штамм бактерии paracoccus carotinifaciens 3k - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы pcsi.
Классы МПК: | C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала C12N9/14 гидролазы (3) |
Автор(ы): | Чернухин Валерий Алексеевич (RU), Наякшина Татьяна Николаевна (RU), Тарасова Галина Владимировна (RU), Голикова Лариса Николаевна (RU), Акишев Александр Григорьевич (RU), Дедков Владимир Сергеевич (RU), Михненкова Наталья Александровна (RU), Дегтярев Сергей Харитонович (RU) |
Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2008-06-18 публикация патента:
27.12.2009 |
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания. Из почвы выделен штамм Paracoccus carotinifaciens 3К, обеспечивающий получение сайт-специфической эндонуклеазы, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, содержащей четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-WCGNNNNNNNCGW-3', с образованием однонуклеотидных 3'-выступающих концов. Изобретение позволяет получить новую сайт-специфическую эндонуклеазу PcsI, которая может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК. 2 ил.
Формула изобретения
Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K, депонированный в ККМ НПО «СибЭнзим» под номером 6М74, продуцент сайт-специфической эндонуклеазы PcsI.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, используемого для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК W(m5C) G NNNN^ NNN(m5C) GW, где W - любой из нуклеотидов А или Т, m5C - 5-метилцитозин.
Эндонуклеаза, обладающая данной специфичностью, может быть использована для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.
К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.
Известен штамм Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5'-G(m5C) GC-3', где m5C - С5-метилцитозин [1].
Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2], Bacillus subtilis 230 [3] и Glacial ice bacterium [4], продуцирующие сайт-специфическую эндонуклеазу BlsI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5'-GCNGC-3', при наличии в сайте узнавания С5-метилцитозиновых оснований.
Однако в настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющихся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих метилированную или неметилированную последовательность ДНК 5'-WCG NNNNNNNCGW-3'.
Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, содержащей четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-WCGNNNNNNNCGW-3', с образованием однонуклеотидных 3'-выступающих концов.
Поставленная техническая задача достигается получением штамма Paracoccus carotinifaciens 3К - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей метилированную последовательность нуклеотидов:
5'-W(m5C) G NNN N NNN(m5C) G W-3'
3'-W G(m5C)NNN NNNN G (m5C) W-5',
где m5C - С5-метилцитозин (стрелками указаны позиции расщепления ДНК).
Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.
Полученный штамм Paracoccus carotinifaciens 3К депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО "СибЭнзим" под регистрационным номером 6М74, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа PcsI.
Штамм Paracoccus carotinifaciens 3К характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует оранжево-красные, гладкие, блестящие, полупрозрачные, выпуклые, круглые колонии 1-2 мм в диаметре. В жидкой питательной среде со встряхиванием образует гомогенную муть. Клетки палочковидные, размером 0,3-0,7 мкм в диаметре и 1-4 мкм в длину. Спор не образуют. Грамотрицательные.
Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположитльные. Растут при температуре от 4 до 33°С, при pH от 6 до 9.
Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [5], а также с помощью анализа первичной последовательности фрагмента 16S РНК по программе BLAST [6] как вид бактерии Paracoccus carotinifaciens. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза PcsI названа по номенклатуре [7].
Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.
Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.
Выход целевого фермента составляет 30 ед./г сырой биомассы с концентрацией 300 ед./мл.
Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза PcsI характеризуется следующими с свойствами:
1. Узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов W(m5C) G NNNN ^NNN(m5C) GW, где W - любой из нуклеотидов А или Т, m5C - 5-метилцитозин.
2. Расщепляет связи после центрального нуклеотида в обеих цепях узнаваемой последовательности.
3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, содержащую меньше четырех С5-метилцитозиновых оснований.
4. Оптимальная температура действия 37°С.
5. Оптимальное значение pH для действия фермента 7,5-8,5.
6. Оптимальная концентрация соли при расщеплении ДНК 100-150 мМ NaCl.
7. Для проявления активности PcsI требуются ионы Mg2+, оптимальная концентрация - 5-10 мМ.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз является то, что первый продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-W(m5C)GNNNN^NNN(m5C)GW-3', при условии метилирования в узнаваемой последовательности всех четырех цитозинов. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза PcsI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Выращивание штамма и выделение фермента.
Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С. Выход биомассы составляет 5 г/л среды. Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [8].
Пример 2.
Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой PcsI.
Расщепление ДНК проводят в оптимальных условиях (37°С, реакционный буфер - 10 мМ TrisHCl, pH 8.0, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяют путем электрофореза в 1% агарозном геле.
В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления используют различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда и Т7, pHspAI (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GC-3' [1]), и pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)NGC-3'/5'-G(5mC)NGC-3' [4]) и предварительно полученной плазмиды pMHgaI (содержит метилированные последовательности 5'-GA(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GTC-3').
Плазмида pMHgaI была получена путем встраивания в плазмиду pUC19 ПЦР-фрагмента (2283 п.н.) геномной ДНК Haemophilus gallinarum по сайтам гидролиза эндонуклеазами рестрикции HindIII и SalI. Данный ПЦР-фрагмент был получен с использованием следующих праймеров (Р1 и Р2):
P1: 5'-CATTAAGCTTGACGCTCGAGGCGTCTGTATGTAATTAGATTTAATCATTAATTTCATGAT-3'
P2: 5'-CCTAAAGTCGACACAAAGCAACTTCAATTAATAGCTGAAT-3'
Полученный в результате полимеразной цепной реакции фрагмент ДНК содержит два гена ДНК-метилтрансфераз: Ml.HgaI и M2.HgaI [9]. Фермент M1.HgaI метилирует первый цитозин в положении С5 в нуклеотидной последовательности 5'-GCGTC-3'; M2.HgaI метилирует первый цитозин в положении С5 в нуклеотидной последовательности 5'-GACGC-3' [9]. Данная плазмида была клонирована в клетках E.coli штамма ER2267. Таким образом, плазмида pMHgaI содержит метилированные последовательности 5'-GA(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GTC-3'.
Метилирование этой последовательности в плазмиде pMHgaI приводит к образованию единственного сайта узнавания для эндонуклеазы PcsI, расположенного в позиции 2692. Первичная структура фрагмента ДНК, содержащего сайт узнавания PcsI приведена ниже:
Стрелкой указана позиция 2692.
На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов и Т7, а также плазмид pMHgaI, pHspAI и pFsp4HI3 эндонуклеазой PcsI.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:
1 - ДНК фага лямбда;
2 - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазой PcsI;
3 - ДНК фага Т7;
4 - ДНК фага Т7, обработанная эндонуклеазой PcsI;
5 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим).
6 - ДНК pMHgaI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;
7 - ДНК pMHgaI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой PcsI;
8 - ДНК pHspAI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;
9 - ДНК pHspAI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции Dril, обработанная эндонуклеазой PcsI;
10 - ДНК pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;
11 - ДНК pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой PcsI.
Как видно из фиг.1, эндонуклеаза PcsI не расщепляет ДНК фагов лямбда и Т7, а также ДНК плазмид pHspAI и pFsp4HI3, в которых отсутствует метилированная последовательность 5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'.
ДНК плазмиды pMHgaI длиной 4969 п.н., линеаризованной рестриктазой DriI, данный фермент расщепляет в единственном месте. Электрофоретическая подвижность образуемых в результате данного расщепления фрагментов ДНК соответствует теоретически рассчитанным для гидролиза по последовательности 5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3': 1260 п.н. и 3709 п.н.
Пример 3.
Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой PcsI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазами рестрикции PcsI и BstKTI олигонуклеотидного дуплекса 13/14, образованного из олигонуклеотидов 13 и 14, имеющих следующую первичную структуру олигонуклеотидов:
13: 5' gcgggatat(5mc)gagatctc(5mc)gtcgctac(5mc)gccagtca 3'
14: 5' tgactgg(5mc)gctagcga(5mc)gGagatcT(5mc)gatatcccgc 3'
В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII.
На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления дезоксирибоолигонуклеотидного радиоактивно меченного дуплекса 13/14 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:
1 - исходный дуплекс 13*/14;
2 - дуплекс 13*/14, обработанный эндонуклеазой рестрикции BstKTI;
3 - дуплекс 13*/14, обработанный экзонуклеазой III из E.coli;
4 - дуплекс 13*/14, обработанный эндонуклеазой рестрикции PcsI;
5 - исходный дуплекс 13/14*;
6 - дуплекс 13/14*, обработанный эндонуклеазой рестрикции BstKTI;
7 - дуплекс 13/14*, обработанный экзонуклеазой III из E.coli;
8 - дуплекс 13/14*, обработанный эндонуклеазой рестрикции PcsI;
Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором 32Р по 5'-концу, обозначены знаком *.
Из фиг.2 видно, что продукты гидролиза ДНК дуплекса 13*/14 на дорожках 2 и 4 имеют одинаковые длины. Это означает, что на меченом олигонуклеотиде 13 позиции гидролиза ферментами BstKTI и PcsI совпадают.
В то же время на дорожках 6 и 8 фиг.3 видно, что фрагмент ДНК, который образуется при гидролизе 13/14* рестиктазой BstKTI, на один нуклеотид длиннее, по сравнению с фрагментом ДНК, образованным при гидролизе этого же дуплекса эндонуклеазой PcsI.
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в вырожденной палиндромной последовательности эндонуклеаза PcsI расщепляет ДНК после четвертого нуклеотида N: 5'-W(5mC)GNNNN NNN(5mC)GW-3'.
Выход сайт-специфической эндонуклеазы PcsI определяют по электрофоретической картине расщепления ДНК плазмиды pMHgaI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК данной плазмиды в течение 1 часа при температуре 37°С в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 60 ед./г сырой биомассы, концентрация 300 ед./мл.
Фермент хранят при - 20°С в буфере, содержащем 50% глицерин, 0,08% тритон Х100, 0,2 М NaCl, 10 мМ трисНС1 (зР 7,5), 7 мМ -меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА.
Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу PcsI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, которая содержит четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-WCGNNNNNNNCG-3', с образованием однонуклеотидного 3'-выступающего конца. Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-GCGC-3'. - Биотехнология. - 2006. - № 4. - С.31-35.
2. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК 5'-G(5mC)NGC-3' и расщепляет ее с образованием 3'-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - № 1. - С.28-33.
3. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis Т30 узнает метилированную последовательность ДНК 5'G(m5C)^NGC-3' // Биотехнология. - 2005. - № 3. - С.22-26.
4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфичесчкая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN(5mC)G-5' // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - № 2. - С.13-17.
5. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина. - М., 1997.
6. Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. Applications of network BLAST server. - 1996. - Meth. Enzymol. V.266 - P.131-141.
7. Smith, H.O., Nathans, D. // J. Mol. Biol. - 1973. - V.81. - P.419-423.
8. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.
9. Sugisaki, H., Yamamoto, K., Takanami M. The HgaI restriction-modification system contains two cytosine methylase genes responsible for modification of different DNA strands. // 1991. - J. Biol. Chem. - V.266 - P.13952-13957.
Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала