способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина

Классы МПК:C07K1/14 экстракция; разделение; очистка
C07K14/81 ингибиторы протеазы
A61K35/16 плазма; сыворотка
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):ОКТАФАРМА АГ (CH)
Приоритеты:
подача заявки:
2004-08-12
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает следующее. Восстанавливают плазматическую фракцию Коэна IV1. Осуществляют анионообменную хроматографию раствора, содержащего альфа-1-антитрипсина на анионообменном геле, предпочтительно на DEAE Sepharose® fast flow. Полученный элюат концентрируют ультрафильтрацией. Затем дополнительно осуществляют хроматографию на гидрофобном носителе и обработку фракции, содержащей альфа-1-антитрипсин материалом, который содержит иммобилизованную форму гепарина. После чего инактивируют, покрытые липидной оболочкой вирусы, путем добавления детергентов и, необязательно, растворителя. Затем осуществляют высаливание детергентов путем последующего увеличения концентрации соли до способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,5 М. Отделение детергентов и вирусных частиц путем нанофильтрации с размером пор 15-20 нм. Изобретение позволяет повысить частоту получаемого продукта и его безопасность. 3 н. и 14 з.п. ф-лы. способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500

способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500

Формула изобретения

1. Способ очистки альфа-1-антитрипсина (A1AT) из содержащих A1AT

растворов от других белковых компонентов, включающий стадии:

(a) проведения ионообменной хроматографии содержащего А1АТ раствора, причем ионообменную хроматографию выполняют на анионообменном геле;

(b) добавления детергентов и необязательно растворителя для инактивации покрытых липидной оболочкой вирусов;

(c) последующего увеличения концентрации соли до способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,5 М для высаливания детергентов и удаления полученных таким образом частиц путем фильтрации.

2. Способ по п.1, в котором упомянутый содержащий А1АТ раствор получают из плазмы крови или ее фракций, предпочтительно из восстановленной плазматической фракции Коэна IV1, или получают из рекомбинантного или экспрессированного трансгенным путем препарата А1АТ или надосадочной жидкости после ферментации.

3. Способ по п.1, в котором ионообменную хроматографию выполняют на DEAE-Sepharose® или DEAE-Sepharose® Fast Flow.

4. Способ по п.1, в котором упомянутую инактивацию вирусов в соответствии со стадией (b) выполняют путем добавления Triton Х-100, Polysorbate 80 (Tween 80), TnBP и/или каприловой кислоты или каприлата предпочтительно до конечной концентрации способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 мас.% Triton и Tween 80, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,03 мас.% TnBP, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 мМ каприловой кислоты или каприлата с инкубацией в течение способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 ч, предпочтительно способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 1 ч, при способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 4°С, особенно при способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 15°С.

5. Способ по п.1, в котором после стадии (а) дополнительно выполняют хроматографию на гидрофобных хроматографических материалах.

6. Способ по п.1, в котором после стадии (а) дополнительно выполняют обработку содержащей А1АТ фракции материалом, который содержит иммобилизованную форму гепарина (гепариновый гель).

7. Способ по п.1, в котором после стадии (с) выполняют дополнительную стадию инактивации вирусов, предпочтительно пастеризацию в присутствии способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,5М цитрата натрия, аминокислот, сахаров или их смесей.

8. Способ по п.1, в котором ионную силу раствора после стадии (с) предпочтительно уменьшают путем ультрафильтрации/диафильтрации.

9. Способ по п.1, в котором после стадии (с) выполняют отделение вирусных частиц предпочтительно путем нанофильтрации предпочтительно с применением фильтров с размером пор 15-20 нм.

10. Способ по п.1, в котором полученную фракцию А1АТ хранят в виде жидкого, замороженного или лиофилизованного препарата.

11. А1АТ, полученный способом по п.1, с чистотой >90%, активностью способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,8 PEU/мг в своей активной форме, с содержанием IgAспособ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 1 мг/мл, остаточным содержанием детергента < 50 м.д., особенно < 10 м.д., и содержанием мономера > 90% в расчете на общее содержание А1АТ.

12. А1АТ по п.11, полученный способом, включающим следующие стадии:

восстановление плазматической фракции Коэна IV1;

проведение анионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose® Fast Flow;

необязательно, проведение хроматографии на твердой фазе, которая содержит иммобилизованную форму гепарина (хроматографии по сродству к гепарину);

необязательно, проведение хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC);

инактивацию вирусов добавлением способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 мас.% Triton/ способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,03 мас.% TnBP и/или способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 мМ каприловой кислоты или каприлата с инкубацией в течение способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 1 ч при способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 15°С;

добавление соли для увеличения ионной силы раствора и

удаление полученных таким образом частиц путем фильтрации.

13. A1AT по п.12, где затем выполняют дополнительную стадию инактивации вирусов, предпочтительно пастеризацию в присутствии способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,5М цитрата натрия, аминокислот, сахаров или их смесей.

14. A1AT по п.12, где ионную силу раствора предпочтительно уменьшают путем ультрафильтрации/диафильтрации.

15. A1AT по п.12, где осуществляют стадию элиминации или инактивации вируса и/или приона, предпочтительно отделение вирусных частиц путем нанофильтрации предпочтительно при помощи фильтров с размером пор 15-20 нм.

16. A1AT по п.12, где полученную фракцию А1АТ хранят в виде жидкого, замороженного или лиофилизованного препарата.

17. Лекарственное средство для лечения дефицита А1АТ, дегенеративных процессов в легких, таких, как фиброз легких и эмфизема, содержащее А1АТ, полученный способом по п.1, в качестве единственного активного ингредиента или в сочетании с противовоспалительными средствами, предпочтительно со стероидами, нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу получения раствора, содержащего альфа-1-антитрипсин (A1AT), и к A1AT.

A1AT представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 55000 Да и принадлежит к семейству ингибиторов сериновых протеаз. A1AT способен ингибировать активность многих протеаз, например, трипсина, от которого и происходит название этого ингибитора. С точки зрения физиологии эластаза представляет собой протеазу направленного действия, которая участвует, в частности, в процессах реконструкции и разрушения ткани и матрикса и выделяется клетками, такими как гранулоциты, и поэтому вовлечена в воспалительные процессы. Активность эластазы ограничена во времени и в пространстве и регулируется, главным образом, ингибитором A1AT. Дисрегуляция подобной активности приводит к быстрому разрушению ткани и может иметь патофизиологические последствия. Кроме того, возникают и/или активизируются воспалительные процессы. Известным примером пониженной регуляции активности эластазы или ее отсутствия является прогрессирующее местное разрушение ткани легких с сопутствующими симптомами воспаления, которое постепенно приводит к эмфиземе, и поэтому сопровождается, иногда в значительной степени, легочными функциональными расстройствами. На конечном этапе это может привести к смерти больного, избежать которой можно лишь при помощи трансплантации легкого.

Такие больные страдают от отсутствия активности A1AT или пониженной активности A1AT. В норме ингибитор продуцируется в печени и секретируется ею в относительно больших количествах и циркулирует в плазме крови в относительно высоких концентрациях (обычная концентрация составляет 1,3 мг/мл). Кроме того, физиологически эффективные и достаточные концентрации A1AT наблюдаются в органах здоровых людей, конкретно в легочной жидкости (жидкости эпителиальной выстилки). Если концентрация A1AT значительно снижена или функциональная активность имеющегося A1AT снижена или он неактивен (инактивирован), то происходит неконтролируемое разрушение легочной ткани со всеми упомянутыми выше последствиями.

Причинами отсутствия A1AT или недостаточной ингибиторной активности A1AT являются, главным образом, генетические дефекты. Так называемая Z-мутация, в особенности у гомозиготных особей (PiZZ), приводит к полимеризации молекул A1AT прямо в синтезирующих его клетках. Соответственно, A1AT более не может попадать в кровоток или может попадать в кровь в очень малых количествах. С одной стороны, это приводит к утрате ингибирующей активности, что особенно проявляется в легких через продолжительное время, а с другой стороны к накоплению полимеров в клетках печени и, следовательно, к соответствующим функциональным расстройствам. Гетерозиготные особи (PiZ) обладают соответственно сниженным ингибиторным потенциалом. Известны дополнительные мутации со сходными дефектами.

В соответствии с современной оценкой среди населения США частота возникновения PiZZ-мутации составляет порядка 1/1600. Соответственно, число носителей мутации значительно выше, причем из них предположительно обнаружено только 10%.

В настоящее время не все пациенты, страдающие легочными функциональными расстройствами (прогрессирующей эмфиземой), причиной которых является недостаточность A1AT или сниженная функциональная активность A1AT, могут получать лечение, так как применение A1AT в форме одобренного лекарственного средства для лечения и/или профилактики недостаточно доступно. Общепризнанное лечение основано на внутривенном введении содержащих A1AT растворов, полученных из донорских препаратов плазмы крови. Общепризнанная и рекомендованная в настоящее время дозировка A1AT составляет 60 мг/кг массы тела в неделю, что соответствует среднему приему пациентом 16-20 г A1AT в месяц. Это, в свою очередь, соответствует количеству, которое в среднем содержится в 15 л плазмы крови. Принимая во внимание, что только часть ингибитора, содержащегося в применяемой в качестве исходного материала плазме крови, получают в форме чистого препарата, то в месяц для одного больного в качестве исходного материала требуется во много раз больше плазмы крови, чем 15 л. Общий объем плазмы крови, требуемой в качестве исходного материала для извлечения A1AT и, следовательно, для постоянного лечения больных, соответственно очень велик.

В общепризнанных способах получения препаратов A1AT в качестве исходного материала применяется так называемая фракция Коэна (Cohn) IV1. Данную фракцию получают посредством известного специалистам метода по Cohn-Oncley или в соответствии с его модификацией, которая основана на фракционном разделении белков плазмы крови путем варьирования, главным образом, концентрации добавляемого этанола, корректировки показателя pH и температуры раствора. Вместе с A1AT так называемая фракция IV1 обычно содержит широкий спектр других белков плазмы крови, количество которых уже отчасти уменьшено за счет предыдущих стадий осаждения. Модификацией этого способа получения является метод по Kistler-Nitschmann. Соответственно, в качестве исходного материала может применяться фракция, сходная с фракцией Коэна IV1, а также другие содержащие A1AT фракции, такие как так называемый супернатант I+II+III.

Ранее были описаны различные способы получения более или менее чистого препарата A1AT. Неоднократно сообщалось о применении ионообменной хроматографии для обогащения A1AT, в особенности при помощи анионообменников (Gray et al., 1960; Crawford et al., 1973; Chan et al., 1973; etc.). Тем не менее, одна только эта стадия получения не позволяла получать препарат A1AT с чистотой, которая соответствует существующему уровню техники. Поэтому, в сочетании с применением ионообменников отчасти применяются другие стадии получения. Например, применяются методы адсорбции или осаждения, такие как инкубация с полиэтиленгликолем (патент США № US-A-4379087), инкубация с комплексоном цинка или гепариновыми адсорбентами (патент США № US-A-4629567), или другие. Эти методы применяются для (дополнительной) очистки A1AT, но в случае использования каждого из них приходится смириться с большим или меньшим снижением выхода продукта. По существу, потеря продукта возрастает с увеличением числа стадий получения. Кроме того, это часто сопровождается увеличением затрачиваемого на получение времени, что может снижать целостность и активность A1AT, а также повышать затраты на производство.

В дополнение к стадиям получения белка, важной частью способов получения белковых продуктов из плазмы крови являются так называемые стадии инактивации или стадии элиминации вирусов. В дополнение к так называемому способу SD (solvent/detergent - обработка растворителем/детергентом), при котором соответствующие вирусы инактивируются путем разрушения их защитной липидной оболочки, для увеличения вирусной безопасности применяются методы термоинактивации, например пастеризация (обработка нагреванием при 60°C в течение 10 часов). Проведение фильтрации через нанофильтры задерживает вирусы с липидной оболочкой или без нее обычно в зависимости от размера вирусов. Задачей уровня техники является объединение двух основанных на различных принципах стадий способа, каждая из которых сама по себе является эффективной, вместе в один способ получения с максимальной вирусной безопасностью.

В зависимости от вида белка во время указанных стадий способа для его стабилизации добавляют стабилизаторы, например аминокислоты или сахара. Соответственно, впоследствии они должны быть удалены из содержащего A1AT раствора. В случае применения метода SD-обработки в качестве активных инактивирующих вирусы агентов добавляют детергенты, которые должны быть удалены подходящими способами на последующем этапе способа получения. Для этих целей было введено применение адсорбции на гидрофобных носителях, такой как хроматография на носителях с иммобилизованными C18 цепями. Такая хроматография также сопровождается снижением выхода продукта и включает упомянутые выше недостатки каждой (дополнительной) хроматографической стадии способа. Кроме того, указанные носители применяются, как правило, неоднократно, т.е. требуются дорогостоящие и длительные стадии регенерации носителя.

Соответственно, был описан альтернативный эффективный и быстрый способ качественного удаления детергентов, который обходится без стадии проведения хроматографии (международная публикация WO 94/26287, патент США № US-A-5817765). Так, для получения содержащих детергент частиц, которые могут быть отделены, например, путем простой фильтрации, содержание соли, например цитрата натрия, в содержащем детергент растворе белка доводили до сверхфизиологических концентраций (способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,5M). В дальнейшем этот метод называется методом «детергент/высаливания».

В приведенных в международной публикации WO 94/26287 примерах метод «детергент/высаливания» применяли к раствору трех отдельных белков, которыми являлись трансферин, антитромбин III и альбумин. В указанных примерах применение способа приводило к восстановлению активности белка на 95%, соответственно, и к уменьшению концентрации детергента. Если способ применяли в условиях, при которых выход целевого белка изменялся не слишком сильно, то концентрация Triton X-100 в продукте часто оставалась высокой. В примере 4 международной публикации WO 94/26287 авторы изобретения смогли восстановить активность альбумина на 95%, но полученный продукт содержал 250 м.д. Triton X-100 и 35 м.д. TnBP. Концентраций Triton X-100 свыше 50 м.д., предпочтительно свыше 10 м.д., следует избегать, особенно при производстве медицинских препаратов, и, как правило, желательно снизить содержание детергента насколько это возможно.

Цель настоящего изобретения относится к максимально эффективному и быстрому способу получения препарата A1AT, который приводит к получению продукта с высокой чистотой и безопасностью. Предпочтительно, в ходе способа получения активность и/или качество A1AT не должны изменяться в худшую сторону, а содержание детергентов должно быть уменьшено до уровня, приемлемого для медицинских препаратов.

Другая цель настоящего изобретения относится к способу очистки содержащих A1AT растворов, в процессе которого удаляются другие белковые компоненты. Предпочтительно, из раствора A1AT также должны быть удалены другие компоненты, такие как липиды или вирусы.

Цель достигается путем осуществления способа получения A1AT из содержащих A1AT растворов, включающего стадии:

(a) проведения ионообменной хроматографии содержащего A1AT раствора;

(b) добавления детергентов и необязательно растворителя для инактивации покрытых липидной оболочкой вирусов;

(c) последующего увеличения концентрации соли для высаливания детергентов.

Кроме того, задача настоящего изобретения решается в вариантах осуществления настоящего изобретения, определенных в пп.1-19 формулы изобретения. Способ получения A1AT из содержащих A1AT растворов, например, из восстановленной плазматической фракции Коэна IV1, в принципе состоит только из двух стадий, крайне эффективных с точки зрения обогащения A1AT. А именно, из проведения хроматографии при помощи анионообменника и инактивации вирусов путем SD-обработки Triton X-100 и TnBP с последующим высаливанием инактивирующих вирусы агентов.

Было обнаружено, что последняя упомянутая стадия может также очень эффективно применяться в содержащих A1AT растворах.

Способ по настоящему изобретению особенно применим в тех случаях, когда содержащий A1AT раствор содержит значительные количества отличных от A1AT белков. Неожиданно было обнаружено, что в условиях способа по настоящему изобретению эта стадия может применяться не только для удаления инактивирующих вирусы детергентов, но и для существенной дополнительной очистки от любых присутствующих белковых, липопротеидных и липидных примесей, не оказывая при этом отрицательного влияния на выход A1AT. В сочетании с упомянутой выше анионообменной хроматографией, по существу, получали продукт A1AT, который обладал чистотой >90%, предпочтительно >95% и содержал A1AT в его активной форме. Стадия обработки растворителем/детергентом и высаливание приводят к извлечению активного A1AT с выходом >80%. Если в качестве исходного материала применяется восстановленная фракция IV1, то способ по настоящему изобретению позволяет производить очистку A1AT благодаря удалению из содержащих A1AT растворов способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 -2-макроглобулина, гаптоглобина, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 -1 кислого гликопротеида, IgG, IgA и IgM. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения по сравнению с раствором A1AT до обработки растворителем/детергентом, который представляет собой, например, элюат после проведенной ранее анионообменной хроматографии, после стадии высаливания в содержащем A1AT растворе остается <10% способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 -2-макроглобулина, <40% гаптоглобина, <10% способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 -1 кислого гликопротеида, <10% IgG, <10% IgA и/или <10% IgM. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения содержание других белков в исходном содержащем A1AT растворе составляет до 50, до 20 или до 10 мас.%. В исходном растворе предпочтительно содержится, по крайней мере, 1, 2 или 5 мас.% других белков.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что способ по настоящему изобретению также применим в качестве стадии инактивации и/или элиминации вирусов. Несмотря на то, что извлечение A1AT происходит с высокими выходами, в продукте происходит элиминация или снижение содержания не только белковых компонентов, но также и вирусов. Это в особенности применимо для непокрытых липидной оболочкой вирусов, так как покрытые липидной оболочкой вирусы инактивируются ранее после обработки детергентом. Поэтому способ по настоящему изобретению также является способом инактивации вирусов, в особенности непокрытых липидной оболочкой вирусов, в содержащих A1AT растворах.

Неожиданным является тот факт, что описанный в международной публикации WO 94/26287 способ «детергент/высаливания» применим в данном случае, приводит к уменьшению содержания детергента до приемлемого для медицинских препаратов уровня и, кроме того, приводит к высокоспецифичному обогащению A1AT. Можно предположить, что способ по международной публикации WO 94/26287 может приводить к образованию продуктов с уменьшенным, но, тем не менее, все еще слишком высоким для фармацевтических продуктов, содержанием детергентов, и в которых все белки и другие компоненты, за исключением детергентов, извлекаются в сходной степени. Поэтому, можно предположить, что способ по международной публикации WO 94/26287 может применяться для очистки белка от других белков.

Проведение хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), например, на Phenyl-Sepharose®, является желательным в том случае, если требуется достичь еще более высокой степени очистки продукта A1AT. Осуществление этой стадии особенно напрашивается после проведения детергент/высаливания, так как связывание белка с гидрофобным матриксом или лигандами обычно происходит в присутствии сверхфизиологической концентрации соли. Затем осуществляют элюирование связанных белков, например, путем снижения концентрации соли. Соответственно, после удаления подвергнутого высаливанию детергента непосредственно после подходящего снижения концентрации соли (путем разбавления или ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF)), возможно осуществление взаимодействия содержащего A1AT раствора с гидрофобным матриксом и проведение хроматографии известным специалисту способом.

В дополнение к SD-обработке содержащего A1AT раствора способ может включать, по крайней мере, одну дополнительную стадию инактивации вирусов, элиминации вирусов и/или элиминации прионов, например, термоинактивацию вирусов в содержащем A1AT растворе. Эти стадии могут быть осуществлены в растворе, в особенности непосредственно после проведения стадии высаливания, так как содержащиеся в растворе соли, особенно цитрат натрия, служат стабилизаторами в процессе термообработки. В качестве другой возможности напрашивается применение термообработки лиофилизованного продукта. Альтернативно, или дополнительно, для элиминации вирусов или прионов может применяться любой подходящий способ фильтрации. Для элиминации вирусов и/или прионов способ по настоящему изобретению может в частности включать известную специалистам нанофильтрацию, предпочтительно с применением коммерчески доступных фильтров с размерами пор в диапазоне от 15 до 20 нм, или любой подходящий способ фильтрации. Элиминация вирусов может быть улучшена путем добавления аминокислот, в особенности в концентрации 0,1M для каждой аминокислоты. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения добавляют глицин в концентрации свыше 0,2M. Предпочтительный способ описан Yokoyama et al. (2004, Vox Sanguinis 86, 225-229).

Содержащий A1AT препарат по настоящему изобретению может быть получен, в принципе, способом, который характеризуется сочетанием следующих стадий:

(a) проведение анионообменной хроматографии содержащего A1AT раствора;

(b) необязательно проведение хроматографии по сродству к гепарину и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC);

(c) добавление детергентов и, необязательно, растворителя для инактивации покрытых липидной оболочкой вирусов;

(d) последующее высаливание указанных реагентов и белковых примесей;

(e) осуществление, по крайней мере, еще одной стадии инактивации и/или удаления вирусов.

Как правило, подходящими являются содержащие A1AT растворы, полученные из плазмы крови или ее фракций, или рекомбинантный или экспрессированный трансгенным путем A1AT.

В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению фракцию Коэна IV1 восстанавливают водой или буферным раствором, более предпочтительно 20 мМ Трис-буфером для получения отношения раствор/фракцияспособ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 3/1 (предпочтительно >10:1), затем осуществляют ее взаимодействие с ионообменным гелем, предпочтительно с анионообменным гелем, в предпочтительном варианте осуществления с DEAE Sepharose® (Amersham), более предпочтительно с DEAE-Sepharose® Fast Flow, гель промывают и элюируют A1AT путем увеличения ионной силы растворителя. Инактивацию вирусов проводят, например, в соответствии с методом по европейскому патенту EP-A-0131740. После необязательного добавления стабилизирующих агентов добавляют инактивирующие вирус агенты, предпочтительно Triton X-100, Polysorbate 80 (Tween 80), TnBP и/или каприловую кислоту/каприлат, предпочтительно до конечной концентрации способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 мас.% Triton и Tween 80, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,03 мас.% TnBP, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 мМ каприловой кислоты/каприлата. После надлежащего времени инкубации, предпочтительно способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 0,1 часа, более предпочтительно способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 1 часа, при способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 4°C, более предпочтительно при способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 15°C, концентрацию соли повышают, в частности до концентрации 0,5M, в частности путем добавления цитрата. Полученные таким образом частицы удаляют, в частности путем фильтрации. Повторная промывка фильтров или отделенных частиц может привести к увеличению выхода A1AT. За этим может следовать дополнительная стадия инактивации вирусов, предпочтительно пастеризация в присутствии 0,5M цитрата натрия, аминокислот, сахаров или смесей этих веществ. Последующее уменьшение концентрации добавленных веществ предпочтительно осуществляют путем ультрафильтрации/диафильтрации. Более предпочтительно, последующее отделение частиц вирусов осуществляют при помощи нанофильтров, предпочтительно при помощи фильтров с размером пор 15-20 нм. Полученный таким образом A1AT может храниться в виде жидкого или замороженного препарата или может быть лиофилизован в соответствии с известными специалистам методами.

Определенный в пп. 12-17 формулы настоящего изобретения A1AT по настоящему изобретению отличается от препаратов, известных из уровня техники. Препараты в соответствии с патентами EP436086 и DE4407837 не обладают высокой чистотой препарата по настоящему изобретению и содержанием IgA способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 1 мг/мл.

Полученный таким образом продукт A1AT может вводиться в виде раствора подкожно, внутримышечно, местно или в виде аэрозоля, предпочтительно внутривенно. В виде высушенного материала он также может применяться для ингаляций в порошкообразной форме. Возможно применение с добавкой других растворов, например, для внутривенного введения. Возможная дозировка составляет, например, 60 мг/кг веса тела в неделю или 250 мг/кг в месяц.

Другой предпочтительный способ включает проведение HIC в дополнение к упомянутым выше стадиям способа, предпочтительно проведение HIC на фенильном матриксе, предпочтительно после SD-обработки и высаливания вируцидных агентов и других примесей, как было описано выше. Предпочтительно выполняют негативную очистку, т.е. требуемое вещество A1AT проходит через хроматографический матрикс без связывания, а нежелательные вещества связываются и тем самым удаляются из рабочего раствора.

В другом предпочтительном способе, который может включать упомянутую выше HIC, проводят хроматографию на иммобилизованном гепарине, предпочтительно посредством применения гепарин-сефарозы или гепарин-фрактогеля. Таким образом, содержащий A1AT раствор приводят во взаимодействие с гепариновым гелем в колонке или в ходе периодического процесса. Обогащенный A1AT проходит через колонку без связывания или обнаруживается в надосадочной жидкости после отделения геля. Эту стадию способа предпочтительно осуществляют до или после упомянутой выше ионообменной хроматографии, или после высаливания детергента и уменьшения ионной силы раствора, например, путем диализа.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему A1AT по настоящему изобретению в качестве единственного активного ингредиента или в сочетании с противовоспалительными средствами, предпочтительно со стероидами, нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами, и к применению A1AT по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения дефицита A1AT, дегенеративных процессов в легких, таких как фиброз легких и эмфизема.

Подходящие формы введения содержащего A1AT лекарственного средства, как таковые, известны специалистам. Конкретно, подходящими являются все формы введения белков, например, парентеральные формы введения, внутривенное введение и ингаляционное введение.

Способ в соответствии с настоящим изобретением дополнительно проиллюстрирован на следующем примере.

Пример 1

Для восстановления замороженную фракцию Коэна IV1 растворяли в 20 мМ Трис-буфере до весового отношения 1:9 при перемешивании в течение 3 часов при щелочном показателе pH.

Анионообменная хроматография

Предпочтительным хроматографическим материалом для данной стадии способа является DEAE-Sepharose FF (Fast Flow), хотя специалист может подобрать условия, подходящие для каждого анионообменного материала. Наполненную DEAE-Sepharose FF хроматографическую колонку уравновешивали 20 мМ Трис-буфером (pH 8,0). После этого при pH 8,0 наносили растворенную фракцию Коэна IV1. Промывали уравновешивающим буферным раствором, а затем смывали буферным раствором. Связавшийся с матриксом A1AT может быть элюирован путем промывания колонки 20 мМ Трис-буфером (0,075M NaCl, pH 8,0). Удельная активность полученного таким образом раствора A1AT составляла приблизительно 0,5 PEU/мг белка (PEU: эквивалентная единица плазмы; соответствует величине активности A1AT, обнаруживаемой в среднем в 1 мл плазмы крови человека). Колонку элюировали концентрированным солевым буфером (например, 2M NaCl) и впоследствии могли регенерировать хроматографический гель известными per se способами.

Обработка растворителем/детергентом

Полученный таким образом элюат концентрировали путем ультрафильтрации. Затем добавляли заранее перемешанный раствор Triton X-100, TnBP и воду для применения в фармацевтике (WFI: вода для инъекций) до конечной концентрации 1 мас.% Triton X-100 и 0,3 мас.% TnBP. SD-обработку осуществляли в течение 4 часов при 20°C при умеренном перемешивании.

Высаливание

Для удаления SD-реагентов и выпавших в осадок нежелательных сопутствующих белков раствор, содержащий A1AT, разбавляли раствором, содержащим 1,5M цитрата натрия и 20 мМ Трис-буфер при pH 7,0. При перемешивании осуществляли добавление цитрата в концентрации 1M в течение, по крайней мере, 15 минут. Затем рабочий раствор инкубировали в течение, по крайней мере, 1 часа при умеренном перемешивании. Образовавшийся белесый осадок затем отфильтровывали. Это приводило к снижению концентрации SD-реагентов до уровня ниже 10 м.д. и к отделению нежелательных сопутствующих белков и денатурированного A1AT.

После этой стадии получения удельная активность A1AT составляла, по крайней мере, 0,8 PEU/мг (PEU: эквивалентная единица плазмы; соответствует величине активности A1AT, обнаруживаемой в среднем в 1 мл плазмы крови человека).

Нанофильтрация

Для дополнительного увеличения вирусной безопасности продукта A1AT после удаления низкомолекулярных веществ путем UF/DF фильтровали полученный таким образом раствор через фильтры с номинальным размером проникающих частиц 15-20 нм, такие как фильтры DV20 компании Pall.

Результат:

После фильтрации концентрации Triton X-100 и TNBP в продукте составляли менее 5 м.д. Определяли содержание A1AT и других белковых компонентов и сравнивали с содержанием, зафиксированным после обработки растворителем/детергентом. Были получены следующие значения степени извлечения: A1AT >80%, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 -2-макроглобулин <10%, гаптоглобин <40%, способ очистки раствора альфа-1-антитрипсина, патент № 2370500 -1 кислый гликопротеид <10%, IgG <10%, IgA <10%, IgM <10%.

Полученные результаты демонстрируют, что продукт A1AT специфически извлекается в больших количествах, в то время как из продукта в значительной мере удаляются другие белковые компоненты. Это дополнительно проиллюстрировано на фигуре 1, на которой представлены результаты SDS-PAGE раствора до обработки растворителем/детергентом (дорожка 2) и после стадии высаливания (дорожка 3). Положение A1AT соответствует широкой линии немного выше 50 кДа (по сравнению с маркером молекулярного веса на дорожке 1). Содержание различных других белковых компонентов, явно различимых в исходном растворе, существенно снижено.

Пример 2

В качестве модификации описанного в примере 1 способа, осуществляли взаимодействие содержащего A1AT элюата после проведения ионообменной хроматографии с гепарин-сефарозой. A1AT проходит через заполненную гепарин-сефарозой колонку без связывания. В случае применения периодического процесса A1AT остается в надосадочной жидкости. Дополнительную обработку элюата или надосадочной жидкости в случае периодического процесса осуществляли, как описано в примере 1. Полученный таким образом продукт характеризовался повышенной чистотой.

На чертеже представлен результат проведения SDS-PAGE в восстановительных условиях, градиент 4-20%, окрашивание по Кумасси, 5 г белка/дорожку. Дорожка 1: маркер молекулярного веса; дорожка 2: проба раствора в соответствии с примером 1 до обработки растворителем/детергентом; дорожка 3: проба раствора в соответствии с примером 1 после стадии высаливания.

Класс C07K1/14 экстракция; разделение; очистка

способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria immitis -  патент 2525688 (20.08.2014)
очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран -  патент 2520817 (27.06.2014)
оптимизированный способ очистки рекомбинантного белка фактора роста -  патент 2491290 (27.08.2013)
производство 2s-белка канолы с применением ионного обмена -  патент 2490274 (20.08.2013)
способ получения эстрогенсвязывающего белка, ассоциированного со злокачественными новообразованиями -  патент 2489440 (10.08.2013)
способ крупномасштабного получения, выделения и очистки рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека -  патент 2487885 (20.07.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485133 (20.06.2013)
белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе -  патент 2485132 (20.06.2013)
способ производства фармакологически приемлемой смеси веществ, содержащей низкомолекулярные компоненты пептидогликана клеточной стенки грамотрицательных бактерий и обладающей иммуностимулирующей активностью -  патент 2478644 (10.04.2013)
осаждение и очистка белков полиэлектролитами -  патент 2474585 (10.02.2013)

Класс C07K14/81 ингибиторы протеазы

модифицированные варианты ингибиторов протеаз bowman birk -  патент 2509776 (20.03.2014)
слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением -  патент 2503688 (10.01.2014)
способ получения овомукоида -  патент 2460734 (10.09.2012)
применение слитого конструкта тимп-гфи и способ лечения повреждений кожи для предотвращения или ингибирования образования рубца -  патент 2428479 (10.09.2011)
полипептид, способный преодолевать гематоэнцефалический барьер, и его конъюгат -  патент 2408605 (10.01.2011)
производные фактора vii свертывания крови -  патент 2338752 (20.11.2008)
по существу, кристаллическая форма мелагатрана -  патент 2243973 (10.01.2005)
бикунин человека (варианты), кодирующая его днк и вектор экспрессии (варианты) -  патент 2218353 (10.12.2003)
природный и рекомбинантный ингибиторы тромбина, их получение и применение -  патент 2183214 (10.06.2002)
протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов млекопитающих, рекомбинантный протеин, ингибирующий вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, фрагмент днк, кодирующий рекомбинантный протеин, вектор экспрессии (варианты), штамм культивируемых животных клеток внк - продуцент рекомбинантного протеина (варианты), способ получения рекомбинантного протеина, фармацевтическая композиция -  патент 2128705 (10.04.1999)

Класс A61K35/16 плазма; сыворотка

способ лечения язвенного пилородуоденального стеноза -  патент 2527336 (27.08.2014)
фармацевтическая композиция и способ получения противовирусных фракций (антивирус-с) -  патент 2526799 (27.08.2014)
способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови -  патент 2522237 (10.07.2014)
способ пластики костных дефектов -  патент 2517563 (27.05.2014)
способ лечения заболеваний, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов -  патент 2517060 (27.05.2014)
способ хирургического лечения несросшихся переломов и ложных суставов трубчатых костей при наличии дефицита мягких тканей в проекции несросшихся переломов и ложных суставов -  патент 2515146 (10.05.2014)
способ лечения эректильной дисфункции -  патент 2514639 (27.04.2014)
способ нормализации репродуктивной функции -  патент 2508117 (27.02.2014)
способ профилактики гнойно-воспалительных осложнений при лечении травматолого-ортопедических пациентов с использованием аппаратов внешней фиксации -  патент 2508062 (27.02.2014)
иммуномодулятор -  патент 2504371 (20.01.2014)
Наверх