Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза

Классы МПК:A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела
A61P31/06 для лечения туберкулеза
C12N5/08 клетки или ткани человека
Автор(ы):, , , , ,
Патентообладатель(и):Закрытое акционерное общество "Томские клеточные технологии" (ЗАО "Томские клеточные технологии") (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-05-19
публикация патента:

Изобретение касается способа получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза. Сущность изобретения заключается в активации in vitro мононуклеарной фракции лейкоцитов, выделенных из крови пациента, больного туберкулезом, путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина. После центрифугирования отмывают собранные из ннтерфазы мононуклеары, ресуспендируют в культуральной среде DMEM и культивируют в этой среде с добавлением Туберкулина и Ронколейкина. Затем подсчитывают клетки, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют при концентрации 5% углекислого газа, после чего клетки ресуспендируют в физрастворе с Ронколейкином. Использование способа позволяет получить высокоэффективную аутологичную вакцину для лечения туберкулеза. 3 табл.

Изобретение откосится к способу получения аутологичной клеточной вакцины против возбудителя туберкулеза.

Развитие медицины в последние два десятилетия охарактеризовано глобальными достижениями в понимании механизмов иммунной защиты организма, принципиально новыми подходами к лекарственному воздействию на нее при наиболее распространенных заболеваниях. Широко распространенное во фтизиатрии индивидуально необоснованное назначение иммуномодулирующих препаратов на основе общих представлений о природе иммунодефицита при туберкулезе легких лишь в половине случаев обусловливает иммуностимулирующий эффект, в других случаях оказывает прямо противоположное негативное действие. Несмотря на повышенный интерес исследователей к проблеме лекарственно-резистентного туберкулеза, в имеющейся литературе недостаточно сведений, касающихся особенностей иммунопатогенеза лекарственно-устойчивых форм распространенного деструктивного туберкулеза легких. Между тем, немногочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями установлено, что характер специфического воспаления а, вероятно, и иммунологическая реактивность организма во многом зависят от биологических свойств поражающего штамма М.tuberculosis. Так, комплексный анализ параметров иммунного статуса у больных с различными клиническими формами распространенного деструктивного туберкулеза легких позволил сделать, вывод о том, что при данной патологии имеется дефект Т-клеточного звена иммунитета. В основе его развития при лекарственно-чувствительном и лекарственно-резистентном вариантах инфекции лежат как сходные (угнетение пролиферации, секреции Т-активирующих цитокинов, активация апоптоза), так и различающиеся механизмы. В первом случае - свободно-радикальное повреждение лимфоцитов в условиях декомпенсированной клеванной активации факторов антиоксидантной защиты, во втором - делеция реактивных клонов клеток на фоне развивающейся иммунологической толерантности и нарастающей анергии. Эти данные могут быть интересны не только с теоретической точки зрения, но и с позиций иммунокоррекции выявленных нарушений.

Одним из возможных направлений в иммунотерапии туберкулеза является применение Т-клеток, предварительно «обученных» в присутствии антиген-активированных дендритных клеток. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-презентирующими клетками, которые обеспечивают наиболее эффективное представление различных антигенов и активацию Т-клеток. ДК, расположенные в воздухоносном эпителии и паренхиме легких, находятся в «незрелом» состоянии, неспособном к стимуляции Т-лимфоцитов, но обладают свойством специализации к захвату антигена. После взаимодействия с патогеном или продуктами воспаления ДК могут мигрировать в лимфоидные органы для осуществления Т-клеточного ответа. ДК, полученные из моноцитов, культивированные с М.tuberculosis, обладают высокой способностью к стимуляции Т-клеточной пролиферации и секреции цитокинов. Однако при непосредственном введении зрелых антиген-активированных ДК не исключена вероятность их повторного взаимодействия с компонентами клеточной стенки микобактерий, стимулирующими секрецию иммуносупрессорного цитокина ИЛ-10, который может ингибировать развитие клеточного ответа на микобактерий, подавляя секрецию ИЛ-12 ДК. Поэтому правильнее проводить совместное культивирование ДК с Т-клетками, в процессе которого происходит активация клеточного варианта иммунного ответа. Одним из факторов, «запускающих» активацию иммунного ответа по клеточному пути, является ИЛ-2. Он является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов и NK-клеток, повышает функциональную активность Т-хелперов, стимулирует выработку ими эндогенного способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 -ИНФ, уменьшает их спонтанный апоптоз. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразование, увеличивает функциональную активность фагоцитов, улучшает процесс презентации и элиминации антигенов. В уже проводимых исследованиях in vitro было выявлено, что введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с ИЛ-2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цитокина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными.

В этой связи есть основание полагать, что использование вакцины на основе мононуклеарных клеток, «обученных» антиген-активированными ДК, может быть эффективным подходом к восстановлению специфического иммунного ответа in vivo у больных туберкулезом легких.

Известен способ получения клеточной вакцины для лечения туберкулеза, сущность которого заключается в инфицировании алло- и ксеногенных макрофагов и клеток макрофагальных клеточных линий патогенным штаммом M.tuberculosis. После чего макрофаги обрабатываются лекарственными средствами, вызывающими гибель микобактерий. Затем клетки подвергаются воздействию гамма-облучения, приводящего к их гибели путем апоптоза. Полученной вакциной иммунизируются резистентные и чувствительные к туберкулезу линии животных, и осуществляется поствакцинальный контроль над показателями, свидетельствующими об активации иммунного ответа. Вакцинация приводила к активации иммунного ответа. Однако вакцина, полученная данным способом, содержит чужеродные организму клетки, что может послужить причиной развития поствакцинальной аллергической реакции.

Техническая задача изобретения - получение высокоэффективной аутологичной вакцины для лечения туберкулеза.

Для решения поставленной задачи в способе получения вакцины против туберкулеза. включающем выделение мононуклеарных клеток и их последующую инактивацию, монуклеарные клетки выделяют из крови пациента больного туберкулезом путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина при соотношении крови и градиента 2:1, центрифугируют в течение 40-45 минут при скорости 1500 об/мин двукратно отмывают собранные из интерфазы мононуклеары центрифугированием в фосфат-забуференном физиологическом растворе при 1500 об/мин в течение сначала 15, а затем 10 минут, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды DMEM, в 100 мл которой содержится 10% FCS; 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 5×10-5 М меркаптоэтанола, 2,5 мг/мл гентамицин, 100 ЕД/мл Ронколейкина, 500 ТЕ/мл Туберкулина, производят подсчет клеток в камере Горяева, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С и СО2- инкубаторе при концентрации 5% СО2, после этого однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15 минут, ресуспендируют а 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ/мл Ронколейкина.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение вакцины

Пациенту производят гемоэксфузию в объеме 100 мл из периферической вены в контейнер с 4 мл гепарина (10 тыс.ЕД). Для выделений мононуклеарных клеток (МНК) наслаивают на градиент плотности фиколл-урографина (способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 1.077 г/см) из расчета 8 мл крови на 4 мл градиента (2:1) и центрифугируют в центрифужных пробирках в течение 40-45 минут при скорости 1500 оборотов в минуту. Собранные из интерфазы мононуклеары двукратно отмывают центифугированием фосфат-забуференным физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15, а затем 10 минут. Далее, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды (состав среды DMEM на 100 мл: FCS 10%, HEPES 5 мМ, глутамин 2 мМ, меркаптоэтанол 5×10-5 M, антибиотик, например, гентамицин 2,5 мг/мл, Ронколейкин 100 ЕД/мл, Туберкулин 500 ТЕ/мл), производят подсчет клеток в камере Горяева. После чего клетки доводят до концентрации 2 млн в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С, 5% СО2 (в CО2- инкубаторе). После культивирования МНК собирают и однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин, 15 минут, ресуспендируют в 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ Ронколейкина.

Режим обработки крови для получения вакцины подобран эмпирически и основан на следующем: первым этапом в создании вакцины является выделение мононуклеарной фракции лейкоцитов из крови пациента. Затем клетки переносятся в среду с добавлением туберкулина и ронколейкина, в результате чего культивируются антиген презентирующие клетки (дендритные клетки) и активированные лимфоциты. Туберкулин является белковым экстрактом микобактерии туберкулеза и используется в качестве антигена для активации дендритных клеток. Ронколейкин, рекомбинантный ИЛ-2, является полным структурным и функциональным аналогом эндогенного ИЛ-2. В организме ИЛ-2 способствует пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, стимулирует клональную пролиферацию В-лимфоцитов и антителообразозание, увеличивает функциональную активность фагоцитов и клеток натуральных киллеров (NK-клеток). Этот цитокин участвует в регуляции иммунного ответа и направляет его по Т-хелпер 1 - клеточному пути развития. Введение ронколейкина в среду для культивирования способствует запуску и развертыванию клеточного иммунного ответа, который является наиболее эффективным в борьбе с микобактерией туберкулеза.

Пример 2.

Оценка специфических показателей вакцины.

В работе использовалась гепаринизированная венозная кровь пациентов, больных туберкулезом, получающих стандартную терапию на базе ГУЗОО «Клинический противотуберкулезный диспансер», г.Омск (n=18).

Для анализа фенотипических характеристик дендритных клеток использовались моноклональные антитела anti-CD83-PE (BD Pharmingen), anti-CD86-FITC (BD Pharmingen), anti-HLA-DR-FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Признаком функциональной зрелости дендритных клеток считалось повышение уровня экспресии вышеперечисленных маркеров по сравнению с незрелыми ДК (нДК).

Фенотипические характеристики дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови пациентов, больных туберкулезом (n=18), приведены в Таблице 1, где * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с незрелыми дендритными клетками.

Через 72 часа созревание нДК приобретают фенотип зрелых дендритных клеток (зДК), увеличивая экспрессию CD83+CD86+HLA-DR+.

Для определения эффективности модуляции противотуберкулезного иммунного ответа оценивалась пролиферативная активность мононуклеарных клеток (MHК) с использованием системы APO-BRDU Flow Kit на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Тестирование проводилось через 72 часа культивирования MНК активированными зДК в ответ на специфический антиген M.tuberculosis - туберкулин.

Результаты приведены в таблице 2 (Пролиферативный ответ мононуклеарных клеток пациентов, больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК (n=18), * - различия достоверны (p<0.05) по сравнению с группой МНК).

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что антиген-активированные дендритные клетки повышают пролиферативную активность мононуклеарных клеток больных туберкулезом in vitro.

Для определения эффективности ответа на специфический антиген М.tuberculosis (туберкулин) оценивали количество клеток, продуцирующих IFN-способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 , с использованием системы BD FastImmune Cytokine на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciense). Определение уровня продукции IFN-способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 в культуральных супернатантах МНК проводили с помощью иммуноферментного анализа («Вектор-Бест») через 72 часа культивирования МНК активированных зДК. Под действием аутологичных антиген-активированных дендритных клеток больных туберкулезом легких достоверно повышается количество IFN-способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 -секретирующих клеток и уровень продукции цитокина монокуклеарными клетками в ответ на туберкулин по сравнению с клетками исходной популяции. Данные представлены в таблице 3. (Продукция IFN-способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 MHК пациентов, больных туберкулезом, культивированных с антиген-активированными ДК (n=18), * - различия достоверны (р<0.05) по сравнению с группой МНК).

Для определения потенциальной цитотоксической активности лимфоцитов определялось содержание клеток, экспрессирующих внутриклеточный белок перфорин, с помощью соответствующих моноклональных антител anti-perforin-PE (BD Pharmingen) через 72 часа культивирования МНК, активированных зДК, в ответ на туберкулин. Повышение количества перфорин-позитивных клеток служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения М.tuberculosis in vivo.

Содержание перфорин-позитивных клеток в популяции МНК составило 18,21±0.9% на 100 тыс. клеток исходной популяции и 37,37±1,83% - для популяции МНК + зДК.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде среднего и ошибки среднего при p<0,05. Статистическая достоверность различий определялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 6.0.

Табл.1
Уровень экспрессии маркеров (% позитивных клеток) Стадия развития ДК
Незрелые ДК (%) Зрелые ДК (%);
CD 83+/CD 86+18,59±1,05 31,33±1,56*
CD 83+/HLA-DR +7,67±0,45 22,26±1,12*

Табл.2
ГруппыСпонтанный пролиферативный ответ, % Туберкулин -стимулированный пролиферативный ответ, %
МНК 10,09±0,65 13,03±0,71
МНК + ДК

(без антигена)
21,27±2,81 27,14±2,54
МНК + ДК

(с антигеном)
27,41±1,45* 46,75±2,3*

Табл.3
способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 Количество IFN-способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 -продуцирующих клеток, % Содержание IFN-способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 в супернатантах МНК, пг/мл
способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза, патент № 2372936 Спонтанное Туберкулинстимулированное Спонтанное Туберкулинстимулированное
МНК32±1,3 64±3,2 65±3,25135±6,75
МНК + ДК

(без антигена)
81±14,0597±15,1 105±15,25 381±49,05
МНК + ДК

(с антигеном)
84±4,02*161±8,15* 618±30,91* 885±44,25*

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность индукции специфического противоинфекционного иммунного ответа при туберкулезе с помощью антиген-активированных дендритных клеток и «обученных» мононуклеарных клеток in vitro. Совместное культивирование специфических аутологичных дендритных клеток и мононуклеарных клеток больных туберкулезом легких приводит к активации мононуклеарных клеток, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, увеличении количества цитотоксических клеток и повышении их функциональной активности. Преимуществами данной вакцины является использование аутологичных клеток пациента, что обеспечивает индивидуальный подход к лечению заболевания и нивелирует развитие побочных реакций на вакцинацию. Полученная вакцина устраняет дефекты иммунного ответа, возникающие при длительной персистенции микобактерий туберкулеза в организме как на стадии презентации антигена и дифференцировки антиген представляющих дендритных клеток, так и на стадии активации основного клеточного варианта развития иммунного ответа, а также дополнительно гуморального. Таким образом, полученную предлагаемым способом вакцину можно рекомендовать для лечения больных туберкулезом путем внутривенного капельного введения с физраствором.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения вакцины против туберкулеза, включающий выделение мононуклеарных клеток и последующее их инактивирование, отличающийся тем, что мононуклеарные клетки выделяют из крови пациента, больного туберкулезом, путем наслаивания на градиент плотности фиколл-урографина при соотношении крови и градиента 2:1, центрифугируют в течение 40-45 мин при скорости 1500 об/мин, двукратно отмывают собранные из интерфазы мононуклеары центрифугированием в фосфат-забуференном физиологическом растворе при 1500 об/мин в течение сначала 15, а затем 10 мин, ресуспендируют в 1 мл культуральной среды DMEM, в 100 мл которой содержится 10% FCS, 5 мМ HEPES, 2 мМ глутамина, 5·10-5 М меркаптоэтанола, 2,5 мг/мл гентамицина, 100 Ед/мл Ронколейкина, 500 ТЕ/мл Туберкулина, производят подсчет клеток в камере Горяева, разбавляют до концентрации 2 млн клеток в 1 мл и культивируют в течение 3-5 суток при 37°С в СО 2-инкубаторе при концентрации 5% СО2, после этого однократно отмывают центрифугированием с физиологическим раствором при 1500 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в 400 мл физраствора в сочетании с 500 ТЕ Ронколейкина.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2372936

patent-2372936.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела

Патенты РФ в классе A61K39/00:
лекарственное средство для лечения патологического синдрома и способ лечения острых и хронических заболеваний дыхательноый системы и синдрома кашля -  патент 2529783 (27.09.2014)
холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины -  патент 2529772 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины -  патент 2528878 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)
рекомбинантная вакцина на основе инактивированного вирусного вектора -  патент 2528750 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
антагонисты pcsk9 -  патент 2528735 (20.09.2014)
способ лечения больных с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела -  патент 2528641 (20.09.2014)

Класс A61P31/06 для лечения туберкулеза

Патенты РФ в классе A61P31/06:
способ лечения больных туберкулезом легких с сопутствующими неспецифическими бронхитами -  патент 2526121 (20.08.2014)
способ комплексной терапии впервые выявленного туберкулеза легких -  патент 2525580 (20.08.2014)
лекарственное средство для лечения туберкулеза -  патент 2523792 (27.07.2014)
сокристаллическая форма фенбуфена -  патент 2521572 (27.06.2014)
способ лечения больных деструктивными формами туберкулеза легких -  патент 2521197 (27.06.2014)
способ получения композиции рифабутина с повышенной биодоступностью, фармацевтическая композиция и способ лечения микобактериозов -  патент 2520603 (27.06.2014)
селективные противотуберкулезные агенты, представляющие собой 3-аминозамещенные 6-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразины -  патент 2519218 (10.06.2014)
способ лечения больных хроническими формами туберкулеза легких -  патент 2519140 (10.06.2014)
бициклические нитроимидазолы, ковалентно соединенные с замещенными фенилоксазолидинонами -  патент 2504547 (20.01.2014)
пиридиноилгидразоны диалкил(2-метил-4-оксопент-2-ил) фосфиноксидов, обладающие противотуберкулезной активностью -  патент 2498990 (20.11.2013)

Класс C12N5/08 клетки или ткани человека

Патенты РФ в классе C12N5/08:
применение окиси углерода для улучшения результата тканевой и органной трансплантации и подавления апоптоза -  патент 2376997 (27.12.2009)
способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток -  патент 2375448 (10.12.2009)
клеточная линия меланомы человека mel gus, используемая для получения противоопухолевых вакцин -  патент 2373280 (20.11.2009)
клеточная линия меланомы человека mel ch, используемая для получения противоопухолевых вакцин -  патент 2373279 (20.11.2009)
способ получения индуцирующих воспринимаемость трансплантата клеток моноцитарного происхождения, способ получения фармацевтической композиции для подавления реакций отторжения трансплантата, индуцирующие воспринимаемость трансплантата клетки моноцитарного происхождения, клеточный препарат для индукции воспринимаемости трансплантата, фармацевтическая композиция для подавления реакций отторжения трансплантата, применение индуцирующих воспринимаемость трансплантата клеток (варианты), способ получения и/или размножения регуляторных т-лимфоцитов, гибридомная клеточная линия, антитело и применение антитела -  патент 2370535 (20.10.2009)
способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой инженерии в зоне ишемии миокарда -  патент 2366706 (10.09.2009)
способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени -  патент 2366704 (10.09.2009)
способ повышения функциональной активности сетчатки при ее патологии различного генеза -  патент 2364382 (20.08.2009)
линия клеток меланомы человека kg, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор -  патент 2362805 (27.07.2009)
способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток пациента ex vivo -  патент 2360965 (10.07.2009)

Наверх