пептид, обладающий антимикробной активностью
Классы МПК: | C07K14/415 из растений |
Автор(ы): | Одинцова Татьяна Игоревна (RU), Егоров Цезий Алексеевич (RU), Гришин Евгений Васильевич (RU), Василевский Александр Александрович (RU), Мусолямов Александр Хусаинович (RU), Рогожин Евгений Александрович (RU), Славохотова Анна Александровна (RU), Пухальский Виталий Анатольевич (RU), Шиян Александр Николаевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2008-07-15 публикация патента:
27.01.2010 |
Биологически активный пептид WAMP-1, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Ala1-Gln2 -Arg3-Cys4-Gly5-Asp6 -Gln7-Ala8-Arg9-Gly10 -Ala11-Lysl2-Cys13-Prol4 -Asn15-Cys16-Leul7-Cysl8 -Cysl9-Gly20-Lys21-Tyr22 -Gly23-Phe24-Cys25-Gly26 -Ser27-Gly28-Asp29-Ala30 -Tyr31-Cys32-Gly33-Ala34 -Gly35-Ser36-Cys37-Gln38 -Ser39-Gln40-Cys41-Arg42 -Gly43-X, где Х - Cys44 или Cys44 -Arg45, обладает антимикробным действием. Может быть использован для защиты растений и пищевых продуктов от поражения патогенными грибками и бактериями. 3 ил., 2 табл.
Формула изобретения
Пептид, обладающий антимикробной активностью, имеющий следующую аминокислотную последовательность:
Ala1-Gln 2-Arg3-Cys4-Gly5-Asp 6-Gln7-Ala8-Arg9-Gly 10-Ala11-Lys12-Cys13-Pro 14-Asn15-Cys16-Leu17-Cys 18-Cys19-Gly20-Lys21-Tyr 22-Gly23-Phe24-Cys25-Gly 26-Ser27-Gly28-Asp29-Ala 30-Tyr31-Cys32-Gly33-Ala 34-Gly35-Ser36-Cys37-Gln 38-Ser39-Gln40-Cys41-Arg 42-Gly43-X,
где Х - Cys44 или Cys44-Arg45.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биохимии, к биологически активным пептидам, обладающим антимикробной активностью, которые могут быть использованы в биотехнологии для создания устойчивых к патогенам форм сельскохозяйственных культур и в пищевой промышленности для консервации продуктов питания.
Потери урожая сельскохозяйственных культур, связанные с патогенами (грибами, бактериями, вирусами и вироидами), насекомыми-вредителями и нематодами достигают 45% [Oeke B.C., Dehne H.W., Schonbeck P., Weber A. Crop Production and Crop Protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops. - 1994. - Elsevier, Amsterdam]. Помимо снижения производства сельскохозяйственной продукции, патогены ухудшают ее качество. Так микотоксины Fusarium sp., присутствующие в зараженном зерне, токсичны для человека и животных. Ежегодно ущерб, наносимый патогенами и вредителями, достигает 100 миллиардов долларов. На фоне стремительного роста населения Земли на 1,5% в год увеличивается и потребность в пищевом белке, которая в настоящее время составляет 230 млн. тонн в год, что делает проблему повышения урожайности сельскохозяйственных культур чрезвычайно актуальной. Традиционные методы селекции не всегда эффективны из-за отсутствия соответствующих генов устойчивости, кроме того, они трудоемки и длительны. Использование химических средств защиты растений представляет существенную угрозу экологической безопасности и позволяет снизить потери урожая лишь на 5-10%.
Альтернативной стратегией повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к патогенам и насекомым-вредителям, а также к стрессовым факторам окружающей среды абиотической природы (засухе, засоленности почвы и др.) служит генетическая инженерия, которая позволяет встраивать чужеродные гены, обуславливающие устойчивость, в геномы культурных растений. Растет спектр трансгенов, используемых для трансформации растений. Путем генетической трансформации уже получены сельскохозяйственные культуры, устойчивые к гербицидам, насекомым-вредителям, а также абиотическому стрессу.
Известен генетически модифицированный сорт папайи, устойчивый к вирусу кольцевой пятнистости, за счет встраивания в геном гена белка оболочки вируса [Ferreira S.A., Pitz K.Y., Manshardt R., Zee F., Fitch M., Gonsalves D. Virus coat protein transgenic papaya provides practical control of papaya ringspot virus in Hawaii. // Plant Dis. - 2002. - Vol.86. - P.101-106]. Известен генетически модифицированный сорт картофеля, устойчивый к вирусу скручивания листа. В этом случае устойчивость к вирусу обеспечивается ингибированием активности гена репликазы [Delvas M., Ceriani M.F., Collavita M., Butzonich I., Hopp H.E. Analysis of transgenic potato plants expressing potato leaf-roll virus coat protein gene. // Plant Physiol. - 1993. - Vol.102 - P.174-180].
В настоящее время не известны генетически модифицированные сельскохозяйственные культуры, устойчивые к грибам и бактериям.
По современным представлениям в растениях содержится целый арсенал средств, который позволяет им бороться с патогенами и насекомыми-вредителями. Существенную роль среди них играют соединения, обладающие антимикробными свойствами, к которым относятся вторичные метаболиты растений - фитоалексины и фитоантисипины, а также ряд белков и пептидов. Повышение устойчивости растений может быть достигнуто как усилением экспрессии собственных генов, участвующих в защитных реакциях, так и встраиванием в геном генов, кодирующих белки и пептиды с антимикробными свойствами, из других видов растений. В этом смысле антимикробные пептиды, обладающие широким спектром антимикробного действия, представляют особый интерес, поскольку их гены могут быть непосредственно встроены в геном чувствительных к патогенам растений с использованием методов генетической трансформации [Carlini C.R., Grossi-de-Sa M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. // Toxicon. - 2002. - Vol.40. - P.1515-1539].
Известен наиболее близкий к заявляемому по структуре и антифунгальным свойствам пептид EAFP1, выделенный из коры Eucommia ulmoides [Two novel antifungal peptides distinct with a five-disulfide motif from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. // FEBS Lett. - 2002. - Vol.521. - P.87-90]. Вещество относится к семейству цистеин-богатых хитин-связывающих пептидов, ингибирует рост некоторых патогенных грибов и бактерий в концентрациях 3,5-30 мкМ.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента пептидов растительного происхождения, обладающих антимикробной активностью.
Поставленная задача решается за счет структуры нового пептида WAMP-1, имеющего следующую аминокислотную последовательность:
Ala 1-Gln2-Arg3-Cys4-Gly 5-Asp6-Gln7-Ala8-Arg 9-Gly10-Alall-Lysl2-Cys 13-Pro14-Asnl5-Cysl6-Leu l7-Cysl8-Cysl9-Gly20-Lys 21-Tyr22-Gly23-Phe24-Cys 25-Gly26-Ser27-Gly28-Asp 29-Ala30-Tyr31-Cys32-Gly 33-Ala34-Gly35-Ser36-Cys 37-Gln38-Ser39-Gln40-Cys 41-Arg42-Gly43-X,
где Х - Cys44 (WAMP-1a) или Cys44-Arg 45 (WAMP-1b).
Заявляемый пептид проявляет выраженную антифунгальную и антимикробную активность в отношении следующих грибов-патогенов растений, плесневых грибов и патогенных бактерий: Fusarium solani VKM F-142, Fusarium verticillioides VKM F-670, Fusarium oxysporum TCXA-4, Botrytis cinerea VKM F-85, Neurospora crassa VKM F-184, Pseudomonas syringae pv. tomato, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis и Erwinia carotovora. Для полного ингибирования роста перечисленных грибов и бактерий in vitro необходимы микромолярные концентрации пептида.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая антимикробная активность заявляемого пептида.
Пептид WAMP-1 состоит из 44 или 45 аминокислотных остатков и может быть получен химическим синтезом, биотехнологически или выделен из семян пшеницы Triticum kiharae, которая относится к семейству злаковые Роасеае, классу однодольные Monocotyledones, отделу покрытосеменные или цветковые растения Magnoliophyta (Angiospermae).
Изобретение иллюстрируют рисунки:
Фиг.1 - Разделение суммарного экстракта из 10 г семян пшеницы методом аффинной хроматографии на колонке HiTrap Heparin HP объемом 5 мл (Amersham Biosciences, США) ступенчатым градиентом NaCl, скорость элюции - 1 мл/мин. Детектирование белков и пептидов в элюате по оптической плотности при 280 нм. Серым прямоугольником отмечена фракция, содержащая пептид WAMP-1.
Фиг.2 - Разделение 100-мМ фракции, содержащей пептид WAMP-1 (см. фиг.1), с помощью гель-фильтрации на колонке Superdex Peptide HR 10/30 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) размером 1×30 см. Разделение в 5%-ном ацетонитриле в 0,05%-ной трифторуксусной кислоте, скорость элюции - 1 мл/мин. Детекция белков и пептидов по оптической плотности при 214 нм. Серым прямоугольником отмечена фракция, содержащая пептид WAMP-1.
Фиг.3 - Разделение фракции, содержащей пептид WAMP-1 (см. фиг.2) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Vydac С18 размером 4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм, (The Nest Group, Inc., США) в линейном градиенте ацетонитрила в присутствии 0,1%-ной трифторуксусной кислоты при скорости элюции 1 мл/мин и температуре 40°С. Регистрация оптической плотности элюата при 214 нм. Стрелкой отмечена фракция, содержащая пептид WAMP-1.
Изобретение иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Выделение пептида WAMP-1
Семена пшеницы измельчают до состояния муки в кофемолке и экстрагируют 5-ю объемами смеси 1%-ной трифторуксусной кислоты, 1 М НСl, 5%-ной НСООН и 1%-ного NaCl при комнатной температуре и перемешивании в течение 1 ч. Суспензию центрифугируют при 22000 g в течение 15 мин при комнатной температуре, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость обессоливают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Aquapore RP-300 C8 (10×30 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 7,5 мкм; Applied Biosystems, США). Используют следующие растворы: А - 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, Б - 80%-ный ацетонитрил в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Колонку промывают 6-ю объемами раствора Б и уравновешивают 6-ю объемами раствора А при скорости элюции 1,5 мл/мин. Детекцию проводят по оптическому поглощению элюата при 214 нм. После нанесения кислотного экстракта на колонку ее промывают раствором А до тех пор, пока величина поглощения элюата не станет равной исходному значению. Белки и пептиды десорбируют с колонки 70% раствора Б, упаривают на вакуумном концентраторе для удаления ацетонитрила и лиофильно высушивают.
Полученный сухой остаток из 10 г исходного сырья растворяют в 5 мл раствора В (10 мМ Трис-HCl, рН 7,2) и разделяют с помощью аффинной хроматографии на колонке HiTrap Heparin HP объемом 5 мл (Amersham Biosciences, США), предварительно уравновешенной 5-ю объемами буфера В. После нанесения образца сорбент сначала отмывают буфером В от несвязавшихся веществ, после чего белки и пептиды элюируют сначала 100 мМ NaCl в буфере В (фракция I), а затем 500 мМ NaCl в буфере В (фракция II) со скоростью 1 мл/мин. Детекцию белков и пептидов проводят по оптическому поглощению элюата при 280 нм (рис.1). Полученные фракции обессоливают и высушивают, как описано выше, и проводят тестирование их биологической активности.
Фракцию I растворяют в 1 мл раствора Г (5%-ный ацетонитрил в 0,05%-ной трифторуксусной кислоте) и разделяют с помощью гель-фильтрации на колонке Superdex Peptide HR 10/30 column (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) размером 1×30 см, предварительно уравновешенной раствором Г. На колонку наносят 200 мкл раствора фракции I. Разделение ведут при скорости элюции 150 мкл/мин и комнатной температуре. Детекцию белков и пептидов осуществляют по оптическому поглощению при 214 нм (рис.2). Полученные фракции высушивают, проводят тестирование их биологической активности.
Фракции со временем элюции 50-55 мин (рис.2), обладающие антифунгальной активностью, объединяют и разделяют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Vydac C18 (4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм; The Nest Group, Inc., США). Фракционирование проводят в линейном градиенте ацетонитрила: 10-50% раствора Б за 60 мин при скорости элюции 1 мл/мин и температуре 40°С. Детекцию проводят по оптическому поглощению при 214 нм (рис.3), проводят тестирование полученных фракций. Пептид WAMP-1 элюируется со временем удерживания 17,5 мин. В результате получают препарат искомого пептида с содержанием примесей менее 3%. Две молекулярные формы пептида WAMP-1 разделяются путем рехроматографии в тех же условиях.
Пример 2
Установление аминокислотной последовательности пептида WAMP-1
Для определения числа остатков цистеина в аминокислотной последовательности пептида проводят восстановление дисульфидных связей и алкилирование образовавшихся тиольных групп. Восстановление и алкилирование проводят по модифицированной методике [Thomsen J., Bayne S. Microscale alkylation with 4-vinylpyridine. // J. Protein Chem. - 1988. - Vol.7. - P.295-296]. Пептид (1 нмоль) растворяют в 35 мкл буфера, содержащего 6 М гуанидин-гидрохлорид и 2 мМ ЭДТА в 0,5 М Трис-НСl буфере, рН 8,5), добавляют 2 мкл водного раствора, содержащего 1 мкмоль 1,4-дитиотреитола, продувают азотом, перемешивают и инкубируют при 40°С в течение 4 час. Затем к смеси добавляют 2 мкл 50%-ного раствора 4-винилпиридина в 2-пропаноле, перемешивают и инкубируют в темноте 20 мин при комнатной температуре. К смеси добавляют 120 мкл 0,1%-ной трифторуксусной кислоты, и восстановленный и алкилированный пептид отделяют с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии на колонке Vydac C18 (4,6×250 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм; The Nest Group, Inc., США), предварительно уравновешенной 0,1%-ной трифторуксусной кислотой. Продукты реакции и реагенты отделяют промывкой колонки этим же растворителем до достижения исходного оптического поглощения элюата, пептид элюируют в тех же условиях, которые описаны в примере 1 для очистки пептида WAMP-1.
Определение аминокислотной последовательности очищенного восстановленного и алкилированного пептида WAMP-1 проводят методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Precise 492 (Applied Biosystems, США). В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность WAMP-1, состоящую из 44 или 45 аминокислотных остатков:
Alal-Gln 2-Arg3-Cys4-Gly5-Asp 6-Gln7-Ala8-Arg9-Gly l0-Alall-Lysl2-Cys13-Pro l4-Asnl5-Cysl6-Leul7-Cys l8-Cysl9-Gly20-Lys21-Tyr 22-Gly23-Phe24-Cys25-Gly 26-Ser27-Gly28-Asp29-Ala 30-Tyr31-Cys32-Gly33-Ala 34-Gly35-Ser36-Cys37-Gln 38-Ser39-Gln40-Cys41-Arg 42-Gly43-X,
где X - Cys44 (WAMP-1a) или Cys44-Arg45 (WAMP-1b).
Пример 3
Определение относительной молекулярной массы и числа свободных и дисульфидсвязанных остатков цистеина в пептиде WAMP-1
Полученную аминокислотную последовательность, а также индивидуальность очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют дигидробензойную кислоту (10 мг/мл в 50%-ном ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную трифторуксусную кислоту). Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов и белков с диапазоном молекулярных масс 700-66000 Да (Sigma, США).
Измеренная моноизотопная молекулярная масса природного пептида WAMP-1 составляет 4431,95 Да и в пределах точности MALDI-масс-спектрометра (0,01%) не отличается от расчетной (4431,66 Да). Молекулярная масса алкилированного невосстановленного пептида WAMP-1 составляет 4431,88 Да, т.е. также не отличается от измеренной молекулярной массы природного пептида. Таким образом, пептид WAMP-1 не содержит свободных сульфгидрильных групп, а все 10 остатков цистеина вовлечены в образование 5 дисульфидных связей, пептид не содержит каких-либо иных химических модификаций.
Пример 4
Биологические свойства пептида WAMP-1
Для определения антифунгальной активности фракций, полученных при разделении кислоторастворимых белков и пептидов пшеницы, а также очищенного пептида WAMP-1 используют следующие культуры грибов: Fusarium solani VKM F-142, Fusarium verticillioides VKM F-670, Fusarium oxysporum TCXA-4, Botrytis cinerea VKM F-85, Neurospora crassa VKM F-184. Для определения антибактериальной активности выделенного пептида WAMP-1 используют следующие культуры бактерий: Pseudomonas syringaepv. tomato, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis и Erwinia carotovora.
Для изучения активности выделенные фракции и очищенный пептид WAMP-1 замораживают в жидком азоте, лиофильно высушивают, перерастворяют в воде и вновь высушивают. Сухие вещества перерастворяют в 50 мкл воды. Концентрацию определяют по спектру поглощения в УФ области.
Антифунгальную активность определяют по ингибированию прорастания спор в жидкой питательной среде (картофельный декстрозный раствор) в 96-луночных планшетах. Определение концентраций пептида, необходимых для 50%-ного подавления прорастания спор грибов (IC50), проводят методом двойного разбавления. Готовят серию двукратных разведении тестируемых веществ в воде. В лунки помещают тестируемый образец и суспензию спор гриба. Общий объем пробы составляет 100 мкл. В качестве контроля служит лунка, в которую вместо раствора тестируемого образца добавлена стерильная дистиллированная вода. Планшеты инкубируют в течение 24 ч и проводят оценку ингибирования прорастания спор по оптической плотности суспензии при 620 нм. Результаты для пептида WAMP-1 приведены в табл.1.
Таблица 1 | |
Антифунгальные свойства пептида WAMP-1* | |
Гриб | IC50 , мкМ |
Fusarium solani | 5 |
Fusarium verticillioides | 30 |
Fusarium oxysporum | 15 |
Botrytis cinerea | 20 |
Neurospora crassa | 10 |
*Данные получены для пептида WAMP-1а |
Антибактериальную активность определяют методом радиальной диффузии. Для тестирования антибактериальной активности по 50 мкл растворов исследуемых пептидов разной концентрации наносят на ватные тампоны, которые затем помещают в лунки диаметром 0,5 см на чашках Петри с агаризованной средой LB. Чашки предварительно засевают бактериальными культурами, росшими в течение 16-18 ч в жидкой среде LB. Для тестирования используют штамм возбудителя бактериальной крапчатости томата Pseudomonas syringae pv. tomato, штамм возбудителя бактериального рака томата Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis и штамм возбудителя мокрой гнили Erwinia carotovora. Чашки инкубируют при комнатной температуре. Результаты теста оценивают через 24-48 ч по размеру зоны подавления роста бактерий. В качестве контроля используют антибиотик клафоран. Результаты для пептида WAMP-1 приведены в табл.2.
Таблица 2 | |||
Антибактериальные свойства пептида WAMP-1* | |||
Концентрация пептида (мкг/50 мкл)** | Зона подавления роста бактерий, см (с учетом размера лунки)*** | ||
Р. syringae | E. carotovora | С. michiganensis | |
10 | 1,3 (1,4) | 1,5 (3,4) | 1,7 |
5 | 1,2 (1,2) | 1,3 (2,7) | 1,5 |
2.5 | 0,9 (1,0) | 1,1 (2,2) | 1,3 |
*Данные представлены для WAMP-1а | |||
**объем всех проб - 50 мкл | |||
***диаметр лунки - 0,5 см |
В скобках приведен размер зон подавления роста бактерий, вызванного антибиотиком клафораном.