лечение микозов

Формула изобретения

1. Композиция, предназначенная для применения при лечении инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 из организма рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол, вориконазол и позаконазол.

2. Композиция по п.1 для применения при лечении инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus.

3. Композиция по п.1 для применения в способе лечения инфекций, вызываемых грибами, у человека или животного.

4. Композиция по любому из пп.1-3, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1.

5. Композиция по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2.

6. Композиция по п.4, где указанное антитело включает последовательность SEQ ID NO:3.

7. Композиция по п.5, где указанное антитело включает последовательность SEQ ID NO:3.

8. Композиция по п.2, где инфекция, вызываемая грибами, является устойчивой к указанному противогрибковому средству, используемому отдельно.

9. Композиция по п.6, где инфекция, вызываемая грибами, является устойчивой к указанному противогрибковому средству, используемому отдельно.

10. Композиция по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент помечены обнаруживаемой меткой.

11. Композиция по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с эффекторной молекулой.

12. Комбинированный препарат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 из организма рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол, вориконазол и позаконазол, который предназначен для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus.

13. Комбинированный препарат по п.12 для применения в способе лечения инфекций, вызываемых грибами, у человека или животного, где инфекция вызвана грибами рода Aspergillus.

14. Комбинированный препарат по п.12 или 13, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1.

15. Комбинированный препарат по п.12, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2.

16. Комбинированный препарат по п.14, где указанное антитело включает последовательность SEQ ID NO:3.

17. Комбинированный препарат по п.15, где указанное антитело включает последовательность SEQ ID NO:3.

18. Комбинированный препарат по п.16, где инфекция, вызываемая грибами, является устойчивой к указанному противогрибковому средству, используемому отдельно.

19. Комбинированный препарат по п.12, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент помечены обнаруживаемой меткой.

20. Комбинированный препарат по п.12, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с эффекторной молекулой.

21. Применение композиции по п.1 при осуществлении способа производства лекарственного средства для лечения инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus.

22. Применение по п.21, где указанная инфекция, вызываемая грибами, является устойчивой к указанному противогрибковому средству, используемому отдельно.

23. Способ лечения инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus, у человека или животного, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества композиции по п.1.

24. Способ по п.23, где указанная композиция вводится перорально.

25. Способ лечения инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus, у человека или животного, который включает одновременное, раздельное или последовательное введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичных по крайней мере к одному эпитопу hsp90 из организма рода Aspergillus, и по крайней мере одного противогрибкового средства, выбираемого из группы, включающей итраконазол, вориконазол и позаконазол.

26. Способ по п.23 или 25, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1.

27. Способ по п.25, где указанные препараты вводятся перорально.

28. Набор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 из организма рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол, вориконазол и позаконазол, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент и противогрибковое средство предназначены для одновременного, раздельного или последовательного применения, для лечения инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus.

29. Набор по п.28 для применения при лечении инфекций, вызываемых грибами рода Aspergillus.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым композициям и препаратам, содержащим эффективные противогрибковые средства вместе с антителом, которое может быть включено в указанные композиции и препараты.

Микозы являются основной причиной смертности пациентов в отделениях интенсивной терапии, особенно истощенных пациентов c ослабленным иммунитетом (Gold, J.W.M., 1984, Am. J. Med. 76: 458-463; Klein, R.S. et al. 1984, N. Engl. J. Med. 311:354-357; Burnie, J.P., 1997, Current Anaesthesia & Critical Care 8: 180-183). Наличие и персистенцию микозов можно объяснить давлением отбора противогрибковых средств широкого спектра действия, часто продолжительным пребыванием пациентов в лечебных учреждениях, таких как отделения интенсивной терапии, проблемами, связанными с диагностикой указанных инфекций, и отсутствием в терапии эффективных противогрибковых средств. Хотя строгий гигиенический контроль может привести к некоторой профилактике микозов в лечебных учреждениях или в других окружающих условиях, вспышки инфекций продолжают оставаться серьезной проблемой и требуют специального рассмотрения.

Хотя причиной большинства клинических проявлений микозов является главным образом Aspergillus fumigatus, другие виды Aspergillus, такие как A. flavus, A. terreus и A. niger, также ассоциированы с тяжелыми микозами у субъектов с ослабленным иммунитетом (Espinel-Ingroff, A., 2003, J. Clin. Microbiol. 41: 403-409).

Обнаружение и диагностика патогенных грибов, вызывающих микозы, имеет важное значение для последующего лечения, так как противогрибковые средства могут более эффективно воздействовать на определенные штаммы. В патенте Великобритании № 2240979 и европейском патенте № 0406029 (которые полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки) описаны стрессовый белок грибов и антитело к нему, которые могут быть использованы в чувствительном и высокоспецифичном исследовании, применяемом для обнаружения патогенных грибов.

Микозы, вызываемые видами Aspergillus и Candida, традиционно лечат таким противогрибковым средством, как амфотерицин В, который считается золотым эталоном в системном лечении микозов (Burnie, J.P., 1997, см. выше). К сожалению, амфотерицин В является высокотоксичным препаратом, и его применение сопровождается побочными эффектами, такими как озноб, лихорадка, миалгия или тромбофлебит. Другие противогрибковые средства включают пероральные лекарственные средства на основе азола (миконазол, кетоконазол, итраконазол, флуконазол, вориконазол) и 5-фторцитозин. Однако многие виды грибов приобретают устойчивость к таким противогрибковым средствам как флуконазол, поэтому указанные виды можно часто обнаружить у субъектов, принимающих данное лекарственное средство в профилактических целях. Вследствие постоянно возрастающего числа штаммов, устойчивых к противогрибковым средствам, и несмотря на недавние достижения в области создания лекарственных средств, таких как флуконазол, итраконазол и липосомные варианты амфотерицина В, предназначенные для системного введения (Burnie, J.P., 1997, см. выше), по-прежнему существует острая потребность в эффективных средствах лечения микозов.

Вышеуказанная потребность была рассмотрена в публикации WO 01/76627, в которой описана композиция для лечения микозов у человека или животного. Данная композиция содержит антитело, специфичное к консервативному эпитопу стрессового белка грибов, hsp90, в комбинации с известными противогрибковыми средствами на основе полиена, в частности, с амфотерицином В. Указанное антитело (далее именуемое Mycograb (RTM)) распознает эпитоп, представленный пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1, которая является консервативной во многих видах грибов. Весьма удивительным является то, что эффективность амфотерицина В против целого ряда патологически важных штаммов грибов (например, вид Candida) значительно усиливается в присутствии данного антитела, что позволяет уменьшить дозы лекарственного средства или обеспечить более эффективное лечение при введении той же дозы и устранить нежелательные побочные эффекты. Кроме того, композиция, описанная в публикации WO 01/76627, позволяет эффективно лечить микозы, которые по существу являются устойчивыми к противогрибковому средству, используемому в данной композиции.

Важно отметить, что флуконазол (пероральное противогрибковое средство на основе азола) в комбинации с антителом Mycograb (RTM) обладает слабым синергическим действием против штаммов Candida.

Все противогрибковые средства на основе азола характеризуются общим механизмом действия, направленным на предотвращение синтеза эргостерина, основного стеринового компонента плазматических мембран грибов, путем ингибирования цитохром Р450-зависимого фермента грибов, ланостерин-14- -деметилазы. Уменьшение количества эргостерина и сопутствующее накопление 14- -метилированных предшественников препятствуют выполнению основной функции эргостерина в мембранах грибов, в результате чего изменяются текучесть мембраны и активность нескольких мембраносвязанных ферментов. Следствием такого действия является ингибирование роста и репликации грибов (Maertens, J.A., 2004, Clin. Microbiol. Infeсt.10 (Suppl. 1): 1-10).

Так как флуконазол в комбинации с антителом Mycograb (RTM) характеризуется слабым синергическим действием против штаммов Candida, и механизм действия пероральных противогрибковых средств на основе азола является общим, логично предположить, что другие пероральные противогрибковые средства на основе азола, такие как миконазол, кетоконазол, итраконазол и вориконазол, также не обладают синергическим действием в комбинации с антителом Mycograb (RTM).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что несмотря на ранее полученные данные, свидетельствующие о том, что противогрибковые средства на основе азола обладают слабым синергическим действием или вообще не обладают таким действием в комбинации с антителом Mycograb (RTM), описанным в публикации WO 01/76627, при лечении микозов, вызываемых штаммами Aspergillus или Candida, пероральные противогрибковые средства на основе азола, такие как итраконазол и вориконазол, в комбинации с антителом Mycograb (RTM) все же оказывают терапевтическое синергическое действие. Эксперименты (описанные ниже) показали, что указанное синергическое действие обнаружено только для итраконазола и вориконазола, хотя вполне возможно, что другие пероральные противогрибковые средства на основе азола, которые еще не были исследованы или находятся в процессе исследования, могут также оказывать некоторое синергическое действие вместе с антителом Mycograb (RTM).

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол и вориконазол.

Настоящее изобретение далее относится к комбинированному препарату, например, к фармацевтическому изделию, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол и вориконазол, который предназначен для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении микозов.

Настоящее изобретение далее относится к способу получения лекарственного средства для лечения микозов у человека или животного, который отличается использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичных по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus, и по крайней мере одного противогрибкового средства, выбираемого из группы, включающей итраконазол и вориконазол.

Настоящее изобретение далее относится к применению композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол и вориконазол, при осуществлении способа получения лекарственного средства, предназначенного для лечения микозов.

Предварительные результаты также показывают, что позаконазол способен оказывать подобное синергическое действие, поэтому настоящее изобретение относится также к композициям, комбинированным препаратам, способам получения и применению позаконазола и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичных по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть специфичными к эпитопу, представленному пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2.

Антитела, их получение и применение хорошо известны и описаны, например, в нижеследующих публикациях Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999.

Антитела могут быть получены стандартными методами, известными в данной области. Примеры антител включают (не ограничиваясь ими) поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, фрагменты, продуцированные библиотекой экспрессируемых Fab-фрагментов, и антигенсвязывающие фрагменты антител.

Антитела могут быть продуцированы целым рядом хозяев, например козами, кроликами, крысами, мышами, человеком и т.д. Указанные животные могут быть иммунизированы путем инъекции стрессовых белков грибов, любых их фрагментов или олигопептидов, обладающих иммуногенными свойствами. В зависимости от вида хозяина можно использовать разные адъюванты для усиления иммунологической реакции. Такие адъюванты включают, не ограничиваясь ими, адъюванты Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плуроник, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки и динитрофенол. Среди адъювантов, используемых при лечении человека, особенно пригодными являются BCG (Bacille Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum.

Моноклональные антитела к стрессовым белкам грибов, к любому их фрагменту или олигопептиду можно получить любым методом, обеспечивающим продуцирование молекул антител стабильными клеточными линиями в культуре. Указанные методы включают, не ограничиваясь ими, метод на основе гибридомы, метод на основе В-клеточной гибридомы человека и метод на основе EBV-гибридомы (Koehler et al., 1975, Nature, 256: 495-497; Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA, 80: 2026-2030; Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R., Liss Inc., New York, pp. 77-96).

Кроме того, можно использовать методы, разработанные для продуцирования химерных антител , например сплайсинг генов антитела мыши в гены антитела человека с образованием молекулы с соответствующей антигенной специфичностью и биологической активностью (Morrison et al., 1984, PNAS USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454). Альтернативно методы, описанные в литературе для получения одноцепочечных антител, можно адаптировать с помощью методов, известных в данной области, для продуцирования одноцепочечных антител, специфичных к стрессовым белкам грибов. Антитела с родственной специфичностью, но из другой идиотипической композиции, могут быть получены методом перестановки цепи из произвольных комбинаторных библиотек иммуноглобулинов (Burton, D.R., 1991, PNAS USA, 88: 11120-11123).

Антитела могут быть также получены путем индукции продуцирования in vivo в популяции лимфоцитов или в результате скрининга библиотек рекомбинантных иммуноглобулинов или наборов высокоспецифичных связывающих реагентов (Orlandi et al., 1989, PNAS USA, 86: 3833-3837; Winter, G. et al., 1991, Nature, 349: 293-299).

Кроме того, могут быть получены антигенсвязывающие фрагменты, например F(ab')2-фрагменты, которые могут быть продуцированы в результате расщепления пепсином молекулы антитела, и Fab-фрагменты, которые могут быть созданы в результате удаления дисульфидных мостиков в F(ab')2-фрагментах. Альтернативно могут быть созданы библиотеки экспрессируемых Fab-фрагментов для быстрого и легкого идентифицирования моноклональных Fab-фрагментов с требуемой специфичностью (Huse et al., 1989, Science, 256: 1275-1281).

Для идентификации антител, обладающих требуемой специфичностью, можно использовать разные иммуноанализы. В данной области хорошо известны многочисленные методы выполнения конкурентно-связывающих или иммунорадиометрических анализов с использованием поликлональных или моноклональных антител с установленной специфичностью. Такие иммуноанализы обычно включают определение образования комплекса между стрессовым белком грибов, любым его фрагментом или олигопептидом и антителом, специфичным к данному белку. Может быть выполнен двухстадийный иммуноанализ с использованием моноклональных антител, специфичных к двум неинтерферирующим эпитопам стрессового белка грибов, а также конкурентно-связывающий анализ (Maddox et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 1211-1216).

Например, антитело, используемое в композиции или комбинированном препарате, может иметь последовательность SEQ ID NO:3.

Композицию или комбинированный препарат можно использовать при лечении микозов. Микоз может быть вызван организмом рода Aspergillus.

Микоз может быть устойчив к указанному противогрибковому средству, используемому отдельно.

Композицию или комбинированный препарат можно использовать при осуществлении способа лечения микозов у человека или животного.

Композиция или препарат может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Аналогичным образом любой способ получения или применения по настоящему изобретению может также включать использование фармацевтически приемлемого носителя, разбавители или эксципиента. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и эксципиентов хорошо известны в данной области (см., например, публикацию Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia (1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA)).

Настоящее изобретение далее относится к способу лечения микозов у человека или животного, который включает введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, спрецифичных по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus, и по крайней мере одного противогрибкового средства, выбираемого из группы, включающей итраконазол и вориконазол.

Композицию или комбинированный препарат можно вводить перорально.

Настоящее изобретение далее относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичные по крайней мере к одному эпитопу hsp90 в организме рода Aspergillus, и по крайней мере одно противогрибковое средство, выбираемое из группы, включающей итраконазол и вориконазол.

Указанный набор может быть использован для лечения микозов.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть помечены детектируемой меткой или могут быть конъюгированы с эффекторной молекулой, например с лекарственным средством, в частности противогрибковым средством, таким как итраконазол или вориконазол, с токсином, таким как рицин, или с ферментом при помощи обычных методов, и такие меченые антитела или конъюгаты антитела входят в объем настоящего изобретения.

При желании для диагностики или лечения можно использовать смеси антител, например смеси двух или более антител, распознающих разные эпитопы стрессового белка грибов по настоящему изобретению, и/или смеси антител разных классов, например смеси антител IgG и IgM, распознающих одинаковые или разные эпитопы по настоящему изобретению.

Содержание всех публикаций, рассмотренных в настоящем описании изобретения, включая приведенные в них ссылки, полностью включено в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Настоящее изобретение станет более понятным из нижеследующего описания, которое включает только в качестве примера специфические варианты композиции и эксперименты, связанные с ее получением.

Экспериментальная часть

При выполнении нижеописанных экспериментов было исследовано противогрибковое действие антитела Mycograb (RTM), используемого в комбинации с противогрибковыми средствами, такими как амфотерицин В, каспофунгин, вориконазол и итраконазол. Антитело Mycograb (RTM) распознает эпитопы, представленные пептидами, имеющими последовательности SEQ ID NO:1 и 2. Полученные результаты показывают, что вориконазол и итраконазол в комбинации с антителом Mycograb (RTM) оказывают удивительно сильное синергическое действие в отношении целого ряда клинически важных видов Aspergillus. Указанное синергическое действие имеет важное значение для клинического лечения микозов.

Материалы и методы

Противогрибковые средства

Исходные растворы амфотерицина В (АМВ, Sigma), каспофунгина (Caspo), вориконазола (VOR) и итраконазола (ITZ) были получены в соответствии с требованиями Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (М38-А) в бульонной питательной среде RPMI 1640 с глутамином, забуференной до рН 7,0 с помощью 0,165 ммоль/л морфолинопропансульфоновой кислоты (MOPS). Исходные растворы АМВ были получены в результате 100-кратного серийного разведения в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) с последующим разведением в среде до концентрации в пределах от 0,03125 до 16 мкг/мл. Каспофунгин, вориконазол и итраконазол испытывали в концентрации 0,03125-1024 мкг/мл с использованием антитела Mycograb (RTM) (NeuTec Pharma plc) в концентрации 0,25-1024 мкг/мл.

Испытуемые изоляты

Клинические изоляты Aspergillus fumigatus (2), A. flavus (1), A. terreus (1) и A. niger (1) были получены из отделения микробиологии, Manchester Royal Infirmary, Manchester, UK.

Антитело

Последовательность ДНК антитела Mycograb (RTM), специфичную к эпитопу стрессового белка hsp90 грибов, имеющему последовательность SEQ ID NO:1 (описанную в патенте Великобритании № 2240979 и европейском патенте № 0406029), генетически модифицировали путем оптимизации кодона для экспрессии в Escherichia coli (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) и вводили в экспрессирующий вектор E.coli. Аминокислотная последовательность антитела Mycograb (RTM) по настоящему изобретению представляет собой последовательность SEQ ID NO:3 (включает области тяжелой и легкой цепи и спейсерный домен).

Антитело Mycograb (RTM) экспрессировали в клетке-хозяине Escherichia coli и очищали аффинной хроматографией в обменной колонке с имидазолом в соответствии со стандартными методами молекулярной биологии (см., например, публикации Harlow & Lane, supra; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook, J. & Russell, D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Антитело Mycograb (RTM) было выделено с 95% чистотой.

Препараты, содержащие антитело Mycograb (RTM), получали следующим образом: содержимое пробирки, в которой находилось 10 мг чистого антитела Mycograb (RTM), 150 мг мочевины фармацевтической чистоты (Ph Eur) и 174 мг L-аргинина (Ph Eur), восстанавливали в 5 мл воды.

Перекрестная реактивность антитела Mycograb (RTM)

с эпитопом hsp90 Aspergillus

Реакцию антитела на Aspergillus fumigatus у субъектов, страдающих аллергическим бронхолегочным аспергиллезом, аспергилломой и инвазивным аспергиллозом, определяли с помощью иммуноблоттинга. Указанным методом было идентифицировано несколько антигенов с молекулярной массой 18-92 кДа. Один антиген с молекулярной массой 88 кДа был идентифицирован как гомолог hsp90 на основании перекрестного взаимодействия с антителом Mycograb (RTM) (Burnie, J.P., and R.C. Matthews. 1991. J. Clin. Microbiol. 29: 2099-106). Картирование эпитопов показало, что антитело Mycograb (RTM) взаимодействует с эпитопом, представленным пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2, которая является консервативной как в A. fumigatus, так и в A. niger.

Испытание восприимчивости к противогрибковому средству

Минимальные ингибирующие концентрации (MIC) амфотерицина В, каспофунгина, вориконазола, итраконазола и антитела Mycograb (RTM) определяли путем микроразведения в бульонной среде в соответствии с требованиями Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам М38-А. АМВ (0,03125-16 мкг/мл), каспофунгин, вориконазол и итраконазол (0,03125-1024 мкг/мл и антитело Mycograb (RTM) (0,25-1024 мкг/мл) испытывали отдельно и в комбинации путем титрования с использованием конечных значений МIC и титрования в двух направлениях. Суспензию инокулята получали в забуференной среде RPMI с глутамином путем зондирования колоний, культивируемых на планшет со средой Сабуро в течение 7 дней. Суспензию доводили до 0,09-0,11 (пропускание от 80 до 82%) для вида Aspergillus, в частности, 0,15-0,17 (пропускание от 68 до 70%). Инокулят далее разводили в отношении 1:2 при добавлении к противогрибковым средствам, используемым при выполнении данного анализа (конечный инокулят (от 0,4х10⁴ до 0,5х10 ⁴). Для АМВ и антитела Mycograb (RTM), которые использовали отдельно или в комбинации, конечную концентрацию определяли как концентрацию, полностью ингибирующую рост (MIC-0). Титрационные микропланшеты инкубировали для вида Aspergillus без встряхивания при 37°С в течение 48 часов. Для каспофунгина, вориконазола и итраконазола, которые использовали отдельно или в комбинации с антителом Mycograb (RTM), конечное значение MIC определяли как концентрацию, обеспечивающую значительное уменьшение мутности ( 50 ингибирование роста, MIC-2) по сравнению с контролем роста (Keele et al. 2001; Espinel-Ingroff 2003). Конечную ингибирующую концентрацию (FIC) высчитывали для каждого лекарственного средства путем деления значения MIС в присутствии второго лекарственного средства на значение MIC при его отсутствии. Для каждой комбинации были получены две фракции, которые объединяли с образованием конечной ингибирующей концентрации фракций. Синергическое действие соответствовало значению 0,5, инертность соответствовала значению от >0,5 до <4,0 и антагонизм соответствовал значению 4,0 (Matthews et al., 2003).

Результаты

Антитело Mycograb (RTM) помимо распознавания эпитопа, представленного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1, распознает также консервативный эпитоп вида Aspergillus, представленный пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2.

Результаты экспериментов in vitro по исследованию эффекта объединения антитела Myсograb (RTM) с противогрибковыми средствами приведены в таблицах 1-4.

Таблица 1
Метод анализа шахматная доска амфотерицина В и антитела Mycograb (RTM) против вида Aspergillus
Штамм	Средство	MIC-0 (мкг/мл) каждого средства	FIC (мкг/мл)	FICI	Результат
		Отдельно	Комбинация
A.fumigatus	АМВ	2	1	0,5	0,5	Инертный
	Mycograb	512	4	0,01
A.fumigatus	АМВ	2	1	0,5	0,531	Инертный
С12	Mycograb	512	16	0,031
A.niger	АМВ	2	1	0,5	0,5	Инертный
	Mycograb	512	4	0,01
A.flavus	АМВ	4	4	1	2	Инертный
	Mycograb	512	512	1
A.terreus	АМВ	4	4	1	2	Инертный
	Mycograb	512	512	1

Таблица 2
Метод анализа шахматная доска каспофунгина и антитела Mycograb (RTM) против вида Aspergillus
Штамм	Средство	MIC-2 (мкг/мл) каждого средства	FIC (мкг/мл)	FICI	Результат
		Отдельно	Комбинация
A.fumigatus	Каспофунгин	0,125	0,0625	0,5	0,562	Инертный
	Mycograb	1024	32	0,062
A.fumigatus	Каспофунгин	0,125	0,0625	0,5	0,562	Инертный
С12	Mycograb	1024	16	0,062
A.niger	Каспофунгин	1	0,125	0,125	0,125	Синергизм
	Mycograb	256	0,0625	0,0001
A.flavus	Каспофунгин	1	0,5	0,5	0,500	Инертный
	Mycograb	512	0,0625	0,0001
A.terreus	Каспофунгин	0,3125	0,078	0,25	0,312	Синергизм
	Mycograb	1024	32	0,031

Таблица 3
Метод шахматного анализа итраконазола (ITZ) и антитела Mycograb (RTM) против вида Aspergillus
Штамм	Средство	MIC-2 (мкг/мл) каждого средства	FIC (мкг/мл)	FICI	Результат
		Отдельно	Комбинация
A.fumigatus	Итраконазол	0,5	0,0312	0,0625	0,0781	Синергизм
	Mycograb	1024	16	0,016
A.fumigatus	Итраконазол	0,5	0,125	0,25	0,2578	Синергизм
С12	Mycograb	1024	8	0,008
A.niger	Итраконазол	0,125	0,0156	0,125	0,375	Синергизм
	Mycograb	16	4	0,25
A.flavus	Итраконазол	0,125	0,0312	0,25	0,25	Синергизм
	Mycograb	512	0,25	0,0005
A.terreus	Итраконазол	0,125	0,0312	0,25	0,281	Синергизм
	Mycograb	1024	32	0,031

Таблица 4
Метод анализа шахматная доска вориконазола (VOR) и антитела Mycograb (RTM) против вида Aspergillus
Штамм	Средство	MIC-2 (мкг/мл) каждого средства	FIC (мкг/мл)	FICI	Результат
		Отдельно	Комбинация
A.fumigatus	Вориконазол	0,0625	0,0312	0,5	0,5	Синергизм
	Mycograb	1024	0,25	0,0002
A.fumigatus	Вориконазол	0,25	0,125	0,5	0,5	Синергизм
С12	Mycograb	1024	0,25	0,0002
A.niger	Вориконазол	0,125	0,125	1	2	Инертный
	Mycograb	16	16	1
A.flavus	Вориконазол	0,25	0,0625	0,25	0,25	Синергизм
	Mycograb	512	0,25	0,0005
A.terreus	Вориконазол	0,25	0,125	0,5	0,5	Синергизм
	Mycograb	1024	0,25	0,0002

Краткие результаты

Результаты, приведенные в таблицах 1-4, показывают, что хотя антитело Mycograb (RTM) само по себе способно ингибировать рост определенных видов Aspergillus, удивительно высокий уровень противогрибковой активности в отношении всех исследованных видов наблюдался в тех случаях, когда указанное тело было использовано в комбинации с итраконазолом, и удивительно высокий уровень противогрибковой активности в отношении всех исследованных видов, за исключением A.niger, наблюдался в тех случаях, когда антитело было использовано в комбинации с вориконазолом. Такой удивительный эффект совместного действия данного антитела и итраконазола/ вориконазола отсутствовал при использовании других пероральных противогрибковых средств на основе азола, таких как флуконазол, а также при объединении с данным антителом амфотерицина В или каспофунгина.

Заключение

Данные, представленные в настоящем описании изобретения, ясно показывают, что существует удивительный синергизм между антителом Mycograb (RTM) и такими противогрибковыми средствами, как итраконазол и вориконазол, совместное действие которых усиливает противогрибковую активность в отношении целого ряда патологически важных штаммов Aspergillus. Полученные результаты делают возможным применение композиций, содержащих итраконазол и вориконазол вместе с антителом Mycograb (RTM), для лечения микозов у человека или животного. Настоящее изобретение позволяет использовать более низкие дозы лекарственных средств или обеспечивает более эффективное лечение при тех же дозах, уменьшая при этом нежелательные побочные эффекты.

Настоящее изобретение может найти несколько важных клинических применений. Во-первых, применение синергической комбинации, включающей итраконазол/вориконазол и антитело против Mycograb (RTM), при лечении микозов, обусловленных видом Aspergillus, должно стать одним из возможных вариантов лечения. Подобное лечение должно привести к сокращению смертности и заболеваемости указанными микозами. Во-вторых, итраконазол/вориконазол вызывают нежелательные побочные эффекты у субъектов, принимающих данное лекарственное средство. Например, вориконазол очень часто вызывает лихорадку, головную боль, боли в животе, тошноту, рвоту, диарею, периферический отек, кожную сыпь и нарушения зрения. Синергизм, достигаемый настоящим изобретением, означает возможность использования более низкой дозы итраконазола/вориконазола при сохранении эффективности и сопутствующем уменьшении токсичности и вредных побочных эффектов. В-третьих, благодаря ослаблению токсичности вышеуказанных лекарственных средств, обеспечиваемому антителом Mycograb (RTM), можно исследовать клиническую эффективность применения более высоких доз итраконазола/вориконазола и способствовать достижению лучшего клинического результата.