штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая (stephania glabra (roxb) miers) ифр sg 113 - продуцент стефарина и способ его культивирования в биореакторе

Формула изобретения

1. Штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая Stephania glabra (Roxb) Miers BKKK BP № 67 - продуцент стефарина.

2. Способ культивирования штамма по п.1, заключающийся в его культивировании при перемешивании в темноте при температуре (26±1)°С, влажности 70% на модифицированной среде Мурасиге и Скуга, причем культивирование проводят в биореакторе, а перемешивание проводят путем барботажа при возрастающем расходе воздуха с 0,1 по 1,5 л/(л·мин) в течение цикла культивирования.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения стефании гладкой, адаптированной к выращиванию в биореакторе, и предназначено для получения при глубинном культивировании штамма ценных биологически активных соединений, в частности стефарина, и может быть использован в фармацевтической промышленности.

Stephania glabra (Roxb) Miers - растение семейства луносемянниковых. Распространено в субтропических районах Индии, Бирмы, Китая, Вьетнама, Лаоса. Произрастает в районах предгорий и в горах, поднимаясь на высоту до 1800-2000 м над уровнем моря. В местах естественного произрастания в растении содержится до 6% (на сухую массу) алкалоидов. Преобладающие алкалоиды подземной части растения - гиндарин и стефаглабрин, надземной - циклеанин. Гиндарин, стефаглабрин, циклеанин относятся к изохинолиновым алкалоидам. В настоящее время единственным источником получения изохинолиновых алкалоидов в России является культура клеток растения стефании гладкой.

Известен штамм ВСКК-ВР N56 - продуцент стефарина, депонированный во Всероссийской коллекции клеточных культур (Патент РФ № 2089610 от 29.03.94 БИ 10.09.97).

Этот штамм - продуцент стефарина, содержание которого достигало 1,0-2,0% от сухой биомассы,

Однако кроме стефарина в этом штамме показано наличие еще четырех неидентифицированных соединений. Штамм культивировали в системе in vitro в колбах на качалке. Описания его культивирования в биореакторе барботажного типа в научно-технической и патентной литературе нет.

Задача изобретения - получение нового штамма культуры клеток стефании гладкой (Stephania glabra (Roxb) Miers) - продуцента стефарина с достаточным содержанием его в биомассе для выделения стефарина и без примесей других алкалоидов, а также создание нового способа его культивирования в биореакторе барботажного типа.

Эта задача решается тем, что созданы новый штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая, Stephania glabra (Roxb) Miers ИФР Sg 113, - продуцент стефарина - и способ его культивирования.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная. Получен методом клеточной селекции из коллекционного штамма Sg 86mf (Осипова Е.А. Вариабельность роста и синтеза стефарина в клоновых популяциях Stephania glabra: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. 1997. 25 С.)

Причина депонирования - продуцент.

Стандартные условия выращивания - температура 26±1°С, влажность помещения 70%, темнота, жидкая питательная среда. Состав питательной среды (мг/л):

NH4NO3	1700,0±50,0
KNO3	1600,0±50,0
KH2 PO4	234,0±50,0
CaCl2 7·H2O	64,0±30,0
MgSO47·H2O	850,0±50,0
MnSO44·H2O	22,3±1,0
FeSO47·H2O	27,85±1,0
Трилон Б (ЭДТА)	37,85±1,0
ZnSO4 2·H2O	8,6±1,0
Н3ВО3	6,2±1,0
KJ	0,83±0,1
Na2 MoO4 2·H2O	0,25±0,1
CuSO4 5·H2O	0,025±0,01
CoCl2 6·H2O	0,025±0,01
Ca-пантотенат	2,0±0,5
Тиамин	2,0±0,5
2,4-дихлорфенокси-
уксусная кислота (2,4-Д)	0,1±0,05
-нафтилуксусная кислота (НУК)	0,5±0,2
Сахар (рафинад)	50000,0±5000,0

Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях выращивания. Клетки преимущественно округлые, реже вытянутые, суспензия агрегирована.

Культуральные признаки. Биомасса гомогенная, белой или бело-розовой окраски, культуральная жидкость белого или светло-розового цвета.

Способ проверки жизнеспособности штамма. Окрашиванием мертвых клеток 0,5% водным раствором красителя синим Эванса.

Название целевого продукта. Алкалоид стефарин изохинолиновой группы, производное проапорфина. Содержание в ткани при использовании денситометрического метода 0,1-0,5% от сухой массы клеток. Отсутствие алкалоидов гиндарина, циклеанина, пронуциферина.

Физиологические признаки. Нарастание биомассы за цикл выращивания к 14 суткам в 6-8 раз. Жизнеспособность на протяжении цикла субкультивирования сохраняется на уровне 80-90%. Удельная скорость роста в экспоненциальной фазе роста составляет 0,08-0,14 /сут, время удвоения клеток в популяции на 5-8 сутки. Продуктивность клеток по сухой биомассе 0,4-0,9 г/л·сут.

Новизна изобретения заключается в том, что был получен новый штамм ИФР Sg 113, который способен к стабильному биосинтезу стефарина при отсутствии других алкалоидов, в том числе гиндарина, циклеанина и пронуциферина. Кроме того, создан новый способ его культивирования в биореакторе барботажного типа за счет того, что перемешивание проводят путем барботажа при возрастающем расходе воздуха с 0,1 л/л·мин по 1,5 л/л·мин в течение цикла культивирования.

Сущность настоящего изобретения, заключается в том, что получен такой штамм, синтезирующий только стефарин, и в нем отсутствует другие алкалоиды, а именно гиндарин, циклеанин, пронуциферин. Это свойство сохраняется при культивировании в биореакторе барботажного типа.

Изобретение иллюстрируется следующим примером,

Пример. Штамм ИФР Sg 113 получают методом клеточной селекции. Суспензию штамма Sg 86mf смешивают с 1,0%-ным агаром в отношении 1:1 и высевают на чашки Петри с конечной плотностью 3·10 ⁴ кл/мл. Через 4-6 недель получают колонии, различающиеся по морфофизиологическим признакам. После экстракции из клеток колоний алкалоидов раствором серной кислоты и разделения их на хроматографической пластинке в системе растворителей проводят скрининг относительно стандарта. Отбирают колонии с содержанием стефарина более 0,5% на сухую биомассу. Эти колонии переносят в колбы с жидкой средой. После трех, а затем после девяти пассажей оставляют колонии со стабильным биосинтезом стефарина на уровне не менее 0,1%. Выделенный штамм переносят для культивирования в биореактор.

Полученный штамм культивируют в биореакторе барботажного типа общим объемом 20 л и рабочим объемом 15 л при возрастающем расходе воздуха от 0,1 л/л·мин по 1,5 л/л·мин в течение цикла культивирования, что обеспечивает концентрацию растворенного кислорода в пределах 20-70% от насыщения. Полученный штамм культивируют при температуре 26±1°С, в темноте, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга. Состав среды приведен выше. Продолжительность цикла культивирования 14 суток, максимальный выход стефарина на 12-14 сутки.

В результате изобретения получен штамм ИФР Sg 113 со стабильным уровнем содержания стефарина 0,1-0,5% от сухой массы ткани и отсутствием других алкалоидов, в том числе гиндарина, циклеанина, пронуциферина, что является более технологичным для дальнейших операций по выделению стефарина из биомассы. В результате изобретения разработан новый способ культивирования штамма в биореакторе барботажного типа. За цикл культивирования в биореакторе при максимальном содержании стефарина 0,5% от сухой массы клеток получают до 210 г сухой биомассы, то есть до 1005 мг стефарина при отсутствии других алкалоидов, что является достаточным для последующих стадий.