штамм bifidobacterium longum ov-20, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств

Формула изобретения

Штамм Bifidobacterium longum OV-20 коллекционный номер № 214, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и других лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и устранять дисбиотические нарушения.

Вместе с тем рационализация подхода к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должна основываться на закономерностях, связанных с процессами стабилизации нормобиоценоза, в особенности учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательная смена микробиоценозов в процессе онтогенеза, в результате которой происходит вытеснение одних видов микроорганизмов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в данных условиях. При этом образуется сукцессионный ряд - серия с конечным формированием относительно стабильного сообщества. Данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, которая совпадает с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте; в то же время у взрослых людей состав бифидофлоры относительно стабилен [8].

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп; вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].

Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8, 9].

Виды В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum характерны для микробиоценоза детей младшего возраста. Вместе с тем уже на новом методическом уровне подтверждены данные о том, что виды В. bifidum и В. longum остаются доминантными представителями бифидофлоры человека во все возрастные периоды жизни. Это означает, что оптимальная формула пробиотического средства должна включать как «подвижную», меняющуюся в процессе онтогенеза часть, которая комплементарна микробиоценозу определенной возрастной категории людей, так и «консервативную», состоящую из видов, стабильно сохраняющихся в процессе онтогенеза. В связи с этим селекция перспективных штаммов бифидобактерий, относящихся к видам В. bifidum и В. longum как универсальных и наиболее распространенных, представляет особый интерес при создании средств коррекции микрофлоры.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. longum OV-20 с высокой биологической активностью, устойчивостью к внешним воздействиям и средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.

Штамм В. longum OV-20 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под № 214.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. longum OV-20 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. longum OV-20, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. longum OV-20 в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, к кислой среде, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации штаммов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства

Клетки штамма В. longum OV-20 представляют собой грам+ полиморфные, бесспоровые неподвижные веретеноподобные палочки с утолщением в середине клетки, расположенные попарно или до 4-6 клеток в цепочке.

В полужидких питательных средах растет по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии через 16-24 часа роста имеют форму тонких комет длиной до 7 мм.

Физиолого-биохимические свойства

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания - 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+ молочной кислоты без образования газа. Ферментирует лактозу, фруктозу, галактозу, раффинозу, сорбитол, вариабельно: арабинозу и ксилозу, не ферментирует: глюкозу, мальтозу, мелецитозу, сахарозу, салицин, трегалозу, маннитол, рамнозу, эскулин, маннозу, целобиозу.

Генотипирование штамма В. longum OV-20 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272014 и EU 272018.

Культуральные свойства

Штамм активно накапливает биомассу на различных производственных средах до высоких показателей значений КОЕ/мл бифидобактерий, закисляя среду до pH 3,9-4,1 (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1
Показатели числа КОЕ/мл бифидобактерий и активности кислотообразования после культивирования штамма В. longum OV-20 на различных питательных средах
Питательная среда	КОЕ/мл	0 T
Среда для культивирования бифидобактерий (БС)	2,0×109	135
МРС	2,6×109	195
Гидролизатно-молочная среда	1,0×10 9	201
Печеночная среда	3,8×109	198
Молоко восстановленное обезжиренное	5,0×10 8	120

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. longum OV-20 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми преимущественно связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко сквашивает с образованием равномерного сгустка с приятным кисломолочным вкусом и запахом. При культивировании в молоке значение кислотности составляет 120⁰Т.

Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот - продуктов метаболизма - в процессе культивирования, представлены в таблице 2.

Таблица 2
Динамика культивирования штамма В. longum OV-20 в молоке и среде для выделения и культивирования бифидобактерий в стационарных условиях.
Время выращивания после посева, (ч)	Выращивание на молоке	Выращивание на БС среде
°T	КОЕ/мл	°т	КОЕ/мл
0	18	1,0×107	34	1,1×10 7
24	83	5,0×108	114	2,0×10 9
36	86	5,0×108	116	2,0×10 9
48	90	4,5×108	120	1,7×10 9
72	120	4,5×108	135	1,5×10 9

Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.

Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. longum OV-20 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных и лабораторных средах с высокими показателями значения КОЕ/мл.

Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных микроорганизмов.

Таблица 3
	Антагонистическая активность штамма В. longum OV-20
№	Штамм тестируемого микроорганизма	Зона задержки роста в присутствии штамма В. longum OV-20, мм
1	Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р	26±3
2	Shigella flexneri 337	32±5
3	Shigella sonnei 177	30±3
4	Proteus vulgaris 1274	32±2
5	Escherichia coli 157	28±3

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. longum OV-20 на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. longum OV-20 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.

Чувствительность к антибиотикам штамма В. longum OV-20 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4
Антибиотикочувствительность штамма В. longum OV-20
№	Название антибиотика	Интерпритация зон	Содержание препарата в диске, мкг	Диаметр зоны ингибирования роста в мм
Устойчив	Промежуточно устойчив	Чувствителен
1	Бензилпенициллин	19	20-27	28	10	30±2
2	Оксациллин	10	11-13	14	10	12±0
3	Ампициллин	10	11-14	16	10	24±2
4	Карбенициллин	14	15-18	19	25	40±0
5	Азлоциллин	13	14-16	16	75	40±0
6	Цефалотин	14	15-18	19	30	36±2
7	Цефалексин	14	15-18	19	30	28±2
8	Цефазолин	14	15-18	19	30	30±0
9	Цефтазидим	14	15-17	18	30	30±0
10	Цефотаксим	14	15-20	21	30	38±3
11	Имипенем	13	14-15	16	10	35±2
12	Стрептомицин	16	17-19	20	30	0±0
13	Неомицин	12	13-16	17	30	10±0
14	Канамицин	14	15-18	19	30	15±3
15	Гентамицин	12	13-14	15	10	15±0
16	Амикацин	14	15-16	17	30	0±0
17	Тетрациклин	16	17-21	22	30	30±0
18	Доксициклин	15	16-19	20	10	32±0
19	Эритромицин	17	18-21	22	15	32±2
20	Азитромицин	13	14-17	18	15	25±2
21	Кларитромицин	13	14-17	18	15	36±2
22	Рокситромицин	13	15-18	19	30	34±2
23	Линкомицин	19	20-23	24	15	37±0
24	Клиндамицин	14	15-20	21	2	36±1
25	Ванкомицин	14	15-16	17	30	23±0
26	Хлорамфеникол (левомицитин)	15	16-18	19	30	35±0
27	Рифампицин	12	13-15	16	5	35±0
28	Полимиксин	11	12-14	15	300ЕД	0±0
29	Налидиксовая кислота	12	13-17	18	30	0±0
30	Ципрофлоксацин	15	16-20	21	5	16±2
31	Пефлоксацин	14	15-21	22	10	0±0
32	Ломефлоксацин	18	19-21	22	10	18±3

Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, амикацину, стрептомицину, пефлоксацину, налидиксовой кислоте, неомицину, промежуточно устойчив к оксациллину, канамицину, гентамицину, ципрофлоксацину и ломефлоксацину.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма В. longum OV-20 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×10⁷ КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. longum OV-20 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных средах с содержанием бифидобактерий не ниже 10⁹ КОЕ/мл, образуя в процессе культивирования органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков и к повышенной кислотности среды культивирования. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. longum OV-20 позволяют сделать заключение о его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. longum OV-20 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. longum OV-20 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 л; pH среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. longum OV-20 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. longum OV-20 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 ^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. longum OV-20 для получения бактерийного препарата.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. longum OV-20 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 ⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10⁸ КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование штамма В. longum OV-20 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы № 0 по 0,4 г.В 1 г БАД к пище содержится не менее 10 ⁸ КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.

Пример 5. Использование штамма В. longum OV-20 для получения гигиенических и косметических средств.

Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. longum OV-20 с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Пример 6. Использование штамма В. longum OV-20 для получения кисломолочного продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. longum OV-20 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до

10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 10⁸ КОЕ/мл бифидобактерий.

Список литературы

1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, № 1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, № 7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, № 5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. - Сб.научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004, 52 с.

8. Соколова К.Я., Соловьева И.В. Дисбактериозы. Теория и практика. Н.Новгород, 1999, 198 с.

9. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования. Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, № 5, с.76-79.