штамм bifidobacterium pseudocatenulatum ov-2, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств

Формула изобретения

Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2, коллекционный номер № 211, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].

Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.

Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].

Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum.) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8].

Это дает основание считать, что при конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава бифидофлоры. Включение новых производственных штаммов бифидобактерий расширит номенклатуру и повысит эффективность разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-2, обладающего антагонистической активностью, устойчивостью к средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.

Штамм В. pseudocatenulatum OV-2 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под № 211.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. pseudocatenulatum OV-2 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-2, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. pseudocatenulatum OV-2 в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам и органическим кислотам, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.

Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства

Клетки штамма В. pseudocatenulatum OV-2 представляют собой Грам + полиморфные, бесспоровые неподвижные палочки с утолщением на одном конце, расположенные одиночно, попарно или в виде китайских иероглифов. В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза, образуя колонии в виде «комет» с плотным ядром около 2 мм в диаметре и длинным вуалевидным хвостом длиной 1,5-2,0 см.

Физиолого-биохимические свойства

Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания составляет 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислоты без образования газа, закисляет среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует лактозу, арабинозу, эскулин, вариабельно - галактозу. Не ферментирует мальтозу, фруктозу, мелецитозу, сахарозу, салицин, трегалозу, маннитол, рамнозу, маннозу, раффинозу, целлобиозу, сорбитол, на уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.

Генотипирование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272010 и EU 272016.

Культуральные свойства

Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.

Таблица 1
Показатели содержания бифидобактерий и органических кислот при культивировании штамма В. pseudocatenulatum OV-2 на разных средах выращивания
Питательная среда	КОЕ/мл	°T
Среда для культивирования бифидобактерий (БС)	5,0×109	178
МРС	5,6×l09	205
Гидролизатно-молочная среда	6,0×l0 9	210
Печеночная среда	5,8×10 9	210
Молоко восстановленное обезжиренное	2,0×10 8	38

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. pseudocatenulatum OV-2 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10 КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко не сквашивает; при культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 36-38°Т.

Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот в процессе культивирования представлены в таблице 2.

Таблица 2
Динамика культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-2
Время выращивания после посева, (час)	Культивирование на обезжиренном восстановленном молоке	Культивирование на БС
°T	КОЕ/мл	°T	КОЕ/мл
0	18	5,0×106	44	2,1×10 6
2	18	6,0×106	48	3,0×10 6
4	20	7,5×106	52	2,0×10 7
6	20	1,1×l07	60	1,1×10 8
8	20	1,2×107	60	1,5×10 8
10	24	1,1×107	96	1,5×10 8
14	26	5,0×l07	102	1,6×10 8
16	28	5,0×107	100	5,0×10 8
18	30	1,0×108	150	1,0×10 9
20	32	1,0×108	172	1,0×10 9
22	37	1,2×108	174	1,2×10 9
24	38	2,0×108	178	5,0×10 9
30	38	2,0×108	178	5,0×10 9

Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.

Таким образом, штамм В. pseudocatenulatum OV-2 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями.

Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (таблица 3).

Таблица 3
Антагонистическая активность штамма В. pseudocatenulatum OV-2
№	Штамм тестируемого микроорганизма	Зона задержки роста в присутствии штамма В. pseudocatenulatum OV-2, мм
1.	Staphylococcus aureus ATCC 6538-P	23±3
2.	Shigella flexneri 337	28±5
3.	Shigella sonnei 177	25±5
4.	Proteus vulgaris 1274	27±0
5.	Escherichia coli 157	18±5

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. pseudocatenulatum OV-2 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.

Чувствительность к антибиотикам штамма В. pseudocatenulatum OV-2 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4
Антибиотикочувствительность штамма В.pseudocatenulatum OV-2
№	Наименование антибиотика	Интерпретация зон, мм	Содержание препарата в диске, мкг	Диаметр зоны ингибирования роста, мм
Устойчив	Промежуточно устойчив	Чувствителен
1	Бензилпенициллин	19	20-27	28	10	38±2
2	Оксациллин	10	11-13	14	10	23±1
3	Ампициллин	10	11-14	16	10	35±2
4	Карбенициллин	14	15-18	19	25	35±0
5	Азлоциллин	13	14-16	16	75	40±3
6	Цефалотин	14	15-18	19	30	40±2
7	Цефалексин	14	15-18	19	30	32±2
8	Цефазолин	14	15-18	19	30	32±2
9	Цефтазидим	14	15-17	18	30	30±0
10	Цефотаксим	14	15-20	21	30	35±2
11	Имипенем	13	14-15	16	10	35±2
12	Стрептомицин	16	17-19	20	30	8±0
13	Неомицин	12	13-16	17	30	10±0
14	Канамицин	14	15-18	19	30	0±0
15	Гентамицин	12	13-14	15	10	10±0
16	Амикацин	14	15-16	17	30	0±0
17	Тетрациклин	16	17-21	22	30	30±2
18	Доксициклин	15	16-19	20	10	30±2
19	Эритромицин	17	18-21	22	15	32±2
20	Азитромицин	13	14-17	18	15	28±2
21	Кларитромицин	13	14-17	18	15	35±3
22	Рокситромицин	13	15-18	19	30	35±2
23	Линкомицин	19	20-23	24	15	35±2
24	Клиндамицин	14	15-20	21	2	40±2
25	Ванкомицин	14	15-16	17	30	25±0
26	Хлорамфеникол (левомицитин)	15	16-18	19	30	35±2
27	Рифампицин	12	13-15	16	5	35±0
28	Полимиксин	11	12-14	15	300 ед	0±0
29	Налидиксовая кислота	12	13-17	18	30	8±0
30	Ципрофлоксацин	15	16-20	21	5	22±2
31	Пефлоксацин	14	15-21	22	10	15±0
32	Ломефлоксацин	18	19-21	22	10	18±0

Как видно из таблицы 4, штамм В. pseudocatenulatum OV-2 устойчив к полимиксину, амикацину, канамицину, промежуточно устойчив к стрептомицину, неомицину, налидиксовой кислоте, гентамицину, пефлоксацину, ломефлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.

Безвредность

В опыте изучения острой токсичности штамма В. pseudocatenulatum OV-2 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5х10⁷ КОЕ на животное гибели мышей не отмечено.

Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. pseudocatenulatum OV-2 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 10⁹ КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.

Представленные данные изучения штамма В. pseudocatenulatum OV-2 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.

Пример 1. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 ^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.

Пример 2. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 ⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10^6-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.

Пример 3. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения бактерийного препарата.

1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10^7-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.

2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10^6-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).

3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).

4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 ⁹ КОЕ/мл бифидобактерий.

К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при - 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10⁸ КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.

Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10⁹ КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси, из расчета получившейся массы, добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы № 0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 10 КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.

Пример 5. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения гигиенических и косметических средств.

Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. pseudocatenulatum OV-2 с содержанием бифидобактерий не менее 10⁹ КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.

Литература

1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.

2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, № 1-2, с.31.

3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., ж. Микробиол., 1968, № 7, с.55.

4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.

5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, № 5, с.9-12.

6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. /Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.

7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004, 52 с.

8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. /Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, № 5, с.76-79.