способ коррекции возрастных и патологических изменений кожных покровов человека

Формула изобретения

1. Способ омоложения и лечения кожи человека, включающий использование аутогенных фибробластов с добавлением гиалуроновой кислоты, отличающийся тем, что аутогенные фибробласты вводят в область лечения или омоложения кожи в физиологическом растворе, при этом кожный покров предварительно обрабатывают ростовой средой фибробластов с биологически активными веществами (БАВ) - факторами ростовой среды, включающими в т.ч. факторы роста фибробластов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что готовят 0,5 мл суспензии, содержащей 1 млн фибробластов в физиологическом растворе с добавлением 0,5 мл раствора гиалуроновой кислоты в концентрации 0,02-0,1%, суспензию перемешивают и по 0,1-0,2 мл вводят шприцом в область омоложения или лечения.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ростовую среду в составе геля, в которой содержались фибробласты в течение 14-28 дней на бессывороточной среде, с содержанием БАВ 49%, гиалуроновой кислоты или гиалуроната натрия 0,5-1,5%, глицерина 49,5-48,5%, ароматизатора 0-0,5%.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ростовую среду в составе геля, в которой содержались фибробласты в течение 14-28 дней с сывороткой, с содержанием БАВ 49%, гиалуроновой кислоты или гиалуроната натрия 0,5-1,5%, глицерина 49,5-48,5%, ароматизатора 0-0,5%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что факторы ростовой среды перед употреблением концентрируют с использованием известных методик либо подвергают лиофилизации.

6. Способ по 5, отличающийся тем, что факторы ростовой среды добавляют в гель в объеме 0,5-3%, гель также состоит из глицерина 70%, коллагена крупного рогатого скота 1,5%, гиалуроновой кислоты 1,5%, очищенной воды необходимое количество до 100%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии и клеточной терапии, способам омоложения и лечения кожи человека.

Способ включает введение в область лечения или омоложения тканей или органов суспензии аутогенных (того же организма) фибробластов в физиологическом растворе с добавлением гиалуроновой кислоты.

Кроме того, предлагается стимулировать пролиферативную и синтетическую активность вводимых фибробластов с помощью продуктов роста фибробластов, содержащихся в среде, которая используется для их роста. Для этого предлагается выделять эти факторы из среды и использовать их в качестве составляющих в косметическом средстве, которое затем можно использовать перед клеточной терапией для подготовки кожи, а также после терапии - для увеличения эффекта методики и его пролонгирования.

В настоящее время клеточная терапия осуществляется следующим образом. Шприцем вводят клетки в место, требующее коррекции, и затем ожидают результата. При этом используют как аутогенные, так и аллогенные клетки (Патент США 5660850 26.08.1997; Boss W.K. Jr, Usal H, Fodor P.B, Chemoff G. Autologous cultured fibroblasts: a protein repair system. Ann Plast Surg. 2000 May 44(55): 536-542).

Аналогичное описание методики приводится в другом патенте (Патент № 2281776 2.08.2006), в котором за основу принимается то, что для увеличения эффективности клеточной терапии берутся только фибробласты с высокой эффективностью клонирования.

Несмотря на все более широкое распространение метода, все же остается открытым вопрос об эффективности применения аутогенных клеток для клеточной терапии, особенно у взрослых и пожилых людей (Крехели Э.А, Згурский А.А., Терехов С.М. Применение аутогенных фибробластов в косметологии. Эстетическая медицина. 2004. Т.3. № 4. С.336-342). Проблема заключается в том, что не всегда приживаются клетки и они не всегда эффективно исправляют морщины или другие дефекты.

Предлагаемая методика позволяет значительно повысить выживаемость клеток и увеличить эффективность клеточной терапии.

Гиалуроновая кислота действует как наполнитель кожного матрикса, создавая жизненный объем для вводимых аутогенных клеток, увеличивает время сохранения клеток до введения их в область терапии и способствует лучшей приживаемости клеток после их введения. Ввод растворов препаратов осуществляется с помощью шприца в область терапии. Концентрация препаратов и время их действия подбирается индивидуально в соответствии с конкретными условиями и в зависимости от возраста пациента, физического состояния, конкретного органа и ткани.

Ранее уже были проведены эксперименты на животных. Например, было изучено влияние фибробластов кожи в сочетании с препаратом стабилизированной гиалуроновой кислоты (Рестилайн) на бестимусных мышах (Yoon E.S. et al. Advantages of the presence of living dermal fibroblasts within restylane for soft tissue augmentation // Ann Plast Surg. 2003 Dec; 51(6). P. 587-592). Авторы оценили возможность увеличения срока действия Рестилайна в комбинации с кожными фибробластами. При подкожных инъекциях мышам смеси 5х10⁵ фибробластов, суспендированных в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в сочетании с 200 мкл Рестилайна, масса образующихся узелков несколько уменьшалась в течение первых 2 недель и далее не изменялась до 16 недель. Контрольные узелки, образовавшиеся после введения Рестилайна, разбавленного ФСБ, уменьшались за время наблюдений в 2 раза. Иммунохимическое окрашивание показало присутствие человеческого коллагена в узелках опытной группы по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты указывают, что Рестилайн, смешанный с культивируемыми фибробластами кожи человека, может быть успешно инъецирован как живой трансплантат с возможностью долговременного эффекта.

Нами проведены исследования, в которых фибробласты кожи людей вводились в проблемные места кожи пациента в физиологическом растворе и также вместе с гиалуроновой кислотой. Соотношение было следующим. Брали 0,5 мл суспенции фибробластов с 1 млн. клеток в физиологическом растворе и туда добавляли 0,5 мл гуалуроновой кислоты. Получали 0,5 млн кл./мл раствора. Исходный раствор гиалуроновой кислоты был в пределах 0,02-0,1%, чтобы конечная концентрация в суспензии составляла 0,01-0,05%. Суспензию перемешивали и проводили обкалывание шприцом проблемных мест.

Результаты были следующими. Папулы инъекций фибробластов с гиалуроновой кислотой держатся в 2 раза дольше, чем без него. Это значит, инъецированные фибробласты имеют больше возможностей для выживания и выполнения заложенных в них функций - продукции коллагена и эластина, что естественно ведет к разглаживанию морщин и фактически видимому уменьшению их глубины, размягчению кожи, повышению ее эластичности и упругости. Визуально это наблюдается по уменьшению заметности морщин, сглаживанию складок, выравниванию рельефа кожи. Скорость уменьшения защипов увеличивается как минимум в 1,5 раза, что говорит о реальном омоложении кожи также в эквивалентной величине.

Полученные результаты указывают, что гиалуроновая кислота, смешанная с культивируемыми фибробластами кожи человека, может быть успешно инъецирована как живой трансплантат с возможностью долговременного эффекта.

Второе предложение состоит в том, чтобы стимулировать пролиферативную и синтетическую активность вводимых фибробластов. Для этого предлагается использовать продукты роста фибробластов, содержащиеся в среде, которая используется для их роста.

Обычно в косметическом средстве применяются вещества растительного происхождения или синтезированные химически, применяют также гиалуроновую кислоту (Патент РФ № 94040904 от 1994.08.19).

При культивировании в ростовой среде фибробласты кожи синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста (EGF, FGF, TGF, KGF), компоненты внеклеточного матрикса (ГАГ, ГК, хондроитин сульфат) и ферменты (EGF - фактор роста эпидермиса, регулирует миграцию и пролиферацию эпидермальных клеток кожи. FGF - фактор роста фибробластов, стимулирует рост всех типов клеток и продукцию внеклеточного матрикса, TGF - транформирующий фактор роста, участвует в образовании новых кровеносных сосудов; KGF - фактор роста кератиноцитов (Крихели Э.А., Згурский А.А., Терехов С.М. Применение аутогенных фибробластов в косметологии. Эстетическая медицина. 2004. Т.3. № 4. С.336-342). Синтезируются также колланен и эластин - компоненты внеклеточного матрикса.

Авторы пришли к выводу, что эту среду можно использовать для приготовления косметического средства, которое можно будет применять как до, так и после применения клеточной терапии. При этом, такое косметическое средство можно смело назвать индивидуальным (личным), т.к. используются факторы, исходно принадлежащие реципиенту.

Присутствие в коже ростовых факторов и других перечисленных веществ от собственных клеток будет способствовать улучшению ее состояния, обеспечению выживаемости имеющихся и привнесенных извне, в результате клеточной терапии, клеток.

На основе данных факторов предлагается изготавливать индивидуальную косметику под общим названием: медицинское индивидуальное косметическое средство (МИКС).

Ее состав может быть следующим. Лиофилизированные факторы роста и белковые ингредиенты ростовой среды, в которой росли аутогенные фибробласты пациента, глицерин, в качестве наполнителя, гиалуроновая кислота для создания матрикса в дерме, ароматические компоненты для придания привлекательного запаха.

Предлагаются следующие рецептуры.

1. Клетки выращиваются 14-28 дней на среде, содержащей сыворотку, и на бессывороточной среде.

Рецептура приготовления геля, вариант 1:

Ростовая бессывороточная среда с БАВ	49%
Гиалуроновая кислота (гиалуронат натрия)	0,5-1,5%;
Глицерин (как основа)	49,5-48,5%;
Ароматизатор	0-0,5%

Рецептура приготовления геля, вариант 2:

Ростовая среда с сывороткой, содержащей БАВ	49%
Гиалуроновая кислота (гиалуронат натрия)	0,5-1,5%;
Глицерин (как основа)	49,5-48,5%;
Ароматизатор	0-0,5%

2. Биологически активные вещества, продуцируемые клетками в среду, концентрируются с использованием методик "Minhan", "Pillicon" -"Millipore" USA либо подвергаются лиофилизации. Содержание всех биологически активных веществ (БАВ), включая витамины и аминокислоты ростовой среды, факторы роста и др., составляет порядка 10 мг/мл в ростовой среде.

Рецептура приготовления геля, вариант 3:

БАВ (концентрат или лиофилизат)	0,5-3%
Глицерин (как основа)	70%;
Коллаген крупного рогатого скота	1,5%;
Гиалуроновая кислота (гиалуронат натрия)	1,5%;
Ароматизатор	0-0,5%
Вода очищенная	необходимое кол-во до 100%.

Срок хранения 50-60 дней при +4°С.

Курс применения 10 ампул по 2 мл в течение 20 дней через день.

Через 5-7 дней второй курс снова по 10 ампул через день - минимальный курс.

Курсы можно применять как до, так и после клеточной терапии. Косметика применяется следующим образом. Вскрывается 1 ампула и ее объем наносится вечером на проблемные места. После этого препарат не смывается до следующего утра. Через день на следующую ночь используется вторая ампула. В последующие дни аналогично используется 3-я и затем другие ампулы до 10. После клеточной терапии через 10 дней также используются другие 10 ампулы. Через 5-7 дней второй курс снова по 10 ампул через день.

Таким образом, имеются следующие варианты применения индивидуальной клеточной косметики:

1) 1 курс до клеточной терапии;

2) 2 курса после клеточной терапии;

3) 2 курса до и 2 курса после клеточной терапии.

Естественно, остается возможность применения клеточной технологии без использования МИКС.

МИКС является косметическим средством наружного применения.

Благодаря этим факторам и после их внесения на кожу, межклеточное вещество будет постепенно обновляться и, значит, омолаживаться.

Это также создает благоприятные условия для приживления аутогенных фибробластов и их лучшего функционирования в дальнейшем.

Были проведены испытания на добровольцах. Результаты испытаний описаны ниже, а также в таблице 1 и подтверждают промышленную применимость способа.

Таблица 1
Результаты применения терапии аутогенными фибробластами без гиалуроновой кислоты и совместно с последней
	Параметры	Оценка параметра до терапии	Терапия:
фибробласты	фибробласты + гиалуроновая кислота
Добровольцы			Б.О.К., 52 г	Д.З.К., 54 г
	Морщины	10	6	3
	Тургор	3	5	6
	Цвет кожи	9	7	5
	Суб. оценка	3	5	7
Добровольцы			З.А.А.	З.З.К.
	Морщины	8	6	4
	Тургор	5	6	7
	Цвет кожи	7	6	5
	Суб. оценка
Добровольцы			К.В.А.	Д.А.М.
	Морщины	9	5	4
	Тургор	3	4	5
	Цвет кожи	7	5	4
	Суб. оценка
Добровольцы			В.Б.А.	В.О.В.
	Морщины	8	6	3
	Тургор	2	3	4
	Цвет кожи	6	5	3
	Суб. оценка
Добровольцы			Ф.Т.М.	Ш.С.К.
	Морщины	7	6	4
	Тургор	6	7	7
	Цвет кожи	7	6	5
	Суб. оценка
Добровольцы			Ж.Р.П.	М.Е.П.
	Морщины	8	6	3
	Тургор	4	5	6
	Цвет кожи	6	4	3
	Суб. оценка
Примечание. Морщины, баллы 10-1 (глубина). Тургор, баллы 1-10. Цвет кожи в области морщин, баллы 10-0 (темный - светлый). Субъективная оценка 1-10 баллов.

Доброволец Б. O.K. 53 г., пол женский [Контроль]. При осмотре кожи лица обнаружено: снижение тургора кожи в области щек, подбородка; глубокие морщины в области носогубных складок, на переносице, лбу, вокруг глаз; обезвоживание и изменение контура лица.

Диагноз: возрастные изменения кожи лица.

Коррекция проблемных зон кожи лица была проведена заявленным способом с использованием аутогенных клеток и гиалуроновой кислоты.

Назначение: пересадка аутологичных фибробластов в проблемные зоны кожи лица совместно с гиалуроновой кислотой.

Для этого у добровольца брали кусочек кожи с внутренней поверхности предплечья. Биопсию (диаметром 4 мм) после промывки (2 раза) в растворе питательной среды ДМЕМ с антибиотиками пенициллин (50 мкг/мл) и стрептомицин (50 ед/мл) помещали в чашку Петри и измельчали скальпелем в 0,1 мл 0,25% раствора коллагеназы II типа. После измельчения кусочки ткани закрывали покровным стеклом и в чашку заливали 2 мл того же раствора коллагеназы. Чашку Петри ставили в СО₂-инкубатор. Через 1,5 ч чашку вынимали, раствор коллагеназы выливали, промывали средой ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и вновь заливали ростовую среду. Через 1 сутки среду меняли на свежую. Через 5 суток кусочки кожи смывали, среду с кусочками кожи помещали в центрифужную пробирку, центрифугировали 3 мин при 1000 об/мин, надосадок выливали, осадок помещали в новую чашку Петри, закрывали покровным стеклом, заливали среду ДМЕМ с 20% ЭТС и ставили в С0₂-инкубатор. Периодически через 3 суток среду меняли на свежую. Через 15 суток после достижения монослоя кусочки кожи со средой помещали в центрифужную пробирку и выполняли аналогичные действия. Затем в чашку Петри 2 раза споласкивали клетки раствором ЭДТА, после чего заливали 1 мл раствора трипсина. Чашку Петри помещали в СО₂-инкубатор. Через 15 мин когда клетки откреплялись от ростовой поверхности в чашу залили 2 мл ростовой среды, клетки суспендировали и перенесли в культуральный флакон площадью 75 см² и добавили 10 мл ростовой среды с 20% ЭТС, флакон поместили в СО₂ -инкубатор. Через 7 суток после достижения монослоя клетки сняли с поверхности роста аналогичным образом и перенесли клетки во флакон площадью 150 см². В течение месяца клетки пересевали аналогичным образом до достижения монослоя в 10 флаконах площадью 150 см². Далее клетки 7 флаконов снимали аналогичным образом, суспензию центрифугировали 2 раза в физиологическом растворе и готовили суспензию на физиологическом растворе с концентрацией 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем. Перед терапией поверхность кожи обрабатывали 70% раствором этилового спирта или 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводили местную анестезию 5% кремом Эмла. Ввод суспензии производили в поверхностный или средний слой дермы по 0,05 мл с интервалом 5-6 или 8-10 мм в зависимости от рода морщин. Делали 2 курса с интервалом в 2 недели

Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после.

Доброволец Д.З.К. 55 г., пол женский [Опыт]. Имел схожие признаки старения кожи с добровольцем Б.

Добровольцу проведены те же действия, что и добровольцу Б. Отличие состояло в том, что ему вводили суспензию аутогенных фибробластов совместно с гиалуроновой кислотой.

Для этого аналогичным образом готовили суспензию аутогенных фибробластов на физрастворе в концентрации 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого непосредственно перед процедурой к суспензии клеток 0,5 мл добавляли 0,5 мл гиалуроновой кислоты (гиалуронат натрия) и производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем. Также делали 2 курса с интервалом в 2 недели

Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после.

Результаты терапии без гиалуроновой кислоты (Доброволец Б. О. К.). Через 4-5 месяцев после пересадки фибробластов наблюдали сглаживание морщин и крупных складок лба; сглаживание морщин на переносице и в латеральной подглазничной области глаз; уменьшилась выраженность и глубина носогубных складок; заметно улучшился тургор кожи, улучшился контур и цвет лица.

Результаты терапии с гиалуроновой кислотой (Доброволец Д.З.К.). Через 4-5 месяцев после пересадки фибробластов эффект тот же, что у добровольца Б, однако степень разглаживания морщин выше на 2-3 балла по 10 бальной шкале, степень удовлетворенности пациента выше.

Аналогичные результаты получены еще на 10 пациентах, 5 из которых проводили терапию без гиалуроновой кислоты, а 5 с гиалуроновой кислотой. Подбирали пары добровольцев таким образом, чтобы их параметры были примерно одинаковыми.

Также были проведены испытания на добровольцах индивидуальной косметики МИКС.

Результаты описаны ниже и сведены в таблицу 2.

Добровольцам проведены те же действия, что описаны выше, т.е. таким же образом получали культуры аутогенных клеток и также готовили суспензии клеток. Отличие состояло в том, что части добровольцев вводили только суспензию фибробластов, а другим проводили, кроме курса клеточной терапии, курсы собственной косметики как до, так и после применения клеточной терапии.

Для этого аналогичным образом готовили суспензию аутогенных фибробластов на физрастворе в концентрации 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем 2 курсами с интервалом в 2 недели.

Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после.

Части добровольцев делали обработку кожи индивидуальной косметикой МИКС до клеточной терапии и после. Для этого готовили индивидуальную косметику, как описано выше.

Косметику МИКС применяли по следующей схеме:

1) 1 курс до клеточной терапии (10 ампул через день);

2) 2 курса после клеточной терапии (2 курса по 10 ампул через день).

Таблица 2
Результаты применения терапии аутогенными фибробластами без индивидуальной косметики МИКС и совместно с последней
Пациент	Оцениваемые Параметры	Состояние Оценка параметра до терапии	Терапия:
фибробласты	фибробласты + МИКС
Добровольцы			Б.О.К., 52 г	Д.З.К., 54 г
	Морщины	10	6	3
	Тургор	3	5	6
	Цвет кожи	9	7	5
	Суб. оценка
Добровольцы			З.А.А.	З.З.К.
	Морщины	8	6	4
	Тургор	5	6	7
	Цвет кожи	7	6	5
	Суб. оценка
Добровольцы			К.В.А.	Д.А.М.
	Морщины	9	5	4
	Тургор	3	4	5
	Цвет кожи	7	5	4
	Суб. оценка

После применения МИКС наблюдали следующие эффекты по сравнению с контролем.

Доброволец А.С., пол мужской, 54 г.: кожа ожила, произошло рассасывание уплотнений, образовавшихся после клеточной терапии, разгладилась кожа, мелкие морщины стали менее заметны.

Доброволец Ф.А., пол женский, 40 лет: кожа стала мягче, более упругой, посвежела, морщины разгладились.

Добровольцы Ф.О., пол женский, 45 лет, Л.Э., пол женский, 53 г., О.Е., пол мужской, 43 г.: произошли аналогичные изменения.

Во всех случаях отсутствовали отрицательные последствия применения МИКС, как объективные, так и субективные.

Таким образом, методика показала свою эффективность и отсутствие аллергических и др. негативных реакций.