способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) при анаплазмозе крупного рогатого скота

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота, состоящий из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их антигеном при 70°С в течение 30 мин, отличающийся тем, что в качестве антигена используют антиген, полученный путем культивирования культуры Anaplasma sp.Omsk на клетках Vero и питательной среде поддержки роста Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки, аминокислот и антибиотиков, извлечения после восьмисуточной инкубации путем попеременного замораживания и оттаивания, прогревания на водяной бане при 70°С в течение 30 мин и трехкратного отмывания без добавления к нему на последнем этапе приготовления 0,4% нормальной кроличьей сыворотки.

Описание изобретения к патенту

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) относится к методам лабораторной диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и может быть использован в ветеринарной медицине.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума, ранее используемый для диагностики микоплазмоза свиней в РНГА (Андросик, Н.Н. // Ветеринария, 2000 № 3).

Но данный способ имеет недостатки: трудоемкий метод фиксации эритроцитов, проводится танизация, неэкономичные и сложные методы сенсибилизации эритроцитов сенситином.

Наиболее близким к заявляемому способу является бруцеллезный эритроцитарный диагностикум (Красиков, А.П. Новые механизмы исскуственной регуляции паразитохозяинных отношений: дис. доктора вет. наук.: 16.00.03./А.П.Красиков; - Новосибирск - 1996. - С.97-101), который готовится по следующей схеме:

В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума применяются эритроциты барана. При формалинизации эритроцитов используется свежая дефибринированная кровь барана - донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН - 7,2 (0,137 М хлористый натрий и 0,001 М двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды).

Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П., которая заключается в более щадящем способе воздействия раствора формальдегида на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего к 100 мл разведенной крови раствор формальдегида добавлялся не сразу, а порциями в возрастающих объемах, через определенный промежуток времени.

Так, к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-й раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 мин: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН - 7,2 путем центрифугирования при 3 тыс.об/мин 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% двадцати процентного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

Второй этап приготовления эритроцитарного диагностикума - получение антигена, который обладает способностью адсорбироваться на эритроцитах. С этой целью используется глубокодиссоциированный вакцинный штамм В. abortus 16/4. Антиген готовят по методике ВНИИБТЖ - ИЭВСиДВ. Для этого девитализированную бактериальную массу центрифугируют при 3 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бактериальную массу воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1.

Бактериальную массу с фенолом выдерживают 30-40 мин при Т 80-85°С на водяной бане. Затем добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°С, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. После фильтрации смеси проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против десяти объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализат используют в качестве антигена.

Танизацию эритроцитов исключают из цикла приготовления эритроцитарного диагностикума в связи с низким содержанием белка в полученном антигене.

Для нагрузки формалинизированных эритроцитов бруцеллезный антиген разводят 1:10 буферным раствором с рН 6,4. Данной дозой антигена сенсибилизируют эритроциты в соотношении 2:1 (2 объема антигена, 1 объем эритроцитов). Сенсибилизация проводится на водяной бане при температуре 70°С, в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% сорока процентного раствора формальдегида. Полученный эритроцитарный диагностикум трехкратно отмывают буферным раствором с рН - 7,2 с добавлением отрицательной на бруцеллез нормальной кроличьей сыворотки в соотношении 1:250 путем центрифугирования при 3 тыс. об/мин в течение 5 мин и доводят тем же буфером до 3%-й концентрации эритроцитов с добавлением 1% формальдегида с целью закрепления антигена на эритроцитах.

Целью нашего изобретения является получение анаплазмозного эритроцитарного диагностикума (АЭД) для выявления антител в сыворотке крови крупного рогатого скота в РИГА.

Поставленная цель достигается: дробной формалинизацией эритроцитов барана, получением антигена из Anaplasma sp.Omsk, сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов барана, без предварительной танизации анаплазмозным антигеном, при 70°С в течение 30 мин., с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН -7,2 без добавления нормальной кроличьей сыворотки.

Описание метода

При формалинизации эритроцитов используют свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором РН - 7,2 (0,137 М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорно-кислый калий на 1 л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П. Для этого к 100 мл 50%-й взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-й раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 мин: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором РН - 7,2 путем центрифугирования при 3 тыс. об/мин в течение 2-5 мин и ресуспензируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10%-ю рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% двадцатипроцентного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.

В качестве сенситина используется корпускулярный антиген Anaplasma sp.Omsk (штамм анаплазм «Омск/2004» депонирован во Всероссийском музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под инвентарным № 138 от 19.09.2005).

Для этого выращивали культуру клеток Vera в стеклянных флаконах в концентрации 150 тыс. на 1 мл. В качестве питательной среды использовали среду Игла MEM с двойным набором аминокислот, с добавлением 10%-й эмбриональной сыворотки и антибиотиков (пенициллин в дозе 1 млн ед. и стрептомицин в дозе 500 тыс ед. на 1 мл). На следующие сутки после образования монослоя проводили замену среды роста на среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1%-й эмбриональной сыворотки). Подготовленные флаконы заражали суспензией анаплазм, полученной из селезенки, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками Vero центрифугировали при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 1 часа, после центрифугирования среду меняли на свежую среду поддержки. Флаконы помещали при анаэробных условиях и 36°С на 8 суток. После завершения инкубации все флаконы промораживали при -20°С в течение 30 мин, а затем оттаивали при +18°С. После оттаивания клеточную взвесь центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 15 мин и для дальнейшей работы отбирали супернатант. Для накопления антигенной биомассы анаплазмы пассировались до 8 раз.

Для выделения анаплазм из клеток использовали указанный выше способ попеременного замораживания, и размораживания, и центрифугирования клеточной взвеси. Для дальнейшей работы использовали супернатант, который дополнительно центрифугировали при 6 тыс.об/мин в течение часа. Полученный осадок трижды отмывали стерильным физиологическим раствором, центрифугируя в том же режиме, и доводили этим же раствором до концентрации 1:1. Для нагрузки формалинизированных 2,5-3% эритроцитов делали различные разведения (1:1, 1:2, 1:4, 1:8) инактивированного при 70°С - 30 мин антигена на буферном физ. растворе рН - 6,4. Данными дозами антигена сенсибилизировали эритроциты в соотношении 2:1 (2 обьема антигена : 1 обьем эритроцитов). При этом сенсибилизацию проводили на водяной бане при +70°С в течение 30 мин, при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления антигена на эритроцитах добавляли 1% формальдегида.

Эритроциты, нагруженные антигеном, трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН - 7,2 путем центрифугирования при 3 тыс. об/мин, ресуспендируют в этом же растворе, доводя до первоначальной 3%-й концентрации, и используют для постановки РИГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.

Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 мин при 56°С разводят в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН - 6,4), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста. Для определения активности полученного эритроцитарного диагностикума проводили постановку РНГА. Реакцию ставили макрометодом, в обьеме 0,5 мл в полистироловых пластинках положительную анаплазмозную сыворотку разводили с 1:10 до 1:160. В качестве разбавителя применяли фосфатный буфер рН - 6,4.

Контроль на специфичность и активность АЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий анаплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. АЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, лептоспирозной, листериозной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженной положительной реакции с гомологичной анаплазмозной сывороткой.

Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:10 и выше (табл.1).

Таблица 1
Активность и специфичность эритроцитарного анаплазмозного диагностикума
Разведение анаплазмозной сыворотки	Разведение эритроцитарного диагностикума
1:1	1:2	1:4	1:8
1:10	-	-	++++	+
1:20	-	-	+++	+
1:40	-	-	++	+
1:80	-	-	++	-
1:160	-	-	-	-
Разведение эритроцитарного диагностикума	Стандартные диагностические сыворотки (1:10).
бруцеллезная	лептоспирозная	листериозная	хламидиозная
1:4	-	-	-	-

Наиболее показательным является эритроцитарный диагностикум, сенсибилизированный анаплазмозным антигеном в разведении 1:4, который выявлял антитела в сыворотке кролика в титре 1:20 на +++. При этом полученный диагностикум обладал высокой специфичностью и не давал перекрестных реакций с лептоспирозной, листериозной и хламидиозной стандартными диагностическими сыворотками животных.

Определены специфичность и активность трех серий АЭД в РНГА (табл.2).

Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота.

Контроль на специфичность АЭД в РНГА

Для контроля специфичности полученных серий анаплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. АЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, лептоспирозной, листериозной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженной положительной реакции с гомологичной анаплазмозной сывороткой. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:10 и выше (табл.2).

Контроль на активность АЭД в РНГА

Для контроля активности полученного эритроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом, в объеме 0,5 мл в полистироловых пластинках с анаплазмозными сыворотками в разведениях с 1:10 до 1:640. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с рН - 6,4, так как при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля используют фосфатный буферный раствор (ФБР) рН - 6,4 и заведомо отрицательные и положительные на анаплазмоз сыворотки крупного рогатого скота в разведениях 1:25-1:1600 и кроликов в разведениях 1:10-1:640.

С анаплазмозными кроличьими сыворотками различной активности полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:160, на два креста 1:320, а с анаплазмозной сывороткой крупного рогатого скота (крс) до разведении 1:400 и 1:800 соответственно. В контроле с отрицательными (кроличьей и крс) сыворотками и с буферным раствором отмечается четко выраженная отрицательная реакция (табл.3).

Таблица 3
Активность (АЭД) в РНГА
Анаплазмозные кроличьи сыворотки	Негативная сыв-ка кролика	Анаплазмозная сыворотка крупного рогатого скота	Негативная сыв-ка крс	ФБР
титр сыв-ки	а	б	в
титр сыв-ки	г
1:10	++++	++++	++++	-	1:50	++++	-	-
1:20	+++	++++	++++	-	1:100	++++	-	-
1:40	+++	++++	++++	-	1:200	++++	-	-
1:80	++	+++	+++	-	1:400	+++	-	-
1:160	-	+++	++	-	1:800	++	-	-
1:320	-	++	+	-	1:1600	+	-	-
1:640	-	-	-	-	1:3200	-	-	-
Примечание: а, б, в, г - сыворотки различной активности, ФБР - фосфатный буферный раствор рН - 6,4