пористые композиционные материалы на основе хитозана для заполнения костных дефектов

Формула изобретения

Пористый композиционный материал на основе хитозана для заполнения костных дефектов, содержащий хитозан, трикальцийфосфат, отличающийся тем, что содержит хитозан с молекулярной массой более 300000 г/моль, добавку карбонат аммония, а в качестве кальцийфосфатных наполнителей используют вещества в виде порошка или гранул с размером частиц 1-1000 мкм, выбранные из группы: брушит, монетит, тетракальцийфосфат, гидроксиапатит, карбонатгидроксиапатит, или их смеси при следующем соотношении компонентов, мас.%:

хитозан	5-60
наполнители	2-90
карбонат аммония	5-60

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно для пластической реконструкции поврежденных костных тканей.

Хитозан является биосовместимым и биодегадируемым натуральным полимером, что позволяет его использовать в различных областях медицины, в том числе для быстрого заживления ран, различной этимологии (Хитин и Хитозан. Получение, свойства и применение. /Под ред. академика РАСХН К.Г. Скрябина. Наука. 2002. 365 стр.). Особенно широкое применение получили хитозановые материалы в виде пластичных пористых губок. За счет пластичности и пористости данные материалы легко деформируются до требуемого размера (костного дефекта) и после помещения их в сжатом состоянии в костный дефект распрямляются (за счет обратной деформации), заполняя объем дефекта. По своей природе хитозан является полисахаридом питательным веществом, способствующим формированию костной ткани. Однако чистые хитозановые губки не содержат такие важные для формирования костной ткани элементы как фосфор и кальций. Поэтому при резорбции чистых губок в костном дефекте формируются в основном хрящевые ткани (хондроидные).

Создать благоприятные условия для формирования естественной костной ткани возможно при использовании композиционных материалов на основе хитозановых губок, содержащих кальцийфосфатные наполнители.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемому эффекту является композиционные губки на основе хитозана (КХГ), содержащего трикальцийфосфат (Yong-Moo Lee, Yoon Jeong Park et al. Tessie Engineered Boon Formation Used Chitosan/Tricalcium Phosphate Sponges // J. Periodontol, vol.71, № 3, 2000). Композиционные губки получали при смешении порошка трикальцийфосфата с раствором хитозана. Затем из раствора удаляли избыток воды методом сушки - вымораживания. При замораживании из исходного раствора в виде частиц льда кристаллизуется водный раствор, который затем удаляют при сушке в вакууме. В результате на месте удаленного льда образуются поры размером около 100 мкм. Недостаток полученного КХГ является использование специального оборудования (лиофильной сушки), а также использование для полимеризации (сшивания) губок экологически вредного раствора триполифосфата.

Технический результат предлагаемого изобретения - получение пористых композиционных губок на основе хитозана и кальцийфосфатного наполнителя, образующихся при физиологических температурах, не содержащих вредных веществ.

Технический результат достигается тем, что пористый композиционный материал на основе хитозана для заполнения костных дефектов, содержащий хитозан, трикальцийфосфат, согласно изобретению содержит хитозан с молекулярной массой более 300000 г/моль, добавку карбонат аммония, а в качестве кальцийфосфатных наполнителей используют вещества в виде порошка или гранул с размером 1-1000 мкм, выбранные из группы: брушит, монетит, тетракальцийфосфат, гидроксиапатит, карбонатгидроксиапатит или их смеси, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

хитозан	5-60
наполнители	2-90
карбонат аммония	5-60

Указанный состав КХГ неизвестен. Для получения КХГ в растворе этановой кислоты растворяют высокомолекулярный хитозан при рН от 6 до 6,5. После полного растворения хитозана при перемешивании добавляют кальцийфосфатные наполнители в количестве до 90 мас.%. и порошок добавки карбоната аммония до 60 мас.%.

В результате взаимодействия кислоты, содержавшейся в исходном растворе, и карбоната аммония происходит вспенивание за счет выделения углекислого газа и формирование пористой губчатой структуры с одновременным твердением образующейся губки. Полученную губку затем отмывают от избытка воды и остатков кислоты в этаноле и сушат. В результате получают композиционную губку с пористостью от 50 до 98% в зависимости от состава. При содержании кальциевого наполнителя больше 90 мас.% губки становятся хрупкими и легко разрушаются при деформации. При увеличении массового содержания добавки более 60 мас.% в губке образуются многочисленные крупные поры с размером более 2 мм, в результате структура становится рыхлой и хрупкой, что приводит к разрушению губок при деформации. При снижении количества карбоната аммония менее 5 мас.% не происходит твердения губок при их вспенивании. Снижение наполнителя менее 2 мас.% не позволяет получать губки с равномерным распределением компонентов по объему.

Пример 1. Порошок высокомолекулярного хитозана (молекулярная масса 450000-500000 г/моль) в количестве 1 г (33,3 мас.%) растворили в растворе этановой кислоты. Затем при перемешивании добавили 1 г (33,3 мас.%) гранул гидроксиапатита (наполнителя) с размером гранул 100-300 мкм и 1 г (33,3 мас.%) порошка карбоната аммония. Полученную губку промывают этанолом и сушат на воздухе до удаления этанола. В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 85%.

Пример 2. Получение образцов аналогично примеру 1. Отличие - использование хитозана с молекулярной массой 300000-350000 г/моль в количестве 0,5 г (5 мас.%) и наполнителя - порошка трикальциевого фосфата с размером частиц 1-5 мкм в количестве 9 г (90 мас.%) и добавки карбоната аммония в количестве 0,5 г (5 мас.%). В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 50%.

Пример 3. Получение образцов аналогично примеру 1. Отличие - использование хитозана с молекулярной массой более 500000 г/моль в количестве 2 г (20 мас.%) и наполнителя порошка карбонатгидроксиапатита с размером частиц 1-5 мкм в количестве 1 г (10 мас.%) и порошка брушита с размером частиц 5-6 мкм в количестве 1 г (10 мас.%) и добавки карбоната аммония в количестве 6 г (60 мас.%). В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 95%.

Пример 4. Получение образцов аналогично примеру 1. Отличие - использование хитозана с молекулярной массой 400000-500000 г/моль в количестве 6,0 г (60 мас.%) и наполнителя порошка карбонатгидроксиапатита с размером частиц 15-30 нм в количестве 1 г и тетракальцийфосфатных гранул с размером 100-200 мкм в количестве 0,5 г (5 мас.%) и трикальцийфосфатных гранул с размером 200-500 мкм в количестве 0,5 г (5 мас.%) и добавки карбоната аммония в количестве 3,0 г (30 мас.%). В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 70%.

Пример 5. Порошок высокомолекулярного хитозана (молекулярная масса 450000 500000 г/моль) в количестве 1 г (33 мас.%) растворили в растворе этановой кислоты. Затем при перемешивании добавили смесь 0,5 г (16,5 мас.%) монетита и 0,5 г (16,5 мас.%) брушита с размером 10-15 мкм и 1 г (33 мас.%) порошка карбоната аммония. Полученную губку промывают этанолом и сушат на воздухе до удаления этанола. В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 80%.

Примера 6. Получение образцов аналогично примеру 1. Отличие - использование хитозана с молекулярной массой 300000-350000 г/моль в количестве 0,5 г (5 мас.%) и смесь наполнителя - гранул трикальциевого фосфата 6 г (60 мас.%) с размером 500-700 мкм и карбонатгидроксиапатит 3 г (30 мас.%) с размером 800-1000 мкм и добавки карбоната аммония в количестве 0,5 г (5 мас.%). В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 70%,

Пример 7. Получение образцов аналогично примеру 1. Отличие - использование хитозана с молекулярной массой более 500000 г/моль в количестве 3,0 г (30 мас.%) и наполнителя порошка тетракальцийфосфата с размером частиц 50-60 мкм в количестве 0,5 г (5 мас.%) и порошка гидроксиапатита с размером частиц 1-2 мкм в количестве 0,5 г (5 мас.%) и добавки карбоната аммония в количестве 6 г (60 мас.%). В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 92%.

Пример 8. Получение образцов аналогично примеру 1. Отличие - использование хитозана с молекулярной массой 400000-500000 г/моль в количестве 5,0 г (50 мас.%) и наполнителя порошка карбонатгидроксиапатита с рамером частиц 15-30 нм в количестве 1,5 г (15 мас.%) и карбонатгидроксиапатит гранулы с размером 300-500 мкм в количестве 1,5 г (15 мас.%) и добавки карбоната аммония в количестве 2,0 г (20 мас.%). В результате получили пластичную композиционную губку с пористостью 70%.

В соответствии с примерами также были изготовлены образцы керамики, имеющие составы в заявленных пределах, и определены их свойства в сравнении с прототипом. Полученные результаты сведены в таблицу 1.

На данных композиционных материалах проведена оценка токсичности и биоактивности.

Пример 9. Исследование in vitro цитотоксичности образцов пористого композиционного материала, полученного при использовании: высокомолекулярного хитозана - 60 мас.%, порошка гидроксиапатита (ГА) - 20 мас.% и добавки карбоната аммония 20 мас.% или хитозана - 20 мас.%, карбонатгидроксиапатита КГА - 20 мас.% и добавки карбоната аммония 60 мас.% (МТТ-тест, модель-культура иммортализованных фибробластов человека).

Перед началом эксперимента все материалы стерилизовали облучением (20 КГр). Накануне эксперимента стерильные образцы раскладывали в 96-луночные платы (в триплетах каждый), заливали полной ростовой средой (ПРС) и оставляли на ночь в СO ₂-термостате. В день опыта перед внесением клеток из каждой лунки декантировали весь свободный объем ПРС, добавляли по 100 мкл свежей порции ПРС, и на последнем этапе - суспензию клеток в концентрации 70000 клеток/мл в объеме 100 мкл. Платы помещали на 24 часа в СO₂ инкубатор (37°С, 5% СО₂ ). Все остальные манипуляции с клетками, постановку МТТ-теста и обсчет результатов осуществляли по общепринятым методикам. Через 24 часа культивирования определяли острую цитотоксичность материалов, вычисляя величину пула жизнеспособных клеток (ПЖК) в процентах в каждый конкретный срок как отношение показателя оптической плотности (OD) раствора формазана в опыте к показателю оптической плотности раствора формазана в контроле. Образец считали нетоксичным при величине показателя ПЖК>70%.

Показано, что образцы высокопористых материалов на основе хитозана, содержащие порошки ГА или КГА, не токсичны для клеток, величина ПЖК данных образцов составляла 91,8-106,4% (табл.2).

Таблица 2 Величина оптической плотности раствора формазана (усл.ед.) и пула жизнеспособных фибробластов человека (%) при культивировании их на полистирене (контроль) и пористых композиционных материалах с порошками ГА или КГА (опыт), (МТТ тест, 24 часа инкубации)
Образцы/Параметры	Полистирен (контроль)	В.м. хитозан+порошок ГА, размером 1-100 мкм	В.м. хитозан+порошок КГА, размером 200-500 мкм
ОП раствора формазана (усл. ед.)	0,668±0,008	0,613±0,014	0,711±0,019
Величина ПЖК (%)	100,0	91,8	106,4

Пример 10 отличается от предыдущего тем, что использовались гранулы при следующем соотношении: высокомолекулярный хитозан 30 мас.%, гранулы ГА - 10 мас.% и добавки карбонат аммония - 60 мас.% или высокомолекулярный хитозан 5 мас.%, гранулы КГА - 50 мас.% и добавки карбонат аммония - 45 мас.% (МТТ-тест, модель-культура иммортализованных фибробластов человека).

Оценена острая цитотоксичность образцов пористого композиционного материала на основе хитозана с гранулами ГА или КГА. Пробоподготовку образцов, постановку МТТ-теста и расчет величины ПЖК осуществляли, как в примере 9. Обнаружено, данные образцы также не токсичны в отношении культуры фибробластов:

величина ПЖК через 24 часа совместной инкубации составляла 72-97% от контроля (табл.3).

Таблица 3 Величина оптической плотности раствора формазана (усл.ед.) и пула жизнеспособных фибробластов человека (%) при культивировании их на полистирене (контроль) и пористых композиционных материалах с гранулами ГА и КГА (опыт), (МТТ тест, 24 часа)
Образцы/Параметры	Полистирен (контроль)	В.м. хитозан+гранулы ГА размером 50-300 мкм	В.м. хитозан+гранулы КГА размером 500-1000 мкм
ОП раствора формазана (усл.ед.)	0,668±0,008	0,590±0,018	0,482±0,055
Величина ПЖК (%)	100,0	88,3	72,0

В целом, представленные материалы, как и образцы из примера 9, способствуют эффективной адгезии и распластыванию фибробластов в сроки, сравнимые с контролем.

Пример 11. Медико-биологическая оценка пористой композиционной губки на основе высокомолекулярного хитозана - 33,3 мас.%, и гранул карбонатгидроксиапатита - 33,3 мас.% с размером 200-500 мкм и добавки карбоната аммония в количестве 33 мас.%.

Биосовместимость данного биокомпозита была оценена через 2, 4 и 8 недель после подкожной трансплантации мышам линии BDF₁ (стерилизация -облучением 25 кГр). Показано, что уже на ранних сроках после операции в переимплантационной зоне образуется тонкая соединительнотканная капсула, внутри которой слабо визуализируется хитозановая составляющая. Через 2 недели после подкожной трансплантации вокруг гранул рыхлой структуры образуются ободки внеклеточного вещества кости. Сами гранулы КГА представлены в этот срок наблюдения хаотически расположенными цилиндрическими/палочковидными структурами (чертеж.1,а, окраска гематоксилин-эозином, увел.х100).

В следующий срок (4 недели) показано нарастание в.неклеточного матрикса костной ткани вокруг гранул. При этом структура гранул становится разреженной, в периферической части имплантата в пространствах между гранулами, кроме межклеточного вещества костной ткани, начинает формироваться соединительная ткань, в которой локализуются остеокласты (чертеж.1,б). К 8 неделям количество межклеточного вещества кости нарастает, особенно вокруг запустевающих гранул. В полях зрения встречаются остеокласты и малоклеточная соединительная ткань (чертеж.1,в).

Таким образом, данные пористые композиционные материалы на основе хитозана, содержащего наполнитель - гранулы КГА, обладают, с одной стороны, биосовместимостью, поскольку ни в одном из препаратов не было обнаружено признаков воспалительной реакции и, с другой стороны - проявляют истинно остеокондуктивные потенции, т.к. способствуют эктопическому формированию новой костной ткани. По результатам данного исследования данные биоматериалы представляются весьма перспективными в качестве имплантатов (самостоятельно) или остеозамещающих 3D материалов-матриксов для инженерии костных дефектов.