинантный альфа 16-интерферон человека способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
с активностью 106·107 МЕ/мл 10-100 мкг/мл
Этилендиаминтетрауксусная кислота 0,5-1,5 мг/мл
Твин-200,5-5 мг/мл
Буферный раствор рН 5,5-6,0, 10-20 мМ остальное

3. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она представлена в виде эмульсии, сиропа, капель или липосомной формы.

4. Лиофильно высушенная фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, содержащая этилендиаминтетрауксусную кислоту и солевую буферную систему, отличающаяся тем, что она содержит альфа 16-интерферон человека, полученный способом по п.1, и Твин-20 при следующем соотношении ингредиентов до начала лиофильной сушки:

Рекомбинантный альфа 16-интерферон человека 10-100 мкг/мл
с активностью 106-107 МЕ/мл способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
Этилендиаминтетрауксусная кислота0,5-1,5 мг/мл
Твин-20 0,5-5 мг/мл
Буферообразующие соли, обеспечивающие способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
рН 5,5-6,0остальное


молярность, равную при растворении 10-20 мМ

5. Лиофильно высушенная фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что она представлена в виде таблетки, капсулы, порошка, гранул или суппозитория.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и фармакологии, касается фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона человека и способа его получения. Интерфероны вырабатываются клетками в ответ на вирусную инфекцию. Они обеспечивают противовирусную защиту организма, оказывают антимикробное, противовоспалительное, иммуномодулирующее, противоопухолевое, радиопротективное и антимитотическое действие (Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. 1996; Pestka S. Biopolymers. 2000. V.55. P.254-287).

Препараты на основе альфа-интерферона человека используются для лечения вирусных заболеваний: гепатитов В и С (Chin R., Locarnini S. Curr. Opin. Infect. Dis. 1998. V.11. P. 719-726; Guo J.T. et al. J. Virol. 2001. V.75. P.8516-8523), герпетической инфекции (Siebeck N. et al. Am. J. Vet. Res. 2006. V.67. P.1406-1411), кератитов, гриппа (Brassard D.L. et al. J. Leukoc. Biol. 2002. V.7. P.565-581), атипичной пневмонии (Cinatl J. et al. Lancet. 2003. V.362. P.293-294), онкологических заболеваний: рака простаты, почечноклеточного рака, рака молочной железы, лейкемии, меланомы (Volberding P.A. et al. Cancer. 1987. V.59. Р.620-625; Borden B.C. Oncologist. 1998. V.3. P.198-203; Bukowski R.M. Semin. Oncol. 2000. V.27. P.204-212; Kramer G. et al. J. Interferon Cytokine Res. 2001. V.21. P.475-484; Молчанов О.Е. и др. Современные тенденции иммунотерапии злокачественных опухолей. 2001) и аутоиммунных заболеваний человека (Piskova J. et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 2006. V.47. P.3946-3950).

Интерфероны вырабатываются в организме в малых дозах, что делает невозможным получение в нужных количествах препаратов этих белков из донорской крови или культуры специализированных клеток. Известен препарат, содержащий в качестве действующего начала природный альфа2-интерферон, полученный из донорской крови (производства «Биомед», Россия). Однако существует опасность заражения конечного продукта вирусами гепатита В, С и ВИЧ, что ограничивает применение данного препарата.

С развитием технологий рекомбинантных ДНК стало возможным создавать микроорганизмы - продуценты биологически-активных веществ, в том числе и интерферонов. В настоящее время иммунотерапия рекомбинантными интерферонами является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений иммунофармакологии.

Известны способы получения рекомбинантного альфа2-интерферона человека из клеток бактерий Е. coli (патент RU 2242516, опубликованный 18.12.2003, и патент RU 2294372, опубликованный 16.06.2005). При использовании бактериальной системы экспрессии рекомбинантные белки накапливаются в нерастворимом состоянии в виде «телец включения», что требует дополнительных усилий по ренатурации целевых белков.

Этих недостатков лишены системы экспрессии дрожжей. Использование в качестве продуцентов метилотрофных дрожжей Pichia pastoris дает возможность существенно повысить выход рекомбинантных белков и избежать гипергликозилирования секретируемых гетерологичных белков (Cereghino J.L., Cregg J.M. FEMS Microbiol.Rev. 2000. V.24. P.45-66). Однако выход конечного продукта в виде целевого рекомбинантного белка во многом зависит от используемой технологии его выделения и очистки.

В настоящее время выделено и охарактеризовано 23 альфа-интерферона человека, которые на 80% идентичны между собой и обладают общими функциональными признаками (Pestka S. Biopolymers. 2000. V.55. Р.254-287). Спектр активностей и соотношение альфа-интерферонов разных подтипов зависит от типа клеток и может меняться при некоторых заболеваниях (Hiscott J. et al. Philos. Trans. R. Soc. (Biol. Sci). 1984. V.307. P.217-226; Hu R. et al. J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.12591-12595; Sperber S.J. et al. J. Interferon Res. 1992. V.12. P.363-368). Для выявления индивидуальных особенностей действия необходимо изучать различные альфа-интерфероны человека.

Известны штаммы дрожжей Pichia pastoris - продуценты альфа1-интерферона человека (патент US 20030065148, опубликованный 03.04.2003), альфа 16-интерферона человека, ранее полученный авторами заявляемого изобретения (патент RU 2203950, опубликованный 10.05.2003) и альфа2-интерферона человека (международная заявка WO 4039996, опубликованная 13.05.2004).

Штамм дрожжей Pichia pastoris депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-2949.

Известен способ выделения и очистки альфа2b -интерферона из культуральной жидкости дрожжей Pichia pastoris KM71 (международная заявка WO 4039996, опубликованная 13.05.2004), который является наиболее близким аналогом к заявляемому способу и выбран в качестве прототипа. Способ заключается в культивировании рекомбинантного штамма Pichia pastoris в питательной среде, обеспечивающей рост клеток и синтез целевого белка, удалении клеток, двухстадийной ионообменной хроматографии на сорбентах типа CM Sepharose FF и DEAE Sepharose FF, осаждении целевого белка сульфатом аммония, гидрофобной хроматографии на Butyl Sepharose FF, ультрафильтрации с мембраной YM 10 (10000 MWCO), гель-фильтрации на сорбенте типа Sephacryl HR 200.

Недостатком известного способа является его многостадийность и низкая технологичность, что существенно ограничивает возможность использования известной технологии для промышленного производства интерферона.

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение технологии, повышение эффективности очистки целевого белка и получение на его основе стабильного фармацевтического препарата в жидкой и сухой лиофилизованной формах, а также возможность использования заявленной технологии в промышленном производстве.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения фармацевтического препарата из культуральной среды дрожжей, который включает концентрирование культуральной среды, осаждение целевого белка и его хроматографическую очистку с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии, в соответствии с заявляемым изобретением культивируют штамм дрожжей Pichia pastoris, который депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-2949 и является продуцентом альфа 16-интерферона человека, а хроматографическую очистку проводят последовательно на Сефакриле HR 100 и диэтиламиноэтил-целлюлозе. Концентрирование культуральной среды может быть проведено с использованием мембраны АР-0,2-15ПА.

Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что осаждение целевого белка проводят при 60% насыщения сульфата аммония.

При этом указанный технический результат достигается тем, что гель-фильтрацию на Сефакриле HR 100 проводят с использованием в качестве уравновешивающего и элюирующего раствора 50 мМ аммоний-ацетатного буфера (рН 5,5), содержащего 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,5% Твин-20.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что ионообменную хроматографию белков, полученных на диэтиламиноэтил-целлюлозе, проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 50 мМ аммоний-ацетатный буфер (рН 7,0), содержащий 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% Твин-20, а отмывку примесных белков осуществляют последовательным использованием уравновешивающего буферного раствора и уравновешивающего буферного раствора, содержащего 0,1 М хлористого натрия, элюцию проводят градиентом концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,5% Твин-20.

Известны фармацевтические препараты, содержащие в качестве действующего начала рекомбинантный альфа2-интерферон человека бактериального происхождения: «Роферон» (Hoffman-La Roche AG, Швейцария), «Интрон-А» (Schering-Plough, США), «Реальдирон» (Biotechna, Литва), «Реаферон» ("Вектор-Медика", Россия), «Интераль», (НИИ ОЧБ, Россия). Препараты «Реаферон», «Интераль» и «Интрон-А» содержат в качестве стабилизатора альбумин человека, что требует дополнительной проверки лекарственных форм на отсутствие вирусов гепатита В, С и ВИЧ. Препарат «Интрон-А» дополнительно содержит в качестве стабилизирующего вещества глицин. Использование указанных добавок эффективно только для стабилизации препарата в сухом виде и малоэффективно в отношении жидких форм интерферона. Кроме того, длительное применение лекарственных препаратов бактериального происхождения сопровождается нежелательными побочными эффектами, обусловленными условной патогенностью прокариотических штаммов-продуцентов и возможными примесями эндотоксинов в конечном продукте (Primrose S.B. J. Appl. Bacteriol. 1986. V.61. P.99-116; Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. 1996).

Известен фармацевтический препарат на основе рекомбинантного альфа2-интерферона человека и способ его получения из клеток бактерий Е. coli (патент RU 2294372, опубликованный 16.06.2005), сущность которого состоит в культивировании бактерий Е.coli-продуцентов рекомбинантного белка, разрушении клеток, удалении примесных белков, переводе рекомбинантного белка в растворимую форму, последующей хроматографической очистке рекомбинантного альфа2-интерферона человека и приготовлении фармацевтического препарата на основе рекомбинантного белка. Фармацевтический препарат, который описан в этом патенте, имеет в качестве компонентов рекомбинантный альфа2-интерферон человека, этилендиаминтетрауксусную кислоту, солевую буферную систему, обеспечивающую рН от 6,0 до 7,5, является наиболее близким аналогом и выбран в качестве прототипа для заявляемых вариантов нового препарата.

Недостатками известного фармацевтического препарата является бактериальное происхождение альфа2-интерферона человека, что потенциально приводит к побочным эффектам при его применении и ухудшает качество жизни пациента.

Технический результат для группы изобретений является единым и состоит для заявляемых вариантов нового фармацевтического препарата в снижении рисков возникновения побочных эффектов при применении препарата на основе интерферона человека и получении препарата, лишенного этих недостатков за счет использования системы экспрессии дрожжей для продукции альфа 16-интерферон человека и применения в качестве стабилизатора, предотвращающего агрегацию рекомбинатного белка, Твин-20, а также в возможности его производства промышленным способом.

Указанный технический результат достигается новым фармацевтическим препаратом на основе альфа интерферона человека, содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту и солевую буферную систему, который, в соответствии с заявляемым по первому варианту препаратом, содержит альфа 16-интерферон человека, солевую буферную систему, которая имеет рН от 5,5 до не более 6,0, и дополнительно содержит Твин-20 при следующем соотношении ингредиентов:

Рекомбинантный альфа 16-интерферон человека способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
с активностью 106-107 МЕ/мл 10-100 мкг/мл
Этилендиаминтетрауксусная кислота 0,5-1,5 мг/мл
Твин-200,5-5 мг/мл
Буферный раствор рН 5,5 - не более 6,0, 10-20 мМ остальное

Кроме этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат содержит модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат имеет жидкую форму, например, в виде эмульсии, и/или сиропа, и/или капель, и/или липосомной формы.

Указанный технический результат достигается новым фармацевтическим препаратом на основе альфа интерферона человека, содержащим этилендиаминтетрауксусную кислоту и солевую буферную систему, который, в соответствии с заявляемым по второму варианту препаратом, содержит альфа 16 интерферон человека, буферообразующие соли, которые обеспечивают рН от 5,5 до не более 6,0, а также дополнительно содержит Твин-20 при следующем соотношении ингредиентов до начала лиофильной сушки:

Рекомбинантный альфа 16-интерферон человека способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
с активностью 106-107 МЕ/мл 10-100 мкг/мл
Этилендиаминтетрауксусная кислота 0,5-1,5 мг/мл
Твин-200,5-5 мг/мл
Буферообразующие соли,способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
обеспечивающие рН 5,5 - не более 6,0 и способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
молярность, равную при растворении 10-20 мМ остальное

Кроме этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат содержит модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что фармацевтический препарат имеет сухую лиофилизованную форму как основу лекарственных форм в виде таблетки, и/или капсулы, и/или порошка, и/или гранул, и/или суппозитория.

Указанный для заявленной группы изобретений единый технический результат, таким образом, достигается комплексно путем использования рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2949 (RU 2203950, опубликованный 10.05.2003), культивирования его в питательной среде и индукции синтеза целевого белка, удаления клеток, концентрирования культуральной среды, осаждения целевого белка сульфатом аммония, гель-фильтрации на сорбентах типа Сефакрил HR 100 в присутствии 0,5% неионного детергента Твин-20, ионообменной хроматографии на сорбентах типа ДЭАЭ-целлюлоза в присутствии 0,5% неионного детергента Твин-20, а также новым составом препарата, заявленного по первому и второму вариантам

Оптимальными условиями проведения отдельных стадий получения альфа 16-интерферона человека являются следующие:

- концентрированно культуральной среды осуществляют с использованием мембраны АР-0,2-15ПА;

- осаждение целевого белка проводят при 60% насыщения сульфатом аммония;

- растворение полученного осадка, содержащего альфа 16-интерферон в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,5% Твин-20;

- проведение гель-фильтрации на Сефакриле HR 100 в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20;

- проведение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с использованием в качестве уравновешивающего раствора 50 мМ аммоний-ацетатного буфера (рН 7,0), содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20; проведение элюции целевого белка градиентом концентрации хлористого натрия 0,1-1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20.

Полученный в результате использования указанной технологии препарат альфа 16-интерферона содержит следующие ингредиенты:

1. Для препарата в сухой лиофилизованной форме, как было показано выше:

Альфа 16-интерферон человека способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
с активностью 106-107 МЕ/мл 10-100 мкг/мл
этилендиаминтетрауксусная кислота ЭДТА 0,5-1,5 мг/мл
Твин-200,5-5 мг/мл
Буферообразующие соли, обеспечивающие рН 5,5-не более 6,0 и способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
молярность, равную при растворении 10-20 мМ остальное

Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в твердой форме являются фармацевтические препараты, содержащие в качестве действующего начала или рекомбинантный альфа 16-интерферон человека, или модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.

Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в твердой форме являются таблетки, капсулы, порошки, гранулы, суппозитории, формы, пригодные для наружного применения, например мази, гели или жидкие препараты, полученные растворением твердой формы в фармацевтически приемлемом растворителе, полученные стандартными технологическими способами (Валевко С.А. и др. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. 2007).

2. Для препарата в жидкой и сухой лиофилизованной форме, как было показано выше:

Альфа 16-интерферон человека способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405
с активностью 106-107 МЕ/мл 10-100 мкг/мл
этилендиаминтетрауксусная кислота ЭДТА 0,5-1,5 мг/мл
Твин-200,5-5 мг/мл
Буферный раствор рН 5,5 - не более 6,0, 10-20 мМ остальное

Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в жидкой форме являются фармацевтические препараты, содержащие в качестве действующего начала или рекомбинантный альфа 16-интерферон человека, или модифицированный рекомбинантный альфа 16-интерферон человека.

Частными случаями реализации фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона в жидкой форме являются эмульсии, сиропы, эликсиры, капли, липосомные формы, формы, пригодные для наружного применения, например гели, увлажненные салфетки, полученные стандартными технологическими способами (Валевко С.А. и др. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. 2007).

Существенными отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

- последовательное использование стадий ультрафильтрации и осаждения целевого белка сульфатом аммония, приводящее к значительному уменьшению объема обрабатываемой культуральной среды на первых стадиях очистки, что имеет большое значение при масштабировании процесса производства интерферона;

- двухстадийная хроматографическая очистка альфа 16-интерферона в присутствии 0,5% Твин-20, предотвращающая аггрегацию мономеров целевого белка, что повышает выход биологически активного альфа 16-интерферона;

- введение в состав композиции препарата на основе альфа 16-интерферона человека 0,05% Твин-20 в качестве стабилизатора.

Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Очистка рекомбинантного альфа 16-интерферона человека. Штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-2949 - продуцент альфа 16-интерферона человека культивировали ранее описанным способом (RU 2203950, опубликованный 10.05.2003). По окончании процесса культивирования удаляли клетки дрожжей центрифугированиеем при 6-7 тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4°С. Все последующие операции проводили при температуре +4°С. Надосадочную жидкость пропускали через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Millpore Inc.). Полученный таким образом фильтрат концентрировали на ультрафильтрационной установке УПЛ-0,6 с использованием мембраны АР-0,2-15ПА (НПК «Биотест», Кириши), отсекающей соединения с молекулярной массой менее 15 кДа, на этой стадии происходило удаление низкомолекулярных компонентов среды и уменьшение исходного объема до 100-200 мл. Затем проводили солевое осаждение целевого белка, доводя насыщение сульфата аммония до 60%. Осадок целевого белка собирали центрифугированием при 12-14 тыс. об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок растворяли в 50 мМ аммоний-ацетатного буфера (рН 5,5), содержащего 2 мМ ЭДТА, 0,05% Твин-20, и наносили на колонку, содержащую 1000 мл Сефакрила HR 100, уравновешенного этим же буфером. Первые 350 мл отбрасывали, фракции, содержащие целевой белок, объединяли. Полученный таким образом элюат титровывали 10% аммиаком до рН 7,0 и наносили на колонку, содержащую 50 мл ДЕАЕ-целлюлозы, уравновешенной 50 мМ аммоний-ацетатным буфером (рН 7,0), содержащим 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% Твин-20. Отмывали колонку последовательно 100 мл уравновешивающего буфера и 100 мл уравновешивающего буфера, содержащего 0,1 М хлористого натрия. Элюцию проводили градиентом концентрации хлористого натрия от 0,1 М до 1,0 М в 50 мМ аммоний-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащем 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% Твин-20.

Электрофорез в редуцирующих условиях показал, что молекулярная масса полученного белка составляет примерно 20 кДа. Использование данной схемы очистки позволило получить препарат альфа 16-интерферона человека, содержание примесей в котором не более 5%. Удельная активность составила 0,3-1,0×10 8 МЕ/мг. Средний выход из литра культуральной среды составлял 7-9 мг.

Пример 2. Исследование биологической активности и стабильности фармацевтических препаратов на основе альфа 16-интерферона человека, выполненных в жидкой и в сухой лиофилизованной формах.

Заявленный фармацевтический препарат для его испытаний на стабильность готовили следующим образом. Рекомбинантный альфа 16-интерферона человека, полученный по примеру 1, разводили до заданного значения биологической активности (от 5×10 6 МЕ/мл до 2×107 МЕ/мл), забуферивали до заданного значения рН, смешивали с заданным количеством Твин-20 и ЭДТА. Полученную смесь стерилизовали холодной стерилизацией (Валевко С.А. и др. Фармацевтическая технология: Технология лекарственных форм. 2007), переносили в ампулы и запаивали. При необходимости полученную жидкую смесь замораживали в незапаянных ампулах, лиофильно высушивали. Биологическую активность определяли до и после 6 месяцев хранения препарата (табл.1) по подавлению цитопатической активности вируса везикулярного стоматита в первичной культуре L-41 кожно-мышечной ткани эмбрионов человека, чувствительной к интерферонам альфа-типа (Liu Р.Т. et al. // Protein Expres. Purif. 2001. V.22. P.381-387). В качестве стандарта использовали человеческий лейкоцитарный интерферон ОСО 42-28-90-87 (ГИСК, Москва). Содержимое ампул с препаратом на основе альфа 16-интерферона человека в твердой форме растворяли в 1 мл воды, содержимое ампул с жидкой формой использовали без дополнительной обработки.

способ получения рекомбинантного альфа 16-интерферона человека   и фармацевтическая композиция для лечения вирусных заболеваний   на основе рекомбинантного альфа 16-интерферона человека, патент № 2380405

Приведенные результаты показали, что предлагаемый состав фармацевтического препарата по первому и второму вариантам способен сохранять активность альфа 16-интерферона человека в сухой лиофилизованной и жидкой формах.

Пример 3. Изучение побочных эффектов фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона человека, выполненного в жидкой форме.

Исследование включало в себя токсикологическое изучение однократного воздействия препарата в дозе 2,5×l0 5 ME/кг, что превышает терапевтическую дозу в 50 раз, и хронический токсикологический эксперимент.

3.1. Изучение токсического действия препарата на основе альфа 16-интерферона человека проводили на 60 половозрелых рандомбредных белых мышах-самцах и 60 половозрелых рандомбредных мышах-самках массой 16-18 г, а также на 60 морских свинках массой 200-250 г. Препарат вводили однократно подкожно. При введении препарата животным подкожно в этой дозе у них отмечено некоторое кратковременное учащение дыхания. Половые различия у мышей к токсическому действию препарата не наблюдали. Гистологическое исследование тканей и органов оставшихся по окончании срока наблюдения живых животных видимых патологических изменений со стороны обследованных органов не показало.

Таким образом, однократное введение максимально-переносимой дозы препарата экспериментальным животным не сопровождалось токсическими эффектами.

3.2. Исследование хронической токсичности препарата на основе альфа 16-интерферона человека проводили на 90 белых беспородных мышах-самцах массой 18-20 г, которым в течение 90 суток однократно ежедневно вводили этот препарат подкожно. В течение трех месяцев хронического эксперимента у подопытных животных не наблюдали признаков выраженной интоксикации и существенных изменений в поведении. Динамика прироста массы тела экспериментальных животных статистически достоверно не отличалась от аналогичного показателя в контроле.

У животных, длительное время получавших препарат, оценивали в динамике состояние неспецифической резистентности. Для этого исследовали поглотительную и переваривающую активность фагоцитов периферической крови, а также уровни лизоцима, неспецифических эстераз и миелопероксидазы в сыворотке крови. Величины исследованных параметров в большинстве случаев либо не отличались от контрольных значений, либо незначительно их превышали.

Состояние иммунокомпетентных клеток у подопытных животных оценивали по выраженности антителогенеза на специфический антиген (химическая сорбированная брюшнотифозная вакцина) и уровню оксида азота в иммунокомпетентных органах и сыворотке крови. Длительное введение препарата на основе альфа 16-интерферона человека не оказывало статистически значимого отрицательного влияния на функциональное состояние В-системы иммуногенеза. Более того, наблюдалось незначительное повышение выработки специфических антител к брюшному тифу у иммунизированных животных. В тканях иммунокомпетентных органов и сыворотке крови мышей повышается содержание оксида азота по сравнению с аналогичными показателями в контроле, что свидетельствует о стимулирующем влиянии препарата на клеточный компонент иммуногенеза.

Суммируя результаты, характеризующие хроническую токсичность препарата на основе альфа 16-интерферона человека при длительном подкожном применении у белых беспородных мышей, следует отметить, что препарат не оказывает сколько-нибудь выраженного отрицательного влияния на общее состояние экспериментальных животных и не обладает при столь напряженной схеме введения иммунодепрессивным действием. Можно отметить стимулирующее действие препарата на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы.

Хроническую токсичность препарата изучали также в опытах на 100 белых крысах массой 240-250 г, которым в течение 10 дней ежедневно однократно вводили препарат подкожно. Влияние препарата на основе альфа 16-интерферона человека оценивали по изменению общего состояния, массы тела, функционального состояния печени и почек, некоторых органов эндокринной системы (надпочечники, поджелудочная железа) и периферической крови. По окончании эксперимента у всех животных проводили патогистологическое исследование внутренних органов.

Проведенные эксперименты показали, что применение препарата на основе альфа 16-интерферона не вызывает у подопытных животных изменений, выходящих за пределы физиологических колебаний нормы. Масса тела экспериментальных животных статистически достоверно не отличалась от контроля. Функциональное состояние печени и поджелудочной железы у подопытных животных на протяжении хронического эксперимента не отличалось значимо от нормы.

Макроскопическое и гистологическое исследование внутренних и эндокринных органов (теменная область головного мозга, сердце, легкие, печень, почки, селезенка, желудок, двенадцатиперстная кишка, надпочечники, щитовидная и поджелудочная железы) не выявило патологических изменений у подопытных животных.

Влияние препарата на основе альфа 16-интерферона на периферическую кровь изучали на 30 белых крысах массой 310-340 г. Результаты проведенных исследований показали, что наиболее значимые изменения происходили в количественном составе лейкоцитов, которое достоверно возрастало на 3, 5, 7 и 10 сутки после первого введения препарата. При детальном исследовании лейкоцитарного состава периферической крови подопытных животных оказалось, что увеличение общего количества лейкоцитов под влиянием исследуемого препарата было обусловлено достоверным увеличением количества нейтрофилов и моноцитов по сравнению с аналогичными показателями в контроле. Эти данные могут свидетельствовать о том, что препарат на основе альфа 16-интерферона оказывает стимулирующий эффект на кроветворение и повышает неспецифическую резистентность организма.

Суммируя результаты, характеризующие хроническую токсичность препарат на основе альфа 16-интерферона при подкожном применении у белых крыс, следует отметить, что препарат не оказывает отрицательного влияния на общее состояние экспериментальных животных и токсического действия на функциональное состояние их жизненно важных органов и систем. Более того, в отношении системы кроветворения установлено стимулирующее действие препарата на компоненты белой крови, прежде всего на нейтрофилы и моноциты - основные клеточные компоненты неспецифической резистентности организма.

3.3. Аллергизирующие свойства препарат на основе альфа 16-интерферона определяли в экспериментах на морских свинках-самцах массой 250-300 г. Перед постановкой конкретного эксперимента животных не кормили в течение суток. Все животные получали стандартную диету, представленную в виде гранулированного корма. Проведенные исследования свидетельствуют о том, введение в организм препарата не приводит к активации процессов, ответственных за развитие аллергического состояния.

3.4. Изучение специфической активности препарата на основе альфа 16-интерферона проводили на моделях вирусных инфекций.

Для оценки эффективности препарата использовали белых беспородных мышей массой от 16 до 18 г.

Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) штамм «Тринидад» вводили животным подкожно в объеме 0,3 мл/мышь. Альфа 16-интерферон вводили подкожно однократно, за 4 часа до заражения в дозе 25000 МЕ/мышь. Результаты проведенных исследований показали, что испытуемый препарат обладает специфической противовирусной активностью в отношении экспериментальной инфекции ВЭЛ и, в зависимости от заражающей дозы возбудителя, повышает выживаемость инфицированных животных на 12-50% (Р<0,05).

Для моделирования экспериментальной гриппозной инфекции использовали вирус гриппа А (ВГА) штамм Виктория/72 (H3N2), полученный из музея вирусных штаммов НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Пастера МЗ РФ, Санкт-Петербург, в заражающей дозе 3-4 ЛД50. Заражение животных проводили однократно интраназально, в объеме 0,1 мл. Эффективность альфа 16-интерферона оценивали по сопоставлению величин показателей выживаемости животных в опытных и контрольных группах (по 20 мышей). Наблюдение и учет гибели животных осуществляли в течение 15 суток после заражения.

Результаты проведенных экспериментов (табл.2) свидетельствовали, что испытуемый препарат в дозах 5000,0 и 15000,0 МЕ/мышь оказывал защитное действие в отношении экспериментальной гриппозной инфекции при его применении как до, так и после заражения животных ВГА. В случае профилактического назначения препарата предпочтительнее его вводить за 24 часа до заражения, а с терапевтической целью - многократно после заражения. Использование альфа 16-интерферона по таким схемам позволяет добиться максимального протективного эффекта, составившего 100% и превысившего контрольный уровень на 80%.

Совокупность данных, полученных в ходе изучения побочных эффектов фармацевтического препарата на основе альфа 16-интерферона человека, позволяет сделать заключение о том, что препарат на основе альфа 16-интерферона человека можно рассматривать как безвредный и высокоактивный противовирусный иммунобиологический препарат, не обладающий побочными эффектами.

Таблица 2
Эффективность применения препарата на основе альфа 16-интерферона человека при гриппозной инфекции
Доза препарата, МЕ/мышь Время введения препарата Частота введения препарата Выживаемость, %
Не вводили (контроль) -- 20*
5000,0 48 ч до заражения однократно 80*
5000,0 24 ч до заражения однократно 100*
15000,0 48 ч до заражения однократно 90*
15000,0 24 ч до заражения однократно 100*
5000,0 24 ч после заражения однократно 75*
5000,0 48 ч после заражения однократно 60*
5000,0 72 ч после заражения однократно 55*
5000,0 24, 48 ч после заражения двукратно 100*
5000,0 24, 48, 72 ч после заражения трехкратно 100*
15000,0 24 ч после заражения однократно 80*
15000,0 48 ч после заражения однократно 100*
15000,0 72 ч после заражения однократно 75*
15000,0 24, 48 ч после заражения двукратно 100*
15000,0 24, 48, 72 ч после заражения трехкратно 100*
* - Различия с показателями выживаемости в контрольной группе достоверны вероятностью 0,95.

Как показали многочисленные лабораторные испытания, преимущество заявленной группы изобретений по сравнению с мировыми аналогами состоит в том, что подтверждена экспериментальная возможность получения фармацевтического препарата медицинского назначения на основе альфа 16-интерферона человека, обладающего противовирусной активностью, а также, что особенно важно, не выявившей побочных и опасных для потенциальных пациентов эффектов.

Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет, как показали результаты испытаний, существенно снизить риски возникновения побочных эффектов при применении нового фармацевтического препарата на основе интерферона человека за счет использования системы экспрессии дрожжей для продукции альфа 16-интерферона человека и применения в качестве стабилизатора, предотвращающего агрегацию рекомбинатного белка, Твин-20. Кроме того, достоинством и преимуществом заявленного фармацевтического препарата является то, что он может быть использован как в жидкой форме, так и в твердой и сухой лиофилизованной формах, а также и для наружного применения, что позволяет существенно расширить спектр применения заявленного препарата при лечении заболеваний различной этиологии.

Класс C12N1/16 дрожжи; питательные среды для них

штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5031 для производства хересных виноматериалов -  патент 2529838 (27.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5030 для производства белых столовых вин -  патент 2529834 (27.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5032 для производства красных столовых виноматериалов -  патент 2529833 (27.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae imb y-5029 для производства десертных вин -  патент 2529832 (27.09.2014)
способ культивирования дрожжей phaffia rhodozyma для получения кормовой добавки, содержащей астаксантин -  патент 2529715 (27.09.2014)
модифицированная дрожжевая двугибридная система для эффективного исследования взаимодействия между белками и их доменами. -  патент 2529356 (27.09.2014)
способ культивирования хлебопекарных дрожжей -  патент 2528872 (20.09.2014)
способ получения препарата для профилактики инфекций пищеварительного тракта у сельскохозяйственной птицы и препарат, полученный способом -  патент 2528747 (20.09.2014)
штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae для производства шампанского -  патент 2526493 (20.08.2014)
применение штамма дрожжей komagataella pastoris в качестве реципиента для конструирования продуцентов целевого белка -  патент 2522479 (20.07.2014)

Класс C12N15/21 альфа-интерферон

способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека -  патент 2432401 (27.10.2011)
способ микробиологического синтеза зрелого интерферона альфа-2 человека, штамм saccharomyces cerevisiae - продуцент зрелого интерферона альфа-2 человека (варианты) -  патент 2427645 (27.08.2011)
рекомбинантная плазмидная днк pif tren, кодирующая полипептид интерферона альфа-2b человека, и штамм бактерий escherichia coli-продуцент полипептида интерферона альфа-2b человека -  патент 2326168 (10.06.2008)
раствор для инъекций, рекомбинантная плазмидная днк psx50, кодирующая синтез рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона, штамм escherichia coli sx50 - промышленный штамм-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ промышленного получения интерферона альфа-2b -  патент 2319502 (20.03.2008)
штамм escherichia coli bl21 (de3)[payc-et-(hifn- 2b)-iaci]-продуцент рекомбинантного человеческого альфа-2b интерферона и способ его культивирования -  патент 2303063 (20.07.2007)
способ получения рекомбинантного интерферона альфа-2b и интерферонсодержащий препарат (варианты) -  патент 2294372 (27.02.2007)
слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, димерный слитый белок, фармацевтическая композиция, их содержащая, молекула днк (варианты) и способ адресования интерферона-альфа в ткани печени -  патент 2262510 (20.10.2005)
рекомбинантная плазмидная днк pes4-4, кодирующая полипептид интерферон альфа-2b человека, и штамм escherichia coli bdees4 - продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2b человека -  патент 2258081 (10.08.2005)
способ получения рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2b, рекомбинантная плазмида и штамм продуцент для его осуществления -  патент 2242516 (20.12.2004)
рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения -  патент 2230117 (10.06.2004)
Наверх