применение альфа-кетоглутарата и родственных соединений для снижения липидов плазмы

Формула изобретения

1. Применение альфа-кетоглутаровой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для изготовления фармацевтического препарата или пищевой или кормовой добавки для стимулирования продукции липидов высокой плотности (ЛВП) у позвоночных животных, таких, как птицы и млекопитающие, включая человека.

2. Применение по п.1, где используют альфа-кетоглутаровую кислоту или ее соль со щелочным или щелочноземельным металлом или их комбинацию.

3. Применение по п.2, где используют альфа-кетоглутарат натрия.

4. Способ стимулирования продукции липидов высокой плотности (ЛВП) у птицы или млекопитающего, включая человека, включающий введение указанным птице или млекопитающему количества, эффективного для повышения уровня ЛВП в плазме, по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты и ее фармацевтически приемлемых солей и фармацевтически приемлемых физических смесей альфа-кетоглутаровой кислоты и других аминокислот или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одной аминокислоты.

5. Способ по п.4, где вводят альфа-кетоглутаровую кислоту или ее соль со щелочным или щелочноземельным металлом или их комбинацию.

6. Способ по п.5, где вводят альфа-кетоглутарат натрия.

7. Способ по п.4, где вводят фармацевтический препарат или пищевую или кормовую добавку, включающую активное(ые) начало или начала.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новому применению известных фармакологически активных химических соединений. Конкретнее, настоящее изобретение относится к новому применению определенных кислот, липидов и солей и их смесей для изготовления фармацевтического препарата или пищевой или кормовой добавки для лечения или профилактики состояния повышенных уровней в плазме по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из холестерина, липидов низкой плотности (ЛНП) и глицеридов, или для стимулирования продукции липидов высокой плотности (ЛВП) у позвоночных животных, таких как птицы и млекопитающие, включая человека.

Холестерин является амфипатическим липидом и как таковой является необходимым структурным компонентом биологических мембран и внешнего слоя липопротеинов плазмы. Липопротеины транспортируют свободный холестерин в кровоток, где он обменивается, по принципу баланса, с холестерином, содержащимся в других липопротеинах и плазме. Этерифицированный холестерин является буферным холестерином, который обнаруживается в большинстве тканей организма. Он транспортируется как «груз» в ядре липопротеинов плазмы. ЛНП, липопротеин низкой плотности, действует как посредник в переносе холестерина и сложных эфиров холестерина ко многим тканям. Свободный холестерин удаляется из тканей ЛВП, липопротеином высокой плотности, и транспортируется в печень, где он метаболизируется до желчных кислот, и окончательно он удаляется из организма в процессе обратного транспорта холестерина. Холестерин также является главным компонентом желчных камней. Однако его наиболее важной ролью в патологических процессах является активное участие в атеросклерозе кровеносных сосудов, который ведет к заболеваниям мозговых, коронарных и системных артерий. Интенсификация артериосклероза положительно коррелирует с высоким значением отношения концентрации ЛНП к ЛВП, поскольку ЛВП являются специфическим «тралом» холестерина во время его транспорта из тканей в печень. Холестерин является предшественником всех других стероидов в организме, таких как кортикостероиды, половые гормоны, желчные кислоты и витамин D. Это типичный продукт животного метаболизма; отсюда следует, что он обнаруживается в пище животного происхождения, такой как яичный желток, мясо, печень и мозг.

Организм взрослого человека содержит приблизительно 140 г общего (свободного и этерифицированного) холестерина, из которых приблизительно 40 г обнаружены в нервной ткани; оставшиеся 5% обнаружены в плазме. Содержание холестерина в других органах и тканях колеблется с наиболее значительными изменениями в жировой ткани и печени.

Отложение сложных эфиров холестерина и других липидов в соединительной ткани артериальных стенок характерно для артериосклероза. Со временем отложения холестерина в артериях подвергаются отвердеванию, которое делает их уже и препятствует кровотоку или даже полностью его блокирует. Когда артерии сужены, недостаточный кровоток преобразуется в дефицит кислорода. Сердце испытывает недостаток кислорода (происходит ишемия), который, в свою очередь, вызывает боль в грудной клетке. Когда одна из коронарных артерий полностью блокирована, развивается инфаркт миокарда или некроз сердца.

Высокий уровень холестерина сам по себе не вызывает никаких симптомов; поэтому многие люди не осознают вредные эффекты его высокой концентрации в организме. Эффективное снижение высокой концентрации холестерина уменьшает риск коронарного заболевания, сердечной недостаточности и сердечной смерти. Кроме того, снижение холестерина у людей, которые страдают от коронарных заболеваний, перенесли инфаркт миокарда, уменьшает риск другого инфаркта и продлевает им жизнь. Снижение уровня холестерина касается всех людей во всех возрастных группах.

Липопротеины низкой плотности, или ЛНП, в плазме, которые легко модифицируются в процессе окисления, составляют важный фактор в развитии артериосклероза. Начало артериосклероза неизменно связано с окислением ЛНП. Окисленные ЛНП (оксиЛНП) обычно рассматривают как проартериосклеротический агент. Окисление ЛНП состоит в перекисном окислении остатков ненасыщенных жирных кислот, содержащихся в фосфолипидах и сложных эфирах холестерина. Процесс индуцируется свободными кислородными радикалами. Макрофаги и гладкие миоциты захватывают модифицированные ЛНП и превращаются в пенистые (ксантомные) клетки, нагруженные холестерином и липидами, являясь главным компонентом атеросклеротической бляшки. Образование пенистых клеток интенсифицируется с повышением концентрации оксиЛНП в плазме. Агрегация тромбоцитов, часто приводящая к внутрисосудистому тромбозу, также играет важную роль в патогенезе артериосклероза.

Атеросклеротическая бляшка подвергается специфическим процессам минерализации (кальцификации), похожим на образование костной ткани. Кальцификация повышает риск инфаркта миокарда независимо от возраста пациента. Более частыми становятся осложнения после ангиопластики, например, рассечение стенки коронарной артерии. Кальцификация также способствует образованию нестабильного коронарного заболевания, поскольку разрывы по краям атеросклеротической бляшки более распространены, когда отвердевшая бляшка расположена близко к эластичной стенке артерии. Кальцификация также оказывает влияние на тонус сосудистой стенки и снижает ее эластичность, затрудняя увеличение вертикального сечения артерий. Потеря эластичности может значительно ухудшить гемодинамику и способствует развитию сердечных заболеваний.

Заболевания кровеносной системы могут принимать одну из следующих форм нарушений: повышение уровня ЛОНП (в основном триглицеридов) при стандартном уровне ЛНП, повышение уровня ЛНП при стандартном уровне ЛОНП (триглицеринов) или повышение уровней обеих фракций липопротеинов (холестерин + триглицериды).

Различные внешние факторы могут также оказывать влияние на концентрацию холестерина. Во-первых, его концентрация меняется с возрастом. Менопауза, которая является следствием прекращения активности яичников или эндокринных желез, имеет особое значение. Сходные симптомы появляются в течение андропаузы. Беременность повышает концентрацию холестерина в крови. Распространены описания колебаний, относящихся к менструальному циклу. Во время овуляции концентрация холестерина в плазме снижается. После овариэктомии или в результате естественного прекращения активности яичников концентрация холестерина и триглицеридов возрастает. Эстрогены повышают концентрацию ЛВП в крови. Следовательно, их недостаток преобразуется в повышенный риск артериосклероза, поскольку отсутствие ЛВП вызывает повышенную концентрацию ЛНП и в результате повышение риска заболеваний, протекающих с расстройством кровообращения. Пероральное введение контрацептивов также может повышать, особенно среди молодых женщин, уровень холестерина.

Неполноценная диета является еще одной причиной в пользу повышенных уровней холестерина. Употребление жирных и подвергнутых интенсивной обработке продуктов питания и сниженное употребление овощей и фруктов приводит к подъему холестерина в крови. Склонность к ожирению и аномальной, особенно очень высокой массе тела, также может оказывать влияние на уровень холестерина и триглицеридов. У таких людей описаны повышенные количества этих элементов в организме. Кроме изменений в системе кровообращения, люди с чрезмерной массой тела подвержены проблемам, относящимся к опорно-двигательной системе. Вероятно развитие дизартроза, а молодые люди, чья костная система продолжает расти, могут страдать от повреждений костей, поскольку их кости плохо адаптированы к несению тяжести чрезмерной массы их тела.

В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было обнаружено, что альфа-кетоглутаровая кислота, глутамин и глутаминовая кислота, и соли, и дипептиды, и трипептиды указанных аминокислот, и соли, амиды и смеси альфа-кетоглутаровой кислоты с аминокислотами могут быть использованы для лечения или профилактики состояния повышенных уровней холестерина, ЛНП и/или глицеридов в плазме, или для стимулирования продукции ЛВП у позвоночных животных, таких как птицы и млекопитающие, включая человека.

Таким образом, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения предложено новое применение по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты, глутамина, глутаминовой кислоты и фармацевтически приемлемых солей этих кислот, амидов альфа-кетоглутаровой кислоты и аминокислоты или ди- или трипептида, дипептидов глутамина и другой аминокислоты, трипептидов глутамина и других аминокислот, дипептидов глутаминовой кислоты и других аминокислот, трипептидов глутаминовой кислоты и других аминокислот и фармацевтически приемлемых солей указанных дипептидов и трипептидов, фармацевтически приемлемых физических смесей альфа-кетоглутаровой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одной аминокислоты, для изготовления фармацевтического препарата или пищевой или кормовой добавки для лечения или профилактики состояния повышенных уровней в плазме по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из холестерина, липидов низкой плотности (ЛНП) и глицеридов или для стимулирования продукции липидов высокой плотности (ЛВП) у позвоночных животных, таких как птицы и млекопитающие, включая человека.

В соответствии с предпочтительным воплощением данного изобретения используют альфа-кетоглутаровую кислоту или ее соль со щелочным или щелочноземельным металлом или их комбинацию. Предпочтительно используют альфа-кетоглутарат натрия.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики состояния повышенных уровней в плазме по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из холестерина, липидов низкой плотности (ЛНП) и глицеридов, у птиц и млекопитающих, включая человека, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, количества, эффективного для снижения уровня в плазме, по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты, глутамина, глутаминовой кислоты и фармацевтически приемлемых солей этих кислот, амидов альфа-кетоглутаровой кислоты и аминокислоты или ди- или трипептида, дипептидов глутамина и другой аминокислоты, трипептидов глутамина и других аминокислот, дипептидов глутаминовой кислоты и других аминокислот, трипептидов глутаминовой кислоты и других аминокислот и фармацевтически приемлемых солей указанных дипептидов и трипептидов, фармацевтически приемлемых физических смесей альфа-кетоглутаровой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одной аминокислоты.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложен способ стимулирования продукции липидов высокой плотности (ЛВП) у птицы или млекопитающего, включая человека, включающий введение указанным птице или млекопитающему количества, эффективного для повышения уровня ЛВП в плазме, по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты, глутамина, глутаминовой кислоты и фармацевтически приемлемых солей этих кислот, амидов альфа-кетоглутаровой кислоты и аминокислоты или ди- или трипептида, дипептидов глутамина и другой аминокислоты, трипептидов глутамина и других аминокислот, дипептидов глутаминовой кислоты и других аминокислот, трипептидов глутаминовой кислоты и других аминокислот и фармацевтически приемлемых солей указанных дипептидов и трипептидов, фармацевтически приемлемых физических смесей альфа-кетоглутаровой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одной аминокислоты.

В соответствии с предпочтительным воплощениями этих аспектов вводят альфа-кетоглутаровую кислоту или ее соль со щелочным или щелочноземельным металлом или их комбинацию. Наиболее предпочтительно вводят альфа-кетоглутарат натрия.

Пищевые или кормовые добавки и фармацевтические препараты активного(ых) начала или начал, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть введены позвоночному животному, включая млекопитающих и птиц, таких как грызуны, такие как мышь, крыса, морская свинка или кролик; птица, такая как индейка, куропатка или курица и другие бройлеры; и дикие животные; корова, лошадь, свинья или поросенок и другие сельскохозяйственные животные; собака, кошка и другие домашние животные; и, в частности, человека.

Введение может быть осуществлено разными путями в зависимости от вида позвоночного животного, подвергающегося лечению, от состояния позвоночного животного, нуждающегося в указанных способах, и от специфических показаний к лечению.

В одном воплощении введение осуществляют в виде пищевой или кормовой добавки, такой как диетическая добавка и/или компонент в форме твердой пищи и/или напитка. Другие воплощения могут быть в виде суспензий или растворов, таких как напитки, описанные ниже. Также формами могут быть капсулы или таблетки, такие как жевательные или растворимые, например, шипучие таблетки, а также порошки и другие сухие формы, известные специалисту в данной области, такие как пилюли, такие как микропилюли и гранулы.

Введение может быть представлено в виде парентеральной, ректальной или пероральной пищевой или кормовой добавки, как указано выше. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или нелетучие масла.

Пищевая и кормовая добавка также может быть эмульгирована. Активный терапевтический ингредиент или ингредиенты могут тогда быть смешаны с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или подобные им и их комбинации. Дополнительно, если требуется, композиция может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН, буферные агенты, которые увеличивают эффективность активного ингредиента.

Могут быть предложены различные формы пероральной пищевой или кормовой добавки, такие как твердая пища, жидкости или лиофилизированные или иным способом высушенные композиции. Они могут включать разбавители различных буферов (например, Трис-НСl, ацетат, фосфат), рН и ионной силы, добавки, такие как альбумин или желатин, для предотвращения абсорбции на поверхностях, детергенты (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчных кислот), растворители (например, глицерин, полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, Thimerosal, бензиловый спирт, парабены), наполнители или модификаторы тоничности (например, лактоза, маннит), ковалентное прикрепление полимеров, таких как полиэтиленгликоль, к композиции, комплексообразование с ионами металлов или включение вещества в препараты в форме частиц полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и так далее, или на них или на липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, тени эритроцитов или сферопласты. В одном воплощении пищевую или кормовую добавку вводят в форме напитка или его сухой смеси любым способом в соответствии с изобретением.

Напиток включает эффективное количество активного ингредиента или ингредиентов вместе с приемлемым для пищевых целей водорастворимым носителем, таким как минералы, витамины, углеводы, жиры и протеины. Все эти компоненты предлагают в сухой форме, если напиток предлагают в сухой форме. Напиток, который предлагают готовым к употреблению, дополнительно содержит воду. Окончательный раствор напитка также может иметь контролируемую концентрацию и кислотность, например, как забуференный раствор в соответствии с общими предложениями в вышеприведенном абзаце. Предпочтительными являются значения рН в пределах 2-5, в частности, около 2-4, чтобы предотвратить бактериальный или грибковый рост. Стерилизованный напиток со значением рН около 6-8 также может быть использован.

Напиток может быть предложен отдельно или в комбинации с одной или более чем одной терапевтически эффективной композицией.

В соответствии с еще одним воплощением фармацевтические препараты как лекарственные средства для перорального и ректального применения могут быть представлены в форме таблеток, лепешек, капсул, порошков, водных или масляных суспензий, сиропов, эликсиров, водных растворов и так далее, включающих активный ингредиент или ингредиенты в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями и/или добавками, такими как разбавители, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители, полезные в способах и применении, раскрытых в настоящем изобретении.

Кроме того, используемые здесь «фармацевтически приемлемые носители» хорошо известны специалистам в данной области и могут включать 0,01-0,05 М фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор, но не ограничены ими. К тому же такие фармацевтически приемлемые носители могут быть в виде водных или неводных растворов, суспензий и эмульсий. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для введения посредством инъекции органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевой раствор и забуференные среды. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или нелетучие масла. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные вещества, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное.

Аминокислоты, составляющие часть амидов с альфа-кетоглутаровой кислотой или дипептидов с глутамином или глутаминовой кислотой, или трипептидов с глутамином и/или глутаминовой кислотой, могут быть любыми из аминокислот, встречающихся как компоненты пептидов в природе. То же относится к фармацевтически приемлемым физическим смесям альфа-кетоглутаровой кислоты или ее солей с по меньшей мере одной аминокислотой. Предпочтительной является аминокислота или аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из аргинина, орнитина, лейцина, изолейцина и лизина.

Указанные аминокислоты предпочтительно используют в L-конфигурации.

Примеры амидов альфа-кетоглутаровой кислоты с аминокислотой или ди- или трипептидом включают амиды альфа-кетоглутаровой кислоты с аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутамина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, лизина, пролина, изолейцина и лейцина, и амиды альфа-кетоглутаровой кислоты с дипептидом глутамина и любой из кислот: глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, лизина, пролина, изолейцина и лейцина, и с дипептидом глутаминовой кислоты и любой из кислот: аргинина, орнитина, лизина, пролина, изолейцина и лейцина, но не ограничиваются ими.

Примеры ди- и пептидов глутамина и глутаминовой кислоты с другими аминокислотами включают те, которые упомянуты выше в отношении амидов альфа-кетоглутаровой кислоты с ди- или трипептидами.

Примеры физических смесей -кетоглутаровой кислоты или ее солей с по меньшей мере одной аминокислотой включают физические смеси по меньшей мере одного члена, выбранного из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты и ее натриевой, калиевой, кальциевой и магниевой соли с любой из кислот: глутамином, глутаминовой кислотой, аргинином, орнитином, лейцином, изолейцином, лизином или пролином и любыми комбинациями указанных аминокислот, но не ограничиваются ими.

Молярное отношение альфа-кетоглутаровой кислоты или ее солей к аминокислоте или аминокислотам указанных физических смесей в среднем находится в пределах от 1:0,01 до 1:2, предпочтительно от 1:0,1 до 1:1,5 и наиболее предпочтительно от 1:0,2 до 1:1,0.

Вводимая доза будет меняться в зависимости от используемого активного(ых) начала или начал, состояния, подлежащего лечению, возраста, пола, массы и тому подобного пациента, подвергающегося лечению, но в среднем находится в пределах от 1 до 1000 мг/кг массы тела/сутки, предпочтительно от 10 до 100 мг/кг массы тела/сутки.

Изобретение будет теперь дополнительно проиллюстрировано посредством группы примеров, которые не должны быть истолкованы как ограничение объема изобретения.

Пример 1

Исследование проводили на самках крыс Wistar, содержащихся в стандартных погодных условиях. В течение первых 14 дней крыс подвергали акклиматизации к условиям вивария (температура 22°С±2°С, цикл 12 час/12 час день/ночь, влажность 55%±5%), и крысы имели постоянный доступ к воде и их кормили стандартным гранулированным кормом для крыс (LSM) (Wytwornia Pasz [оборудование для производства корма] «Agropol» Motycz около Люблина). После этого самки крыс были случайным образом разделены на 2 группы; у всех животных в первой группе (OVX) была проведена овариэктомия, во второй группе (SHO) были проведены операции-плацебо. Хирургические операции проводили под общей анестезией (рометар (rometare), кетамин и атропин в дозах 2, 10 и 0,05 мг/кг массы тела соответственно).

Исследования проводили на животных из двух групп: самки получали экспериментальные растворы начиная с седьмого дня после операции (моделирование первого периода недостаточной активности гормонов яичника) (Эксперимент I 1), самки в возрасте 7 месяцев с пятимесячным периодом отсутствия гормональной активности яичников (моделирование периода продолжительного отсутствия активности гормонов яичника) (Эксперимент I 2) (Табл.2). Животные в каждой возрастной группе были разделены на группы, получающие перорально базовый раствор (Табл.1) и базовый раствор, разведенный в десять и в сто раз (далее обозначаемые как дозы AKG 1, 0,1 и 0,01).

В каждом из Экспериментов I 1 и I 2 для каждой экспериментальной дозы использовали 40 животных, в сумме составивших 240 животных.

Таблица 1. Состав базовых экспериментальных растворов плацебо и альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG)
Состав	Плацебо	Экспериментальный раствор
AKG	-	146 г
Глюкоза	300 г	300 г
Сахароза	150 г	150 г
NaOH	36 г	36 г
КОН	7,5 г	7,5 г
Са(ОН)2	4,6 г	4,6 г
Мg(ОН) 2	1,8 г	1,8 г
Вода	до 10 л (рН 4,6)	до 10 л (рН 4,6)

Таблица 2. Диаграмма Эксперимента I
	Плацебо	AKG
Эксперимент № I-1
Эксперимент начали через 7 дней после хирургических операций
SHO	n=10	n=10
OVX	n=10	n=10
Эксперимент № I-2
Эксперимент начали через 5 месяцев после хирургических операций
SHO	n=10	n=10
OVX	n=10	n=10

Пробы крови отбирали немедленно после убоя, и плазму, отделенную центрифугированием, хранили в безопасном месте для дальнейших биохимических анализов.

Биохимические анализы

Концентрацию общего холестерина определяли посредством общедоступного аналитического оборудования с применением спектрофотометрического метода.

Результаты представлены ниже в Таблицах 3-8.

Таблица 3. Защитный эффект дозы 0,01 AKG в отношении концентрации холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови (через 7 дней после хирургической операции + 60 дней лечения AKG) (X±S.E.M (стандартная ошибка)) (a, b,p<0,05) (SHO = с симулированной операцией; OVX = крысы Wistar с овариэктомией)
	SHO + плацебо	SHO + AKG (доза 0,01)	OVX + плацебо	OVX + AKG (доза 0,01)
САМКИ	1,45±0,08	1,50±0,19	1,70±0,083	1,46±0,08b

Таблица 4. Защитный эффект дозы 0,1 AKG в отношении концентрации холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови (через 7 дней после хирургической операции + 60 дней лечения AKG) (SHO = с симулированной операцией; OVX = крысы Wistar с овариэктомией)
	SHO + плацебо	SHO + AKG (доза 0,01)	OVX + плацебо	OVX + AKG (доза 0,01)
САМКИ	1,37±0,08	1,45±0,19	1,56±0,08	1,47±0,08

Таблица 5. Терапевтический эффект дозы 0,01 AKG в отношении концентрации холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови (150 дней после хирургической операции +60 дней лечения AKG) (X±S.E.M) (a, bp<0,01) (A, Bp>0,05) (SHO = с симулированной операцией; OVX = крысы Wistar с овариэктомией)
	SHO+ плацебо	SHO+AKG (доза 0,01)	OVX+ плацебо	OVX+AKG (доза 0,01)
САМКИ	1,87±0,13	1,59±0,06a	2,04±0,06 bA	1,68±0,09 B

Таблица 6. Терапевтический эффект дозы 0,1 AKG в отношении концентрации холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови (150 дней после хирургической операции +60 дней лечения AKG) (X±S.E.M) (a, bp<0,05) A, Bp<0,01)
	SHO + плацебо	SHO + AKG (доза 0,1)	OVX + плацебо	OVX + AKG (доза 0,1)
САМКИ	1,61±0,07	1,60±0,08a	1,88±0,057 bA	1,59±0,06 B

Таблица 7. Защитный эффект дозы 1,0 AKG в отношении концентрации холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови (через 7 дней после хирургической операции + 60 дней лечения AKG)
	SHO + плацебо	SHO + AKG (доза 1,0)	OVX + плацебо	OVX + AKG (доза 1,0)
САМКИ	1,56±0,25	1,28±0,11	1,70±0,12	1,44±0,11

Таблица 8. Терапевтический эффект дозы 1,0 AKG в отношении концентрации холестерина (ммоль/л) в сыворотке крови (90 дней после хирургической операции + 60 дней лечения AKG) (a, bp<0,05; A, Bp<0,01 статистически значимые различия между группами, получающими лечение плацебо и AKG) (#р<0,001; *р<0,01 статистически значимые различия между группами SHO плацебо и OVX соответственно).
	SHO + плацебо	SHO + AKG (доза 1,0)	OVX + плацебо	OVX + AKG (доза 1,0)
САМКИ	1,15±0,08 a#*	0,76±0,06 b	1,92±0,04 A#	0,49±0,09 B*

Пример 2. (Эксперимент II)

Исследование проводили на крысах Wistar (всего использовали 84 животных) со средней массой тела 250 г, подвергнутых периоду акклиматизации к условиям вивария (температура 22°С±2°С, цикл 12 час/12 час день/ночь, влажность 55%±5%) и имевших постоянный доступ к воде и пище. После этого все животные получали корм, обогащенный 1% холестерина (Sigma-Aldrich, Германия) и 10% свиного сала в целях достижения гиперхолестеринемии.

12 крыс (6 самок и 6 самцов) были забиты на 0-й день в качестве предварительного контроля.

12 крыс (6 самок и 6 самцов) были забиты на 30-й день.

12 крыс (6 самок и 6 самцов) были забиты на 60-й день.

Оставшиеся 48 крыс были разделены на 3 группы, и эксперимент продолжали еще 60 дней на холестеринемической диете:

1. Группа плацебо - 24 крысы (12 самок и 12 самцов)

2. Группа с 1 г AKG - 12 крыс (6 самок и 6 самцов)

3. Группа с 0,1 г AKG - 12 крыс (6 самок и 6 самцов).

Плацебо- и экспериментальные растворы были аналогичны таковым из Примера 1.

Биохимические анализы

В течение первых 60 дней использования диеты, обогащенной холестерином и свиным салом, липидный профиль проверялся три раза для определения концентрации общего холестерина, фракции ЛНП и ЛВП и триглицеридов. Измерительные тесты выполняли за день до начала использования указанной диеты (день 0) и затем через 30 и 60 дней применения указанной диеты. На шестьдесят первый день эксперимента животные были разделены на две группы: одна, получавшая раствор плацебо, а другая, получавшая раствор AKG (AKG в дозах 0,1 и 1 (Таблица 9)). На протяжении всего времени животные продолжали получать экспериментальный корм. В течение периода, когда вводили растворы плацебо и AKG, липидный профиль проверяли на 120-й день эксперимента.

Во всех случаях использовали плазму крови и тесты проводили немедленно после убоя.

Результаты представлены ниже в Таблицах 10-14.

Таблица 10. Общий уровень холестерина (мг/дл) в сыворотке крови крыс (X±S.E.MH) (a, b, сp>0,01)
	0-й день	30-й день	60-й день	120-й день + Н2O	120-й день + AKG (доза 0,1)	120-й день + AKG (доза 1,0)
САМКИ	88,0±4,82	98,5±5,62	109,3±4,5	108,6±3,74 a	77,2±3,14 b	69,2±2,5 b
САМЦЫ	69,3±2,5	86,2±3,76	90,7±4,73	90,0±1,7a	65,0±2,28 b	69,6±2,73 b

Таблица 11. Уровень триглицеридов (мг/дл) в сыворотке крови крыс (X±S.E.M) (a, b, сp<0,01)
	0-й день	30-й день	60-й день	120-й день + Н2O	120-й день + AKG (доза 0,1)	120-й день + AKG (доза 1,0)
САМКИ	73,8±8,1	146,8±16,11	196,7±30,43	183,9±3,97 а	111,7±1,85 b	142,0±2,39 с
САМЦЫ	70,0±1,47	153,7±13,79	180,0±17,72	182,4±4,54a	102,2±10,89 b	119,6±17,35 b

Таблица 12. Уровень ЛНП (мг/дл) в сыворотке крови крыс (X±S.E.M) (a, b, сp>0,01)
	0-й день	30-й день	60-й день	120-й день + Н2O	120-й день + AKG (доза 0,1)	120-й день + AKG (доза 1,0)
САМКИ	13,0±2,89	19,7±5,44	32,0±2,86	30,8±1,31 a	0,20±0,015 b	0,20±0,019 b
САМЦЫ	14,0±1,34	17,7±3,58	30,3±1,84	32,5±5,42a	5,4±2,48 b	10,2±2,31 b

Таблица 13. Уровень ЛВП (мг/дл) в сыворотке крови крыс (X±S.E.M) (a, b, сp<0,05)
	0-й день	30-й день	60-й день	120-й день + Н2O	120-й день + AKG (доза 0,1)	120-й день + AKG (доза 1,0)
САМКИ	60,3±3,9	49,2±13,72	46,3±4,64	37,7±1,65	39,4±0,68	40,2±1,59
САМЦЫ	41,7±3,36	37,5±3,49	28,7±1,55	24,5±1,99 а	39,0±1,67 b	35,6±2,32 b

Таблица 14. Масса тела (г) крыс (X±S.E.M) ( a, b, сp<0,05)
	0-й день	30-й день	60-й день	120-й день + Н2O	120-й день + AKG (доза 0,1)	120-й день + AKG (доза 1,0)
САМКИ	269,7±6,48	304,6±4,84	330,0±7,15	356,7±5,77	355,6±6,62	350,8±9,7
САМЦЫ	371,3±3,27	445,9±10,7	447,3±3,01	512,2±7,96 а	519,2±7,39 а	462,1±0,9 b

Пример 3 (Эксперимент III)

Исследования проводили на добровольцах со сравнительно высоким уровнем холестерина, 194 мг/дл и 190 мг/дл соответственно. Приготавливали жевательные таблетки, каждая из которых содержала 1,28 г альфа-кетоглутарата кальция (соответствует 1 г альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG) и 0,28 г кальция), и перорально вводили их добровольцам. Всего эксперимент длился 42 дня. С 1 по 28 день пациенты принимали по две таблетки AKG три раза в день. В течение эксперимента не вводили количественных или качественных ограничений относительно диеты. В период с 1 по 28 день липидный профиль пациентов проверяли каждые семь дней для определения концентрации холестерина, фракций ЛНП и ЛВП и триглицеридов. Введение таблеток AKG было прервано на 14 дней после периода 28 дней. Последующие измерения липидного профиля проводили на 42-й день эксперимента.

Результаты представлены ниже в Таблицах 15-18.

Таблица 15. Общий уровень холестерина (мг/дл)
Неделя проводимого исследования	1 я неделя	2 я неделя	3 я неделя	4 я неделя		6я неделя
Доброволец 1 (38-летний мужчина)	194	196	171	157	2 недели без	197
Доброволец 2 (38-летний мужчина)	190	213	199	189	AKG	215

Таблица 16. Уровень ЛВП (мг/дл)
Неделя проводимого исследования	1я неделя	2я неделя	3я неделя	4я неделя		6я неделя
Доброволец 1 (38-летний мужчина)	45	41	42	48	2 недели без	33
Доброволец 2 (38-летний мужчина)	35	44	40	42	AKG	40

Таблица 17. Уровень ЛНП (мг/дл)
Неделя проводимого исследования	1я неделя	2я неделя	3я неделя	4я неделя		6я неделя
Доброволец 1 (38-летний мужчина)	110	94	75	57	2 недели без	88
Доброволец 2 (38-летний мужчина)	131	148	119	110	AKG	131

Таблица 18. Уровень триглицеридов (мг/дл)
Неделя проводимого исследования	1я неделя	2я неделя	3я неделя	4я неделя		6я неделя
Доброволец 1 (38-летний мужчина)	197	304	269	259	2 недели без	375
Доброволец 2 (38-летний мужчина)	122	101	199	187	AKG	220

Обсуждение

Применение овариэктомии (OVX), обычно рассматриваемой как модель подхода воспроизведения симптомов, наблюдаемых в ходе постменопаузального синдрома, привело к повышению концентрации холестерина в плазме крови крыс. Применение AKG в дозе 0,01 в течение 60 дней у OVX самок (Эксперимент I-1) имело результатом статистически значимое снижение (р=0,04) концентрации общего холестерина у этих животных, достигшее уровня, наблюдаемого у животных из контрольной группы. Похожую тенденцию наблюдали у крыс, получавших AKG в дозе 0,1 (Эксперимент I-1). Эффекты AKG оказались более очевидными у самок с продолжительным недостатком гормонов яичника (Эксперимент I-2). Обе дозы альфа-кетоглутарата, 0,01 и 0,1, вызывали статистически значимое снижение концентрации общего холестерина у анализируемых животных в группах OVX и SHO. Также использование дозы 1 альфа-кетоглутарата снижало концентрацию общего холестерина у самок после овариэктомии по сравнению с контрольной группой в экспериментах, включающих как краткосрочное, так и долгосрочное снижение активности гормонов яичника (Эксперименты I-1 и I-2).

Во время Эксперимента II использовали корм, обогащенный 1% холестерина и 10% свиного сала, для индукции гиперхолестеринемии. Анализ холестеринового профиля через 30 дней эксперимента показывал статистическое повышение концентрации триглицеридов как среди самцов, так и среди самок относительно контрольной группы как в 0-й день. Более того, у самцов определяли значительное повышение концентрации общего холестерина. Нужно подчеркнуть, что у самок и самцов наблюдали схожую тенденцию к снижению по отношению к концентрации ЛВП и соответствующее повышение концентрации ЛНП после 60-дневного периода кормления экспериментальным кормом.

С 61-го дня в течение последующих 60 дней вводили растворы AKG в дозах 0,1 и 1. Анализ липидного профиля, выполненный на 120-й день эксперимента, показал статистически значимое снижение общего холестерина, фракции ЛНП и триглицеридов (р<0,05) в плазме крови самок и самцов. У исследуемых животных наблюдали и статистически подтвердили (р<0,05) одновременное повышение концентрации ЛВП.

Эксперимент III заключался в исследовании двух добровольцев с относительно высоким уровнем общего холестерина, фракции ЛНП и триглицеридов. Через 28 дней приема специально приготовленных таблеток, содержащих 1 г AKG (2 таблетки 3 раза в день), наблюдали снижение концентрации общего холестерина и фракции ЛНП. Значительного эффекта в отношении концентрации ЛВП не наблюдали. Концентрация ЛВП была несколько снижена в течение второй и третей недели эксперимента, а на 28-й день их концентрация соответствовала исходному уровню. С 1 по 28 день эксперимента наблюдали повышение концентрации триглицеридов. Концентрация общего холестерина и фракции ЛНП, которая снижалась при использовании альфа-кетоглутарата, возрастала после 14-дневного перерыва во введении препарата. Также наблюдали значительное повышение концентрации триглицеридов. В то же время определяли статистически значимое снижение концентрации фракции ЛВП.