способ лечения глубокого ожога кожи

Формула изобретения

Способ лечения глубокого ожога кожи путем нанесения на раневую поверхность биодеградируемого материала, содержащего аллогенные культивированные фибробласты фетусов животного, отличающийся тем, что в качестве биодеградируемого материала на ожоговую поверхность кожи глубиной ШБ степени наносят губчатую композицию, приготовленную из 2%-ного раствора ацетата коллагена, 2%-ного раствора ацетата хитозана молекулярной массы 100-700 кДа и степенью дезацетилирования свыше 95%, в который на один грамм сухого хитозана добавлены: аскорбиновая кислота 1,8 г, хондроитинсерная кислота 5-100 мг, D-глюкуроновая кислота 10-100 мг, гепарин 2,5-5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» 11-220 мкг.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к комбустиологии, и может быть использовано для местного полноценного восстановления дермального слоя при глубоком ожоге кожи III-Б степени.

Известны способы местного лечения ожогов с использованием раневых покрытий на основе биодеградируемых биополимеров, таких как покрытие для ран, в состав которого входит коллаген, хитозан, полисахарид растительного происхождения, латекс, каучук [1]. Известна повязка для лечения ран [2], представляющая собой перфорированную пленку и содержащая хитозан из панцырей краба в виде соли органической кислоты (уксусной, янтарной или гликолевой), глутаровый альдегид, поливиниловый спирт и биологически активную добавку. Известно биополимерное покрытие для лечения ран «Коллахит», содержащее хитозан, бычий коллаген, сшитый с помощью 0,1-10% глутарового альдегида или глиоксаля. Покрытие дополнительно может содержать антисептические препараты, например, фурагин в количестве от 0,5 до 5% к массе композиции, анестетики, например, анилокаин в количестве от 3 до 5% к массе композиции [3].

Однако указанные способы лечения глубоких ожогов нецелесообразны. Так, при степени ожога кожи IIIБ утрачиваются все слои кожного покрова, восстановление которых из клеточных и неклеточных структур из одной соединительной ткани невозможно. Поэтому применение указанных раневых покрытий при местном лечении глубоких ожогов для полноценного восстановления кожного дефекта неэффективно.

Известен способ лечения глубоких ожоговых ран [4] с помощью перфорированного пленочного перевязочного материала, содержащего смесь антибиотиков. В качестве пленочного перевязочного материала используют перевязочный материал, содержащий ряды отверстий, образующих прямоугольники сплошной поверхности с размерами сторон 100 и 200 мм, при этом отверстия выполнены прямоугольными формами с размерами сторон 1 и 3-5 мм на расстоянии 1 мм, лечение ожоговых ран проводят сначала до полного удаления некротических масс и образования грануляций, а затем щадящее дерматомное удаление грануляций и аутодермопластику. После аутодермопластики кожными трансплантатами и закрытия донорских ран дальнейшее лечение проводят с помощью перфорированного пленочного перевязочного материала.

Однако использование данного способа ограничивается площадью ожоговых ран, при которых есть необходимость в потребности донорских ресурсов кожи, кроме того, включение антибактериальных средств в раневое покрытие не исключает развитие антибиотикорезистентности госпитальной микробной флоры и формирование местных и общих аллергических реакций. Отсутствие в раневых покрытиях клеточного микроокружения для восстановления утраченных элементов дермы при ожоге IIIБ степени не может по своей сути сформировать дермальный слой кожи и полноценно восстановить кожный дефект. В состав пленочного не биодеградируемого перевязочного материала не входят строительные элементы, участвующие в восстановлении дермального слоя кожи.

Наиболее близким к заявляемому способу лечения глубоких ожогов являются способы с использованием культивированных фибробластов [5], эмбриональных фибробластов и фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток (ФМСК) [6], аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, иммобилизируемых на биодеградируемых мембранах [7], с выделением популяции базальных кератиноцитов человека для использования их в аллогенных трансплантатах [8].

Однако указанные способы не имеют универсального носителя клеточных структур, который бы обладал высокой биосовместимостью, создавал оптимальную микросреду для регенерации раны, обладал абсорбционной способностью в отношении раневого экссудата, предотвращал проникновение и развитие микроорганизмов, был проницаемым для паров воды и воздуха, но не высушивал дна раны, был эластичным, моделировал поверхность со сложным рельефом, создавал комфортные условия для жизнеобеспечения и пролиферации биомассы фибробластов.

Задача изобретения - повысить ранозаживляющие свойства раневого покрытия, полноценно восстановить дермальный слой при глубоком ожоге.

Задача достигается тем, что в качестве биодеградируемого материала на ожоговую поверхность кожи глубиной III-Б степени наносят губчатую композицию, приготовленную из 2% раствора ацетата коллагена, 2% раствора ацетата хитозана молекулярной массы 100-700 кДа и степенью дезацетилирования свыше 95%, в который на один грамм сухого хитозана добавлены: аскорбиновая кислота - 1,8 г, хондроитинсерная кислота - 5-100 мг, D-глюкуроновая кислота - 10-100 мг, гепарин - 2,5-5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» - 11-220 мкг, включающую аллогенные культивированные фибробласты, полученные из фетусов животного.

Способ осуществляют следующим образом. Термический ожог кожи моделируют на крысах самцах популяции Wistar массой 180-220 г. В основу положена экспериментальная модель [11] для изучения влияния препарата на процесс заживления глубокого ожога кожи крыс. Животным после удаления волосяного покрова в паравертебральной области спины на уровне ее середины под эфирным наркозом создают контактный термический ожог медной пластинкой с силой в 1,255 Н, нагретой до 220°С. Время экспозиции пластины составляет 14 с с глубиной ожога IIIБ степени (определяют на гистологическом срезе ткани кожи). Для вычисления процентного соотношения ожоговой поверхности к общей площади тела у крыс используют формулу, предложенную Lee (1929), в модификации формулы Мее - Рубнера: S=К×W^0,60, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах. Площадь ожоговой раны в эксперименте составляла 12 см² (4-5% от общей поверхности кожи крысы). День нанесения ран животным считают нулевым. Животным на 2-й день после снятия ожогового струпа на ожоговую поверхность IIIБ степени проводят аппликацию раневого покрытия, приготовленного из 2% раствора ацетата коллагена, 2% раствора ацетата хитозана молекулярной массы 100-700 кДа и степени дезацетилирования свыше 95%, полученного из клешней камчатского краба), содержащего в своем составе на один грамм сухого хитозана аскорбиновую кислоту - 1,8 г, хондроитинсерную кислоту - 5-100 мг, D-глюкуроновую кислоту - 10-100 мг, гепарин - 2,5-5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» - 11-220 мкг, включающего имплантированные и культивированные аллогенные фибробласты в кондиционированной среде, полученные из фетусов животного.

Животным контрольной группы на ожоговую поверхность наносили губчатое раневое покрытие с кондиционированной средой, не содержащее аллогенные фибробласты. Раневое покрытие не удаляют до полного заживления раневой поверхности. Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляют 3, 7, 13, 16 и 30 суток с момента травмы после забора тканей ожоговой раны.

Анализ раневой ожоговой поверхности проводили с помощью иммуногистохимических реакций по стандартному стрептавидин-биотин-пероксидазному методу с моноклональными и поликлональными антителами ("Novocastra", Великобритания). Использовали следующие моноклональные и поликлональные антитела: Ki-67 (оценка воспаления и процессов репарации, маркер пролиферативной активности клеток), металлопротеиназа-9 (ММР-9) и металлопротеиназа-2 (ММР-2) (оценка ремоделирования внеклеточного соединительнотканного матрикса, деструкция его компонентов), CD68 (экспрессия в цитоплазме моноцитов, макрофагов, маркер активации), TGF ₁ (трансформирующий фактор роста ₁, оценка процессов репарации, фиброгенный фактор), коллагены IV и VII типов (оценка ремоделирования внеклеточного матрикса, составные компоненты базальных мембран),

Срезы, наклеенные на поли-L-лизиновые стекла, после депарафинирования подвергали микроволновой обработке в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) в течение 15 минут для демаскировки антигенов. Блокирование эндогенной пероксидазной активности осуществляли 3% водным раствором перекиси водорода. Для избежания неспецифической адсорбции первичных антител проводили инкубацию с нормальной неиммунной сывороткой в течение 15 минут. Инкубацию проводили при температуре 25°С в течение 30 минут. После каждой процедуры обработки срезы промывали в трис HCL буфере - 0,05М, рН 7,6. Хромогеном служил диаминобензидин (ДАБ), гистологические срезы для обзорного анализа докрашивали гематоксилином и эозином, для выявления коллагеновых волокон по Ван-Гизону, для изучения аргирофильных структур использовали импрегнацию солями азотнокислого серебра.

При исследовании микропрепаратов анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили отдельно в краях ожоговой раны и в зоне повреждения. При локализации продуктов реакций в клетках количественная оценка результатов реакций включала определение доли (%) окрашенных клеток и интенсивности их окрашивания по трехбалльной шкале. Интенсивность окраски: 0 - нет окрашивания, 1 балл - слабое окрашивание (+ слабая реакция), 2 балла - умеренное окрашивание (++ умеренная реакция), 3 балла - интенсивное окрашивание (+++ выраженная реакция). Неокрашенные, слабо окрашенные, умеренно окрашенные и сильно окрашенные структуры в каждом случае подсчитывали в ядрах 100 стромальных или эпителиальных клеток в трех различных полях зрения при увеличении ×400. Интенсивность реакции определяли по формуле

ИГХ реакция = P(i)·i,

где i - интенсивность окрашивания в баллах от 1 до 3; P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Полученные цифровые данные трактовали следующим образом: от 1 до 100 - слабая реакция; от 101 до 200 - умеренная; от 201 до 300 - выраженная. Результаты иммуноморфологического исследования на ММР-9, MMP-2, TGF ₁, коллаген IV типа оценивали по степени выраженности окраски клеток и экстрацеллюлярного матрикса по трехбалльной системе (0 - нет окрашивания, 1 балл - слабое окрашивание (+ слабая реакция), 2 балла - умеренное окрашивание (++ умеренная реакция), 3 балла - интенсивное окрашивание (+++ выраженная реакция). В каждом гистологическом срезе исследовали не менее 25 полей зрения при увеличении микроскопа ×400.

Морфометрию со статистической обработкой полученных результатов производили при помощи светового микроскопа "Leica DMLB" и анализатора изображения "Q550IW", снабженного программой "Leica Qwin" для статистической обработки.

Для получения аллогенных фибробластов использовали фетусы крыс (7-10-й день беременности).

Результаты исследования. Опытная группа животных показала существенное ускорение репаративных процессов в ожоговой ране. При гистологическом анализе выявляются изменения, манифестирующие выраженную биологическую активность раневого покрытия в отношении эпителиального и стромально-сосудистого компонента кожи. Это подтверждалось стимуляцией пролиферации и кератинизации эпидермоцитов, активацией ангиогенеза в центральных и периферических зонах ожога, ранней активацией моноцитарно-макрофагальных CD68 маркеров в течение первого этапа заживления. При этом регистрировалась интенсивная по сравнению с контролем экспрессия трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF- 1) и Ki67 маркера пролиферативной активности фибробластов. В область термического повреждения более активно мигрировали фибробласты. Их пролиферация сопровождалась выработкой компонентов внеклеточного матрикса и деградацией некротизированных тканей. Снижение экспрессии матриксных металлопротеаз в присутствии опытного раневого покрытия указывает на супрессию деструктивных процессов внеклеточного матрикса. При этом отмечается усиленный синтез компонентов внеклеточного матрикса с образованием неостромы, служащей адгезивной матрицей для вновь образующегося эпителия. Выявленные особенности сочетались с более активной продукцией волокнистых структур (коллагенов IV и VII типов), что указывало на полноценное и быстрое формирование базальных мембран сосудов сосочкового слоя и эпидермиса кожи.

Проведенные исследования указывают на то, что раневое покрытие создает благоприятные условия для пролиферации, дифференцировки эмбриональных аллогенных фибробластов. Раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса, содержащее фибробласты, выделенные из десятидневного эмбриона крысы, показали высокую эффективность при реконструкции утраченной кожи в эксперименте.

Пример эксперимента.

Термический ожог кожи моделировали на 30 крысах-самцах популяции Wistar, массой 180-220 г. Площадь ожоговой раны составляла 12 см².

При проведении эксперимента животные были разделены на 3 группы по 10 животных: 1) крысы с глубоким термическим ожогом IIIБ степени и применением раневого покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса, содержащего имплантированные аллогенные эмбриональные фибробласты (опыт); 2) крысы с глубоким термическим ожогом IIIБ и применением раневого покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса, не содержащего аллогенные эмбриональные фибробласты, но содержащие кондиционированную среду, в которой культивировались аллогенные эмбриональные фибробласты (контроль 1); 3) крысы с глубоким термическим ожогом IIIБ без применения раневого покрытия с использованием только сухой асептической повязки (контроль 2).

На 2-й день под эфирным масочным наркозом после механического удаления струпа и стандартного туалета ожоговых ран с использованием растворов антисептиков в условиях асептики для животных опытной группы из контейнера с питательной средой извлекали раневое покрытие с эмбриональными фибробластами и моделировали его по контуру, соответствующему размеру и форме раны. Покрытие наносили на рану, прижимали ее ко дну и фиксировали с помощью стерильного марлевого бинта и пластыря. При наложении на рану покрытие выступало за края раны на 0,5-1 см. Для животных группы контроля 1 из контейнера с питательной средой, не содержащей фибробластов, извлекали раневое покрытие и моделировали его по контуру, соответствующему размеру и форме раны идентично опытной группе. Для животных группы контроля 2 использовали асептическую марлевую повязку, смачивали ее в стерильном физиологическом растворе и наносили на ожоговую поверхность. Клиническую оценку результатов производили на основе динамического визуального, планиметрического, иммуногистохимического контроля состояния ожоговой поверхности.

Сроки анализа репарации ожоговой поверхности составляли 3, 7, 13, 16 и 30 суток с момента травмы. Животных, согласно сроку, выводили из опыта, для гистологического анализа забирали сектор ожоговой раны (с захватом центрального и периферического отделов), материал помещали в контейнер с забуференным нейтральным 10% раствором формалина и в течение 24 часов подвергали автоматизированной гистологической проводке на системе Leica (Германия) с заливкой в парафин. Секцию тканей в парафиновых блоках и их окраску осуществляли в стандартных автоматизированных условиях.

Для иммуногистохимического анализа ожоговой поверхности использовали моноклональные антитела к: TGF- -1, CD68⁺, Ki-67, MMP-2, ММР-9 и коллагену IV, VII типов. После проведения иммуногистохимических реакций гистологические срезы для обзорного анализа докрашивали гематоксилином и эозином, для выявления коллагеновых волокон - по методике Ван-Гизона, для изучения аргирофильных структур - по методике импрегнации солями азотнокислого серебра.

Результаты анализа планиметрического исследования показали, что при использовании опытных раневых покрытий с имплантированными аллогенными эмбриональными фибробластами при лечении ожоговой поверхности происходит существенное ускорение процессов заживления, что отражается в сроках полного восстановления кожи (таблица 1).

Таблица 1
Динамика заживления ожоговых ран крыс
	Площадь ран после ожога IIIБ степени (см2)
Сутки наблюдения	Опыт. Раневое покрытие + кондиционированная среда + эмбриональные фибробласты	Контроль 1. Раневое покрытие + кондиционированная среда	Контроль 2. Асептическая повязка + физраствор
3	16,2±1,7 1,3	23,45±0,9*	25,3±0,14
7	11,15±2,121,3	14,75±0,5*	23,15±0,35
13	9,45±0,21 2,4	13,1±0,42**	21,65±0,78
30	3,5±0,51,3	5,25±0,35*	16,7±1,8
Примечания:
1 - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,05);
2 - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,01);
* - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановыми покрытиями в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,05);
** - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) и без применения местного лечения (контроль 2) (Р<0,01);
3 - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и коллаген-хитозановым покрытием в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) (Р<0,05);
4 - достоверность различий при сравнении площадей ожоговых ран после местного лечения коллаген-хитозановым покрытием с имплантированными эмбриональными фибробластами (опыт) и в кондиционированной эмбриональными фибробластами в течение 5 дней среде ДМЕМ (контроль 1) (Р<0.01);

Применение коллаген-хитозановых раневых покрытий с имплантированными аллогенными фибробластами при обширной глубокой ожоговой ране III-Б приводит к формированию прочного раневого струпа, играющего роль наружного барьера, препятствующего суперинфицированию дефектной поверхности. Имеющая место микробная флора мало активизирована, блокирована в коллаген-хитозановой конструкции. Собственно раневая ожоговая поверхность уже в ранние сроки не содержит микробной флоры. Имеет место в сроки 15-20 дней после аппликации раневого покрытия на раны активное формирование краевой пролиферативной реакции эпидермиса, на дне раны формируется слой зрелой и незрелой соединительной ткани, образуется морфологический субстрат будущей тканевой подложки для появления элементов дермы. Активное формирование элементов дермы начинается после 20 суток лечения, имеет место хорошая фибробластная реакция, способная формировать и закрывать дно раны слоем молодой соединительной ткани. В поздние сроки лечения появляется морфологическая волокнисто-клеточная структура, способная сформировать дермальный слой кожи. При использовании для закрытия ожоговой поверхности раневых покрытий очевидна более ранняя реакция продуктивного воспаления как по краям ожогового дефекта кожи, так и в центре обширного ожога, вся поверхность ожогового дефекта выстлана послойно молодой и зрелой грануляционной тканью, содержащей множество вновь образованных микрососудов. Деградация раневого покрытия начинается с 20-х суток. Характерной особенностью является быстрое формирование дермального слоя кожи, содержащего необходимое клеточное микроокружение.

Известно, что TGF стимулирует синтез клетками составных элементов экстрацеллюлярного матрикса, сдерживает его деградацию, известен как мощный фактор, активирующий коллагеносинтетическую функцию фибробластов, ингибирующий пролиферацию большинства эпителиальных клеток.

Достоверное увеличение интенсивности иммунопероксидазной реакции на TGF регистрируется в опыте уже на 7 сутки после ожога в моноцитах и макрофагах дна раны. В этих клетках экспрессия данного фактора роста продолжает опережающе нарастать до 13, а затем до 16 дней, дополняясь в опыте достоверно более высокой ИГХ-реакцией в глубоком слое лейкоцитарного вала, фибробластах, фиброцитах и эндотелии капилляров дна раны. Эти изменения свидетельствуют об активации основных этапов репарации - ограничения пораженного участка, фиброза, активации фагоцитоза и васкулогенеза.

При анализе результатов иммуногистохимических реакций определяется в краях раны положительная реакция на TGF , имеет место окрашивание сайтов связывания антител с фактором в цитоплазме стромальных клеток дермы - фибробластах, фиброцитах. Степень ее выраженности варьирует от слабой до умеренной. Различий между распределением продуктов иммуногистохимической реакции (ИГХР) в сетчатом или в сосочковом слоях нет. В эпидермисе и придатках кожи реакция отрицательная.

Результат ИГХР в струпе отрицательный. В большинстве участков поверхностный и глубокий слои лейкоцитарного вала также не окрашены. Исключение составляют небольшие по протяженности места глубокого слоя полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ), в которых наблюдается положительная реакция на TGF . В подлежащей грануляционной ткани положительная иммунопероксидазная реакция отмечается в цитоплазме фибробластов, фиброцитов, моноцитах/макрофагах и погибших мышечных волокнах. Слабая экспрессия TGF регистрируется в волокнистых структурах грануляционной и более зрелой соединительной ткани в глубине раны. В эндотелии микрососудов в относительно зрелых участках соединительной ткани продукты ИГХР не выявляются. В грануляционной ткани, напротив, клетки эндотелия демонстрируют иммунопозитивное окрашивание.

На седьмые сутки после ожога в группе контроля 1 в эпидермисе, волосяных фолликулах, сальных железах и волокнистых структурах дермы в краях ожоговой раны продукты ИГХР на TGF не выявляются или присутствуют в очень небольшом количестве. Умеренная реакция выявлена в цитоплазме фибробластов и фиброцитов краев раны и в макрофагах ее дна. Лейкоцитарный вал местами в глубоком слое умеренно окрашивается на TGF , оставаясь в ряде участков иммунонегативным. В волокнистых структурах грануляционной и соединительной ткани дна раны экспрессия TGF слабая, имеет очаговый характер (табл.2).

На седьмые сутки после ожога в опытной группе достоверно большая чем в группе контроля 1 интенсивность иммунопероксидазной реакции регистрируется в моноцитах, макрофагах дна раны и погибших мышечных волокнах. В них реакция оценивается как умеренная (табл.2).

Таблица 2
Активность фактора TGF в контрольной и опытной ожоговой ране на 7 сутки после травмы
Структурный элемент	Интенсивность реакции на TGF (от 0 до 3 баллов)
контроль 1	опыт
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов	-	-
Эпителий сальных желез	-	-
Фибробласты дермы	1,6±0,08	1,7±0,08
Волокнистые структуры сосочкового слоя	0,7±0,03	0,8±0,04
Поверхностные отделы сетчатого слоя	0,9±0,04	0,4±0,02
Глубокие отделы сетчатого слоя	1,0±0,05	0,08±0,02
Стенки сосудов	-	-
Базальный слой эпидермиса	-	-
Шиповатый слой эпидермиса	-	-
Зернистый слой эпидермиса	-	-
Роговой слой эпидермиса	-	-
Дно ожоговой раны
Струп	+	+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)	1,6±0,07	1,7±0,07
Макрофаги в дне раны	1,7±0,08	2,1±0,1*
Строма	0,8±0,03	0,9±0,04
Фибробласты	1,2±0,05	1,6±0,07
Эндотелий	0,7±0,03	0,8±0,04
* достоверно различимые показатели в сравнении с контролем.

На тринадцатые сутки после ожога различия между контролем 1 и опытной группами в локализации и количестве продуктов реакции на TGF не выявлены. Вместе с тем, установлены изменения в уровне экспрессии данного фактора по сравнению с предыдущим сроком. Они касаются глубокого слоя лейкоцитарного вала, моноцитов/макрофагов под слоем ПЯЛ, фибробластов, фиброцитов и эндотелия капилляров дна раны, где отмечается статистически достоверное повышение интенсивности ИГХР (табл.3 и 4).

Таблица 3
Активность фактора TGF в контрольной ожоговой ране на 13 сутки после травмы
Структурный элемент	Интенсивность реакции на TGF (от 0 до 3 баллов) (контроль 1)
7 сутки	13 сутки
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов	-	-
Эпителий сальных желез	-	-
Фибробласты дермы	1,6±0,08	1,9±0,08
Волокнистые структуры сосочкового слоя	0,7±0,03	0,9±0,04
Поверхностные отделы сетчатого слоя	0,9±0,04	0,7±0,03
Глубокие отделы сетчатого слоя	1,0±0,05	0,1±0,05
Стенки сосудов	-	-
Базальный слой эпидермиса	-	-
Шиповатый слой эпидермиса	-	-
Зернистый слой эпидермиса	.	>
Роговой слой эпидермиса	-	-
Дно ожоговой раны
Струп	+	+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)	1,6±0,07	2,4±0,08*
Макрофаги	1,7±0,08	2,6±0,1*
Строма	0,8±0,03	1,1±0,05
Фибробласты	1,2±0,05	2,1±0,09*
Эндотелий	0,7±0,03	1,6±0,07*
* достоверно различимые показатели в сравнении со сроком 7 дней в контроле

Таблица 4
Активность фактора TGF в опытной ожоговой ране на 13 сутки после травмы
Структурный элемент	Интенсивность реакции на TGF (от 0 до 3 баллов) (опыт)
7 суток	13 суток
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов	-	-
Эпителий сальных желез	-	-
Фибробласты дермы	1,7±0,08	1,5±0,07
Волокнистые структуры сосочкового слоя	0,8±0,04	0,6±0,03
Поверхностные отделы сетчатого слоя	0,4±0,02	0,4±0,02
Глубокие отделы сетчатого слоя	0,08±0,02	0,3±0,01
Стенки сосудов	-	-
Базальный слой эпидермиса	-	-
Шиповатый слой эпидермиса	-	-
Зернистый слой эпидермиса	-	-
Роговой слой эпидермиса	-	-
Дно ожоговой раны
Струп	+	+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)	1,7±0,07	2,3±0,1*
Макрофаги	2,1±0,1	2,4±0,1*
Строма	0,9±0,04	0,9±0,04
Фибробласты	1,6±0,07	2,3±0,1*
Эндотелий	0,8±0,04	1,7±0,09*
* достоверно различимые показатели в сравнении со сроком 7 дней в опыте

На шестнадцатые сутки после ожога в контрольной группе 1 в эпидермисе, волосяных фолликулах, сальных железах и волокнистых структурах дермы в краях ожоговой раны продукты ИГХР на TGF не выявляются или минимальны. Умеренная, местами выраженная реакция выявлена в цитоплазме фибробластов и фиброцитов. Лейкоцитарный вал в глубоком слое неравномерно умеренно и слабо реагирует с антителами к TGF , оставаясь на многих участках неокрашенным. Высокая интенсивность иммунопероксидазной реакции отмечается в цитоплазме моноцитов, макрофагов, эндотелии капилляров. В последних, имея преимущественно умеренную степень выраженности, она достигает максимума в части клеток. Фибробласты, фиброциты окрашены не на всех участках. Реакция в них оценивается как умеренная, снижаясь до минимальной по направлению вглубь раны. В волокнистых структурах грануляционной и соединительной ткани дна раны экспрессия TGF слабая, имеет очаговый характер (табл.5).

Таблица 5
Активность фактора TGF в контрольной ожоговой ране на 16 сутки после травмы
Структурный элемент	Интенсивность реакции на TGF (от 0 до 3 баллов) (контроль 1)
13 сутки	16 сутки
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов	-	-
Эпителий сальных желез	-	-
Фибробласты дермы	1,9±0,08	2,1+0,1
Волокнистые структуры сосочкового слоя	0,9±0,04	0,5±0,02
Поверхностные отделы сетчатого слоя	0,7±0,03	0,5±0,02
Глубокие отделы сетчатого слоя	0,1±0,05	0,6±0,02
Стенки сосудов	-	-
Базальный слой эпидермиса	-	-
Шиповатый слой эпидермиса	-	-
Зернистый слой эпидермиса	-	-
Роговой спой эпидермиса	-	-
Дно ожоговой раны
Струп	+	+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)	2,4±0,08	1,2+0,06*
Макрофаги	2,6±0,1	2,3+0,07
Строма	1,1±0,05	0,9+0,04
Фибробласты	2,1±0,09	2,3±0,08
Эндотелий	1,6±0,07	2,3±0,07*
* достоверно различимые показатели в сравнении со сроком 13 дней в контроле

На шестнадцатые сутки после ожога в опыте в краях раны положительная реакция на TGF имеет место в цитоплазме стромальных клеток дермы - фибробластов, фиброцитов. Степень ее выраженности оценивается как умеренная - высокая. В эпидермисе и придатках кожи реакция - отрицательная. Различий между распределением продуктов ИГХР в сетчатом или в сосочковом слоях нет.

Струп и поверхностный слой лейкоцитарного вала не окрашены. Глубокий слой ПЯЛ демонстрирует положительную умеренную и выраженную степень реакции на TGF . В подлежащей грануляционной ткани в большом количестве присутствуют клетки моноцитарно-макрофагального ряда. В их цитоплазме имеет место умеренная и выраженная иммунопероксидазная реакция, что достоверно выше, чем в группе сравнения. В цитоплазме фибробластов, фиброцитов, в эндотелии микрососудов также отмечается более высокая, умеренная и выраженная реакция. В волокнистых структурах грануляционной ткани и более зрелой соединительной ткани в глубине раны экспрессия TGF ограничивается слабой - умеренной степенью. Интенсивность реакции в этих элементах по мере удаления от поверхности раны не снижается (табл.6).

Таблица 6
Активность фактора TGF в опытной ожоговой ране на 16 сутки после травмы
Структурный элемент	Интенсивность реакции на TGF (от 0 до 3 баллов)
контроль 1	опыт
Край ожоговой раны
Эпителий волосяных фолликулов	W	-
Эпителий сальных желез	-	-
Фибробласты дермы	2,1±0,1	2,7±0,1*
Волокнистые структуры сосочкового слоя	0,5±0,02	0,7±0,02
Поверхностные отделы сетчатого слоя	0,5±0,02	0,6±0,03
Глубокие отделы сетчатого слоя	0,6±0,02	0,9±0,04
Стенки сосудов	-	-
Базальный слой эпидермиса	-	-
Шиповатый слой эпидермиса	-	-
Зернистый слой эпидермиса	-	-
Роговой слой эпидермиса	-	-
Дно ожоговой раны
Струп	+	+
ПЯЛ под струпом (глубокий слой)	1,2±0,06	2,2±0,0б*
Макрофаги	2,3±0,07	2,8±0,07*
Строма	0,9±0,04	0,8±0,04
Фибробласты	2,3±0,08	2,8±0,08*
Эндотелий	2,3±0,07	2,7±0,08*
* достоверно различимые показатели в сравнении с 16 сутками в контроле

При иммуногистохимическом анализе маркера Ki-67, отражающего величину пролиферативного пула клеток, выявлено, что:

на 7 сутки после ожога достоверных различий между экспрессией этого показателя не выявлено. К 13 суткам после ожога в обеих группах отмечается повышение экспрессии Ki-67 в фибробластах, эндотелии капилляров, макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах дна раны. Более высокая пролиферативная активность регистрируется в непосредственной близости в краях раны в базальном слое эпидермиса. В этой зоне в опытной группе пролиферация эпителия в базальном и частично в шиповатом слоях эпидермиса достоверно выше, чем в контроле. На 16 сутки в обеих группах возрастает экспрессия Ki-67 в макрофагах и эндотелии сосудов в дне раны, что обусловлено необходимостью фагоцитоза погибших тканевых компонентов, активацией иммунных реакций, развитием грануляционной и соединительной ткани. В опыте в этот срок экспрессия Ki-67 фибробластами дна раны, формирующими основные волокнистые структуры внеклеточного матрикса, достоверно выше, чем в контроле.

При иммуногистохимическом анализе маркера CD68⁺ на клетках системы фагоцитирующих мононуклеаров как уникального регулятора клеточных и клеточно-матриксных взаимоотношений в очаге повреждения, включения в воспаление иммунной системы, активации репаративных механизмов, ограничения очага воспаления, определяя морфогенез пиогенной мембраны, осуществления избирательного фагоцитоза поврежденных тканей и регуляции репарации в продуктивную фазу, установлено, что увеличение экспрессии CD68 в моноцитарно-макрофагальных клеточных элементах достигает высоких величин в обеих группах (опыт и контроль 1) к 13 суткам в дне раны, на границе струпа и в подлежащей грануляционной ткани. Однако в опыте происходит их достоверно большее накопление во всех слоях ожоговой раны, опережающее контроль, включая и 16 сутки наблюдения, что может означать ранний переход воспалительного процесса в продуктивную фазу.

Иммуногистохимический анализ маркеров ММР-9 и ММР-2, как основных протеаз, участвующих в процессе заживления раны и эпителизации раневой поверхности, показал, что их активность изменяется по мере заживления ожоговой раны. Снижение активности указанных ферментов совпадает с активацией репаративной стадии. Синтез ММР происходит только в живых клетках. Эти ферменты участвуют в ремоделировании внеклеточного матрикса в течение раневого процесса, активируют превращение латентной формы TGF в активную. ММР-2 действует на протеолитические процессы, ММР-9, действуя на пролиферацию Т-лимфоцитов, обеспечивает иммуносупрессию, стимулирует ангиогенез.

Снижение экспрессии ММР-9 регистрируется на 13 сутки в опытной группе в лейкоцитарном вале под струпом, опережая таковую в контроле, включая и 16 сутки наблюдения. До этого времени различий между группами (опыт и контроль 1) и по срокам с момента нанесения ожога нет. К 16 дню в опыте отмечается существенное угнетение экспрессии ММР-9 в строме и фибробластах грануляционной ткани, соединительной ткани в дне раны. Представляется, что раннее снижение активности деструктивных изменений, вызываемых ММР-9, способствует ускорению репаративных процессов.

Выраженность экспрессии ММР-2 и ее локализация в обеих группах до 16 суток не изменяется. Исключение составляет слой макрофагов в дне раны, граничащий с ПЯЛ, где реакция достоверно выше, чем в контрольной группе.

Коллагены IV и VII типов, являясь компонентами базальных мембран эпителия и сосудов, позволяют судить о завершенности ремоделирования ткани. Достоверные различия между опытной и контроль 1 группами в экспрессии коллагенов IV и VII типов выявляются на 13 сутки. В опыте коллагенизация дна раны наступает раньше и осуществляется активнее до 16 суток. Раньше, чем в контроле, и в большем объеме формируются базальные мембраны микрососудов в созревающей грануляционной ткани, заполняющей дно раны.

Таким образом, применение композиции для лечения глубокого ожога IIIБ степени, содержащей коллаген, хитозан медицинского назначения с молекулярной массой 100-700 kDa и степенью дезацетилирования свыше 95%, глиокозаминогликаны, а также имплантированные аллогенные фибробласты в кондиционированной питательной среде, существенно ускоряет процесс заживления, создавая благоприятные условия для полноценного восстановления дермального слоя кожи.

Литература

1. Патент РФ № 2193895, A61L 15/28, БИПМ № 34 от 2002.12.10.

2. Патент РФ № 2219954, A61L 15/28, БИМП № 36 от 2003.12.27.

3. Патент РФ № 2108114, A61L 15/28. БИМП № 10 от 10.04.98.

4. Патент № 2108078, A61L 15/00. (БИ № 10) 1998.04.10.

5. В.П.Туманов, Л.И.Будкевич // Педиатрия. Журнал им. Г.Н.Сперанского. - 1999. - № 5. - С.13.

6. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Расулов М.Ф. и др. // Вестник хирургии. - 2003. - Т.162, № 4. - С.38-42.

7. Расулов М.Ф., Севастьянов В.И., Егорова В.А. и др. // Патофизиология и экспериментальная терапия. - 2005. - № 2. - С.20-23.

8. Спичкина О.Г., Калмыкова Н.В., Воронкина И.В. // Скорая медицинская помощь. - 2006. - № 3. - С.178-180.

9. Патент РФ № 2254145, A61L 15/28, 15/32, 26/00. БИПМ № 17 от 20.06.2005.

10. Патент РФ № 2252787, A61L 15/28, 15/32, 27/60, БИПМ № 15 от 27.05.2005.

11. Клебановас Ю., Лашас Л., Лашене Д., Пангоните Д. Проблемы эндокринологии, 2005. - № 1. - с.42.