Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой инженерии в зоне ишемии миокарда

Классы МПК:C12N5/08 клетки или ткани человека
Автор(ы):, , , , , , , ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" (RU),
Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной медицины Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова (RU),
ООО "Генная и клеточная терапия" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-04-29
публикация патента:

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной и тканевой инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии. Предложен новый источник аутологичных стволовых клеток сердца (СКС) - ткань удаляемой хирургическим путем аневризмы сердца и разработан способ выделения и культивирования СКС из этого источника, а также способ индукции дифференцировки этих клеток в направлении образования кардиомиоцитов, эндотелиальных, гладкомышечных и нейральных клеток. Получаемые согласно изобретению культуры СКС могут быть использованы в клинике для регенерации поражений миокарда у определенной категории больных. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.

Рисунки к патенту РФ 2366706

способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной и тканевой инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при разработке клинического метода восстановления ткани миокарда. Предлагается способ получения культуры мультипотентных клеток, заключающийся в выделении и культивировании мультипотентных клеток из ткани аневризмы, которые могут быть затем индуцированы in vitro к дифференцировке в направлении образования кардиомиоцитов, эндотелиальных, гладкомышечных и нейральных клеток с целью последующего использования для клеточной терапии и/или тканевой инженерии зоне ишемии миокарда.

Сердечно-сосудистые заболевания продолжают лидировать в списке по количеству смертельных исходов во всех промышленно развитых странах. Сердечная недостаточность, вызываемая ишемической болезнью сердца (ИБС) или кардиомиопатиями, является одним из самых тяжелых заболеваний с плохим прогнозом. Наиболее часто сердечная недостаточность возникает в результате острого инфаркта миокарда. При инфаркте миокарда происходят процессы воспаления, некротической и апоптотической гибели кардиомиоцитов, гиперплазии и ремоделирования как пораженного, так и здорового участка миокарда. До недавнего времени считалось, что кардиомиоциты взрослых млекопитающих не обладают способностью к самообновлению, и замещение дефекта сердечной мышцы происходит без их участия, в основном за счет пролиферации клеток стромы (фибробластов).

Однако в последние годы появляется все больше свидетельств тому, что сердце не является терминально дифференцированным органом и обладает определенным регенеративным потенциалом, благодаря наличию в сердечной ткани пула незрелых кардиомиоцитов, получивших название стволовых клеток сердца (СКС) (Beltrami et al., 2001; Beltrami et al., 2003; Torella et al., 2004). Эти данные важны не только в плане дальнейшего исследования механизмов регенерации ткани миокарда, но и с точки зрения открывающихся возможностей в области клеточной терапии, связанных с использованием нового источника аутологичных клеток для регенерации ткани в зоне ишемии.

Уровень техники.

В 2001 году Пьеро Анверза и соавт. (Beltrami et al., 2001), исследуя постмортальные срезы миокарда человека, впервые обнаружили присутствие в сердечной ткани пролиферирующих миоцитов. Позднее было показано, что в сердце присутствует популяция резидентных стволовых клеток (СКС), которые являются мультипотентными и проявляют способность к самообновлению и пролиферации. Для СКС характерна экспрессия поверхностного маркера стволовых клеток c-kit (c-kit - рецептор фактора стволовых клеток SCF), а также белка-транспортера MDR-1 (multiple drug resistance protein 1); они не экспрессируют маркеров гематопоэтических клеток CD34 и CD45 (Lin-), эндотелиальных клеток CD31 и плохо формируют гематопоэтические колонии при культивировании in vitro (Anversa et al., 2003). СКС локализуются среди кардиомиоцитов в так называемых «нишах» (Anversa et al., 2006; Beltrami et al., 2003). «Ниши» с СКС анатомически располагаются в хорошо защищенных зонах миокарда, в наименьшей степени подверженных гемодинамическим нагрузкам (верхушка желудочка и предсердия). Пролиферация СКС в «нише» находится под контролем факторов роста и цитокинов. При стимуляции пролиферации СКС, например, при инфаркте миокарда или при аортальном стенозе (Urbanek et al., 2003; Urbanek et al., 2005), в результате ассиметричного деления образуется две клетки. Одна из этих двух клеток - собственно новая СКС остается связанной со своим микроокружением в «нише», а другая становится сначала прогениторной клеткой, а затем коммитированным предшественником. Прогениторные клетки экспрессируют маркеры СКС (c-kit, Lin-, MDR-1 у человека или Sca-1 у мыши) и транскрипционные факторы кардиомиоцитарного (GATA-4, Nkx-2.5, MEF2C), гладкомышечного (GATA-6) или эндотелиального (Ets1, Erg1) направления дифференцировки, но еще не экспрессируют характерных для специализированных клеток цитоплазматических белков. Клетки-предшественники экспрессируют специфические для определенного типа клеток цитоплазматические белки (для кардиомиоцитов - нестин, десмин, тяжелые цепи миозина, способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -саркомерный актин, коннексин 43, тропонин I и др.; для эндотелиальных клеток - CD31, фактор вон Виллебранда, flk1; для гладкомышечных клеток - TGF-способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 1 рецептор, flk1, способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -гладкомышечный актин) и постепенно теряют экспрессию маркеров СКС (Leri et al., 2007).

Недавно в работах, проведенных на животных моделях с экспериментальной индукцией инфаркта миокарда, были получены прямые доказательства того, что СКС способны мигрировать в зону инфаркта, участвовать в регенерации ткани миокарда и улучшать функцию сердца, причем значительно эффективней, чем использовавшиеся в качестве контроля фибробласты (Messina et al., 2004; Smith et al., 2007; Leri et al., 2007). Позитивный эффект, который наблюдается при введении СКС, обусловлен целым рядом причин. Во-первых, на моделях in vivo и in vitro было показано, что СКС способны дифференцироваться во все основные типы клеток, присутствующих в сердце (эндотелиальные, гладкомышечные клетки и фибробласты), и формировать ткань миокарда со всеми необходимыми элементами стромы и сосудов. Во-вторых, СКС способны сливаться с существующими кардиомиоцитами хозяина, что повышает выживаемость и пролиферацию кардиомиоцитов в условиях ишемии. В-третьих, СКС оказывают паракринный эффект, секретируя факторы, способствующие выживанию кардиомиоцитов и ангиогенезу в зоне ишемии (Lyngbaek et al., 2007). С учетом указанных позитивных особенностей, а также в силу выраженной в большей степени, чем у других стволовых клеток, способности к кардиомиоцитарной дифференцировке резидентные стволовые клетки сердца потенциально представляют собой один из самых перспективных типов клеток для клеточной терапии при ишемической болезни сердца и кардиомиопатиях различного происхождения.

В ряде работ, которые могут рассматриваться в качестве аналогов настоящего изобретения, описано выделение СКС, получение на их основе первичных культур и кардиогенная индукция культивированных клеток in vitro (Smith et al., 2007; Bearzi et al., 2007). Однако перспективы клинического применения этих культур существенно ограничены в связи с тем, что в качестве источника для получения СКС используется биопсийный материал.

При создании настоящего изобретения была найдена возможность преодоления указанного недостатка, которая заключалась в том, что для выделения СКС впервые была использована ткань постинфарктной аневризмы сердца, подлежащей удалению хирургическим путем.

Таким образом, настоящее изобретение представляет собой разработку, в которой предпринята попытка выделения СКС из аневризмы сердца человека, их культивирования и индукции дифференцировки в направлениях, значимых для регенерации пораженных участков миокарда.

Раскрытие изобретения

Предложен новый источник аутологичных стволовых клеток, которые в дальнейшем могут быть использованы в клинике для регенерации поражений миокарда у определенной категории больных - ткань удаляемой хирургическим путем аневризмы сердца. Разработан способ выделения СКС из различных участков (из мышечной и жировой части) и всей ткани аневризмы сердца человека и культивирования этих клеток в условиях in vitro, а также условия для индукции их дифференцировки в кардиомиоцитарном, эндотелиальном, гладкомышечном и нейральном направлении.

Обширный инфаркт миокарда часто приводит к формированию аневризмы сердца, которая представляет собой выпячивание истонченного участка, чаще всего левого желудочка. По структуре и организации аневризма представляет собой ригидную фиброзную ткань с вкраплениями миокарда (мышечная часть аневризмы), вокруг которой может формироваться жировая ткань. Иногда аневризма имеет слоистую структуру, где слои фиброзной ткани перемежаются слоями миокарда.

В процессе создания изобретения срезы ткани аневризмы были проанализированы методом иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител, выявляющих собственно СКС и клетки-предшественники. Всего было проанализировано 10 аневризм, содержащих фиброзную, мышечную и жировую ткань. При этом было установлено, что как в мышечной, так и в жировой ткани аневризмы содержатся клетки, экспрессирующие маркеры СКС, такие как c-kit и c-met (Пример 1), однако преимущественно они обнаруживаются в тех участках, где сохранилась мышечная ткань (фиг.1).

Для проверки возможности получения и культивирования этих клеток была разработана методика их выделения из ткани аневризмы (Пример 2) и найдены оптимальные условия для поддержания их в культуре. В результате культивирования была получена культура клеток, содержащая c-kit+ клетки и клетки-предшественники, в которой экспрессия c-kit сохранялась как минимум на первых 2-х пассажах (фиг.3).

Поскольку содержание c-kit+ клеток в клеточной популяции, выделяемой из аневризмы, исходно составляло менее 1%, была предпринята попытка обогатить исходную клеточную популяцию c-kit+ клетками с помощью метода непрямого иммуно-магнитного сортинга (Пример 4). В результате содержание c-kit+ клеток в культуре удалось увеличить до 20% (фиг.4).

Путем переноса культуры, обогащенной c-kit+ клетками, в различные среды для индукции того или иного вида дифференцировки (Пример 5, табл.1), были получены культуры с явным преобладанием типа клеток, определяемого составом используемой дифференцировочной среды, а именно клеток эндотелиального, кардиомиоцитарного и нейронального направления дифференцировки. Свидетельством эндотелиальной дифференцировки являлось присутствие в культуре клеток, экспрессирующих маркер эндотелиальных клеток-предшественников - CD105 и/или маркер зрелых эндотелиальных клеток - CD31 (фиг.5). Индукцию кардиомиогенеза в культуре детектировали по присутствию клеток, экспрессирующих маркеры ранней кардиогенной дифференцировки GATA-4 и Nkx-2.5, а также по наличию клеток, экспрессирующих структурные белки зрелых кардиомиоцитов: тропонин I, легкую цепь-1 миозина сердца, коннексин 43 и способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -aктинин (фиг.5). При индукции дифференцировки в нейрональном направлении выявлялись клетки, по морфологии напоминающие нейральные (фиг.6), которые при окрашивании антителами к различным маркером нервных клеток демонстрировали экспрессию маркера нейральной дифференцировки способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 III тубулина и не экспрессировали маркер глиальных клеток GFAP.

При выделении клеток из ткани аневризмы в исходной культуре присутствовали гладкомышечные клетки, которые экспрессировали гладкомышечный способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -актин; гладкомышечные клетки также обнаруживались в культуре при индукции эндотелиального направления дифференцировки (фиг.6).

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры мультипотентных клеток, предусматривающий выделение популяции клеток из ткани аневризмы сердца, обработку клеток методом непрямого иммуно-магнитного сортинга с отделением фракции, обогащенной с-kit-позитивными клетками, культивирование полученной фракции клеток в стандартной питательной среде для клеток млекопитающих без добавления специфических факторов роста в течение примерно 9-10 дней и индукцию дифференцировки клеток культуры в эндотелиальном, кардиомиоцитарном или нейральном направлении путем помещения их в соответствующую дифференцировочную среду, составом которой определяется желаемое направление дифференцировки.

Предлагаемое изобретение основано на установленном заявителями факте присутствия стволовых клеток сердца в ткани аневризмы, которые демонстрируют способность пролиферировать в культуре и при определенных условиях дифференцироваться в кардиомиоциты, эндотелиальные, гладкомышечные и нейральные клетки. Поскольку все названные типы клеток в норме присутствуют в миокарде, получаемые при осуществлении изобретения индуцированные культуры мультипотентных клеток представляются одним из наиболее перспективных средств для клеточной терапии, проводимой с целью регенерации повреждений сердечной ткани. При этом явным преимуществом предлагаемого метода (техническим результатом) является отказ от получения биопсийного материала и использование в качестве источника выделения СКС иссекаемой при операции ткани аневризмы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Иммуногистохимическое (на наличие маркера c-kit) и иммунофлуоресцентное (на наличие маркера c-met) выявление клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для стволовых клеток сердца, на криосрезах ткани мышечной части аневризмы сердца человека.

Фиг.2. Иммуногистохимическое выявление экспрессии маркеров стволовых клеток сердца (с-kit) и зрелых эндотелиальных клеток (CD31) на криосрезах ткани аневризмы сердца человека. С-kit-позитивные клетки располагаются в ткани либо в виде отдельных клеток (В), либо характерными кластерами (Г). На последовательных срезах ткани аневризмы наблюдается локализация c-kit+ клеток в основном вблизи крупных сосудов (А, Б).

Фиг.3. Иммунофлуоресцентное выявление экспрессии маркеров стволовых клеток сердца (с-kit) и мезенхимальных клеток-предшественников (CD105, SDF-1, виментин) в клетках из ткани аневризмы, культивированных в условиях in vitro. Обнаружение CD105 - маркера, SDF-1 и виментина свидетельствует о присутствии в культуре клеток-предшественников мезенхимального происхождения.

Фиг.4. Обогащение популяции клеток, выделяемых из ткани аневризмы сердца, с-kit-позитивными клетками методом иммуно-магнитного сортинга. 1 - прижизненное изображение культуры клеток после иммуно-магнитного сортинга (на фотографии видны бусины, покрытые антителами к с-kit). 2 - увеличение содержания с-kit-позитивных клеток в культуре (от 1 до 20%).

Фиг.5. Индукция эндотелиальной и кардиомиоцитарной дифференцировки в культуре клеток после иммуно-магнитного сортинга, определяемая методом иммунофлуоресцентного окрашивания. После культивирования с-kit+ обогащенной культуры клеток на среде для дифференцировки в эндотелиальном направлении выявлялось присутствие эндотелиальных клеток-предшественников (маркер CD105) и зрелых эндотелиальных клеток (маркер CD31), а на среде для дифференцировки в кардиомиoцитарном направлении - клеток-предшественников кардиомиоцитов (транскрипционный фактор Nkx - 2,5) и зрелых кардиомиоцитов (структурный белок тропонин I).

Фиг.6. Индукция нейральной и гладкомышечной дифференцировки в культуре клеток после иммуно-магнитного сортинга, определяемая методом иммунофлуоресцентного окрашивания. После культивирования с-kit+ обогащенной культуры клеток на среде для нейральной дифференцировки выявлялось присутствие клеток, экспрессирующих маркер нейральной дифференцировки способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 III тубулин; на среде для эндотелиальной дифференцировки, помимо эндотелиальных клеток-предшественников и зрелых эндотелиальных клеток (см. фиг.5), выявлялись клетки, экспрессирующие гладкомышечный альфа-актин.

Осуществление изобретения.

При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы хорошо известные специалистам способы и средства, описанные в методических руководствах, а также в цитированных в описании источниках.

Пример 1. Получение срезов ткани аневризмы и их анализ с помощью иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания.

Для выявления клеток-предшественников в ткани аневризмы использовали жировую и мышечную части аневризмы, включая все слои и структуры. Образец ткани помещали в среду для замораживания Tissue-Tek (О.С.Т.способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 Compound 4583), замораживали в парах жидкого азота и использовали для изготовления тонких криосрезов толщиной 6 микрон на криотоме (Microm HM 505E). Срезы помещали на чистые стекла для замороженных срезов (Superfrost, Fisher Scientific 12-550-143) и хранили при -20°С.

Стекла со срезами постепенно размораживали при комнатной температуре, затем промывали теплым фосфатно-солевым буфером (ФСБ: 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 4.3 мМ Na2HPO 4·2H2O, 1.4 мМ KH2PO4 ), фиксировали в 4% формалине на ФСБ в течение 15 мин и отмывали в ФСБ 3 раза по 10 мин. Для инактивации эндогенной пероксидазы стекла со срезами помещали в 3% раствор перекиси водорода на 30 минут, далее отмывали в ФСБ 2 раза по 10 мин. Для предотвращения неспецифического связывания антител срезы ткани инкубировали в 10% растворе нормальной сыворотки донора вторых антител на 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в ФСБ в течение 40 мин. После этого наносили первые антитела. В качестве первых антител использовались следующие препараты: с-kit (Miltenyi Biotec), CD31 (PECAM-1) (mouse antirat, Pharmingen 22711D), c-met (mouse, Zymed, 71-8000), тропонин I (mouse, Chemicon, MAB3438), способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -aктин (mouse, DAKO, M0851), способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -актинин (mouse, Sigma, A-7811), разведенные на 1% растворе БСА в ФСБ до концентрации, рекомендованной производителем, и инкубировали во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем срезы отмывали от первых антител в ФСБ 3 раза по 10 мин и наносили вторые биотинилированные антитела (mouse IgG, Vectastain, Vector) на 14 мин в разведении, рекомендованном производителем. По окончании реакции стекла со срезами отмывали в ФСБ 2 раза по 5 мин и наносили пероксидазный ABС-комплекс (ABC kit, Vector, PK-6102) в разведении 1:50 (µ1) на 5-10 мин. Затем стекла со срезами отмывали в ФСБ 2 раза по 5 мин и проявляли окраску с использованием субстрата DAB (Sigma, D-4168), при этом время проявления контролировали под микроскопом. Реакцию останавливали в дистиллированной воде и докрашивали ядра гематоксилином в течение 15 мин, дифференцируя окраску в проточной воде. Далее, используя стандартную гистологическую проводку, стекла со срезами проводили по спиртам до толуола и заключали в канадский бальзам.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания стекла со срезами обрабатывали методом, описанным в Примере 3 для культивированных клеток. Препараты анализировали при помощи микроскопа Axiovert 200M (Zeiss). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam НRС (Zeiss, Германия) с использование программ Axiovision 3.1 и Axiovision 4.6 (Zeiss).

В результате анализа полученных срезов ткани было установлено, что клетки, экспрессирующие маркеры стволовых клеток, присутствуют как в мышечной (фиг.1), так и в жировой части аневризмы (фиг.2В и Г). При этом с-kit-позитивные клетки располагаются в ткани аневризмы либо в виде отдельных клеток (фиг.2В), либо характерными кластерами, напоминающими описанные выше «ниши» (фиг.2Г). Иммуногистохимическое окрашивание последовательных срезов ткани аневризмы показало, что c-kit+ клетки часто локализуются вблизи сосудов (фиг.2А и Б), однако эти клетки не являются циркулирующими в крови предшественниками, так как не обнаруживаются в просвете сосудов (фиг.2А и Б).

Пример 2. Получение популяции клеток из ткани аневризмы.

Выделение клеток из полученного в результате операции материала осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Ткань аневризмы разделяли на жировую и мышечную части, каждую часть отдельно измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких кусочков (размером не более нескольких кубических миллиметров) и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед./мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (40 ед./мл Invitrogen Corporation, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при 37°С в течение 30 мин для жировой ткани и 50 мин для мышечной части аневризмы при постоянном покачивании; по окончании инкубации к образцу добавляли равный объем среды DMEM (Gibco)/10% фетальная сыворотка быка (HyClone) и центрифугировали при 600 оборотах в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в среде DMEM/10% фетальная сыворотка быка или MyeloCult (Stemcell, #M5300)/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин (GIBCO BRL), высаживали клетки на чашки Петри (Corning) диаметром 60 мм и культивировали в

СО2-инкубаторе (5% СО2 ; 95% воздуха) при 37°С. Смену среды проводили каждые 2-3 дня; при достижении монослоя клетки пассировали с использованием 0,25% раствора трипсин/ЭДТА. Было проведено 7 пассажей. Клетки анализировали методом имммунофлуоресцентного окрашивания на 2, 3, 4 и 5 пассажах.

Пример 3. Иммунофлуоресцентный анализ клеток в процессе культивирования.

Клетки на стеклах промывали теплым фосфатно-солевым буфером (ФСБ: 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 4.3 мМ Na2HPO4·2H 2O, 1.4 мМ KH2PO4), фиксировали в 4% формалине на ФСБ в течение 15 мин и отмывали в ФСБ 3 раза по 10 мин. Для предотвращения неспецифического связывания стекла с клетками инкубировали в 10% растворе нормальной сыворотки донора вторых антител на 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в ФСБ в течение 40 мин. После этого наносили первые антитела, разведенные 1% БСА до концентрации, рекомендованной производителем, и инкубировали во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре. Клетки отмывали от первых антител в ФСБ 3 раза по 10 мин и наносили вторые антитела, меченные флуорохромом; инкубировали в течение 40-50 мин, отмывали в ФСБ 3 раза по 10 мин и докрашивали ядра DAPI (Molecular Probes, США) в концентрации 1 мкл/1 мл ФСБ в течение 20 минут. Затем стекла промывали 3 раза по 10 минут в ФСБ и заключали в водорастворимой специализированной среде для заключения иммунофлуоресцентных препаратов (Polysciences, Inc США). В качестве первых антител использовались следующие препараты: с-kit (Miltenyi Biotec), CD31 (PECAM-1) (mouse antirat, Pharmingen 22711D), c-met (mouse, Zymed, 71-8000), SDF-1 (mouse, R@D, МАВ350), CD34 (mouse, BD, 550390), виметин (mouse Sigma, V-6630), GATA-4 (rabbit, Santa Cruz, 1404), Nkx2,5(rabbit, Santa Cruz, sc-14033), тропонин I (mouse, Chemicon, MAB3438), легкая цепь-1 миозина сердца (mouse, Abcam, ab680), коннексин 43 (mouse, Zymed, 40587905), способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -aктин (mouse, DAKO, M0851), способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -aктинин (mouse, Sigma, A-7811), способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 III тубулин (Chemicon, MAB1637), GFAP (Chemicon, MAB360); в качестве вторых антител использовали флуоресцентно меченные антитела осла против кролика (donkey antirabbit Alexa 488, Molecular Probes, A-21207) и антитела осла против мыши (donkey antimouse Alexa 594, Molecular Probes, A-21203). Для визуализации ядер клетки докрашивали флуоресцентым красителем DAPI (4способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 ,6-diamidino-20phenyl-indole, dihydrochloride, Molecular Probes, 28В2-6). Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert 200M (Zeiss). Флуоресцентный анализ изображений производили с использованием микроскопа Axiovert 200M (Zeiss), цифровой видеокамеры Axiocam НRС (Zeiss, Германия) и обработки изображения в программе Axiovision 3.1 и Axiovision 4.6.

Иммунофлуоресцентный анализ культур подтвердил наличие стволовых клеток в ткани обеих (мышечной и жировой) частях аневризмы (фиг.3). Полученные при количественной оценке клеточного состава данные показали, что в популяции клеток, выделяемых как из мышечной, так и из жировой части аневризмы, количество с-kit-позитивных клеток составляет не более 1%, в связи с чем была поставлена задача повышения их содержания в исходной популяции клеток.

Для обогащения культуры клеток, выделяемых из аневризмы, с-kit-позитивными клетками использовали суммарную популяцию клеток из всей ткани (мышечной + жировой части) аневризмы, которую подвергли иммуно-магнитному сортингу.

Пример 4. Иммуномагнитный сортинг клеток.

Общую популяцию клеток, выделенных из ткани аневризмы, разделили методом непрямого иммуно-магнитного сортинга на две фракции: c-kit-позитивные клетки и c-kit-негативные клетки. Для иммуно-магнитного сортинга использовали магнитные частицы (бусины) размером 4,5 микрон, коньюгированные с антителами против Fc-фрагмента мышиных IgG (CELLection PanMouse IgG, № 115.31, Dynal Biotech). Бусины сначала отмывали от азида натрия, а затем инкубировали с мышиными моноклональными антителами против человеческого антигена c-kit (CD117) на льду в течение 30-40 минут при покачивании. После этого бусины отмывали от не связавшихся антител и добавляли к суспензии клеток из расчета 4 бусины на клетку. Клетки инкубировали с бусинами в течение 30-40 мин на льду при покачивании, после чего смесь клеток и бусин помещали в магнит (Dynal Biotech) на 1-2 мин и разделяли на две фракции: клетки, не связавшиеся с иммуно-магнитными бусинами, оставались в растворе, а клетки, связавшиеся с бусинами, вместе с бусинами иммобилизовались на стенке пробирки. Содержание c-kit+ клеток в культуре удалось увеличить до 20% (фиг.4). Все клетки высаживали на стерильные покровные стекла в чашки Петри (Corning) в среду DMEM/10% FSB/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин (GIBCO BRL). Через двое суток среду сменяли, а еще через неделю клетки переводили на дифференцировочные среды.

Пример 5. Индукция дифференцировки.

Для индукции дифференцировки клетки переводили на культивирование в одной из дифференцировочных сред, приведенных в таблице. Среды для культивирования готовили непосредственно перед использованием; смену среды проводили через каждые 3-5 дней; культивирование проводили в тех же условиях, что и в примере 2. Визуальное наблюдение проводили ежедневно с использованием инвертированного микроскопа (Nikon). Для исследования на наличие специфических маркеров клетки окрашивали методом иммунофлуоресцентного окрашивания и анализировали, как описано в Примере 3.

Таблица
Состав дифференцировочных сред
Направление дифференцировки Состав среды культивирования Ростовые факторы/добавки
Кардиомиогенное DMEM/IMDM/5% FBS/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин LIF, EGF, bFGF
Нейрональное DMEM /199/5% FBS/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин LIF, EGF, bFGF
Эндотелиальное DMEM /IMDM/5% FBS/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин EGF, bFGF, VEGF

В результате проведенных экспериментов было установлено, что при культивировании мультипотентных клеток в среде для кардиомиогенной дифференцировки (см. таблицу) через 1-3 дня в культуре наблюдались клетки, экспрессирующие маркеры ранней кардиогенной дифференцировки GATA-4 и Nkx-2.5, а через 7-9 дней в культуре обнаруживались клетки, экспрессирующие структурные белки зрелых кардиомиоцитов: тропонин I, легкую цепь-1 миозина сердца, коннексин 43 и способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 -aктинин (фиг.5).

При культивировании мультипотентных клеток в среде для эндотелиальной дифференцировки уже на 1 день в культуре наблюдались клетки, экспрессирующие маркер эндотелиальных клеток-предшественников - CD105 и/или маркер зрелых эндотелиальных клеток - CD31 (фиг.5). Помимо этого, в культурах, поддерживавшихся на среде для эндотелиальной дифференцировки, выявлялись гладкомышечные клетки, экспрессировавшие гладкомышечный альфа-актин (фиг.6).

При индукции дифференцировки в нейрональном направлении на 5 день выявлялись клетки, по морфологии напоминающие нейральные (фиг.6), которые при окрашивании антителами к различным маркерам нервных клеток демонстрировали экспрессию маркера нейральной дифференцировки способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706 III тубулина и при этом не экспрессировали маркер глиальных клеток GFAP.

Заключение

Таким образом, при создании настоящего изобретения показано, что ткань аневризмы сердца содержит пул стволовых клеток, способных при выделении и культивировании в соответствующих условиях пролиферировать и дифференцироваться с образованием кардиомиоцитов, нейральных, эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудов. Выделение, экспансия и дифференцировка in vitro стволовых клеток сердца из данного источника представляется новым перспективным подходом, который может быть в дальнейшем использован для клеточной терапии пораженных участков миокарда у определенной категории больных.

способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706

способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706

способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры   мультипотентных клеток сердца для клеточной терапии и/или тканевой   инженерии в зоне ишемии миокарда, патент № 2366706

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения и индукции направленной дифференцировки культуры мультипотентных клеток сердца, предусматривающий выделение популяции клеток из ткани аневризмы сердца, обработку их методом непрямого иммуномагнитного сортинга с получением фракции, обогащенной c-kit-позитивными клетками, культивирование полученной фракции клеток в питательной среде для выращивания клеток млекопитающих без добавления специфических факторов роста в течение 9-10 дней и индукцию дифференцировки мультипотентных клеток в эндотелиальном, кардиомиоцитарном или нейральном направлении путем помещения культуры в дифференцировочную среду, составом которой определяется желаемое направление дифференцировки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для индукции дифференцировки клеток в эндотелиальном направлении используют среду DMEM/IMDM/5% FBS с добавлением EGF, bFGF и VEGF.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для индукции дифференцировки клеток в кардиомиоцитарном направлении используют среду DMEM/IMDM/5% FBS с добавлением LIF, EGF и bFGF.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для индукции дифференцировки клеток в нейральном направлении используют среду DMEM/199/5% FBS с добавлением LIF, EGF и bFGF.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2366706

patent-2366706.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N5/08 клетки или ткани человека

Патенты РФ в классе C12N5/08:
применение окиси углерода для улучшения результата тканевой и органной трансплантации и подавления апоптоза -  патент 2376997 (27.12.2009)
способ выращивания плюрипотентных стволовых клеток -  патент 2375448 (10.12.2009)
клеточная линия меланомы человека mel gus, используемая для получения противоопухолевых вакцин -  патент 2373280 (20.11.2009)
клеточная линия меланомы человека mel ch, используемая для получения противоопухолевых вакцин -  патент 2373279 (20.11.2009)
способ получения аутологичной вакцины для лечения туберкулеза -  патент 2372936 (20.11.2009)
способ получения индуцирующих воспринимаемость трансплантата клеток моноцитарного происхождения, способ получения фармацевтической композиции для подавления реакций отторжения трансплантата, индуцирующие воспринимаемость трансплантата клетки моноцитарного происхождения, клеточный препарат для индукции воспринимаемости трансплантата, фармацевтическая композиция для подавления реакций отторжения трансплантата, применение индуцирующих воспринимаемость трансплантата клеток (варианты), способ получения и/или размножения регуляторных т-лимфоцитов, гибридомная клеточная линия, антитело и применение антитела -  патент 2370535 (20.10.2009)
способ оценки жизнеспособности культивируемых эмбриональных клеток печени -  патент 2366704 (10.09.2009)
способ повышения функциональной активности сетчатки при ее патологии различного генеза -  патент 2364382 (20.08.2009)
линия клеток меланомы человека kg, секретирующих рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор -  патент 2362805 (27.07.2009)
способ увеличения количества гемопоэтических недифференцированных стволовых клеток пациента ex vivo -  патент 2360965 (10.07.2009)

Наверх