лекарственное средство, обладающее противовирусным действием и содержащее 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидин-7(3н)-он
Классы МПК: | C07D487/04 орто-конденсированные системы A61K31/4196 1,2,4-триазолы A61P29/00 Анальгетики нецентрального действия, жаропонижающие или противовоспалительные средства, например противоревматические средства; нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) |
Автор(ы): | Русинов Владимир Леонидович (RU), Уломский Евгений Нарциссович (RU), Чарушин Валерий Николаевич (RU), Чупахин Олег Николаевич (RU), Логинова Светлана Яковлевна (RU), Борисевич Сергей Владимирович (RU), Хамитов Равиль Авгатович (RU), Максимов Владимир Алексеевич (RU) |
Патентообладатель(и): | Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского Уральского отделения Российской Академии Наук (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-05-21 публикация патента:
27.08.2009 |
Описывается новое применение 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3н)-она. Вещество обладает противовирусным действием в отношении вируса гриппа A (H5N1), вируса лихорадки Западного Нила и других вирусных инфекций. Противовирусная активность широкого спектра действия выявлена впервые. 8 табл.
Формула изобретения
Лекарственное средство, обладающее противовирусным действием и содержащее 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он формулы
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается лекарственного средства, содержащего 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики инфекционных вирусных заболеваний животных и человека, и может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, в животноводстве и птицеводстве.
Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью. В литературе описано получение 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она нитрованием 5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Y.Makisumi Synthesis of potential anti-cancer agents. VII. 6-Nitro- and 6-amino-s-triazolo[2,3-a]pyrimidines, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1961, № 9, p.873-877; Т.П.Кофман, Т.А.Уварова, Г.Ю.Карцева, Т.Л.Успенская 6-Нитро- и 6-бромпроизводные 4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, Журнал органической химии, 1997, т.33, вып.12, с.1784-1793); упоминается также натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а] пиримидин-7-она (М.Н.Кушнир, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, Н.А.Клюев, С.В.Шоршнев, Г.Г.Александров, О.Н.Чупахин Нитроазины. XXII. Алкилирование и прототропная таутомерия в ряду 6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидинов, Журнал органической химии, 1993, т.29, вып.3, с.629-638); также имеются данные об анти-арбовирусной активности 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Виноград И.А., Пластунов В.А., Козловский М.М., Бенцель Л.В., Билецка Г.В., Лозинский И.М., Рогочий Е.Г., Шоломей М.Д. Микробioлогичнiй Журнал. 2001, т.63, № 2, с.14-19).
В качестве изобретения предлагается лекарственное средство, содержащее активную составляющую, обладающую противовирусным действием и представляющую собой 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он формулы (1). Кроме соединения (1) лекарственное средство может содержать фармацевтически приемлемые компоненты: наполнители, разбавители и/или другие вспомогательные вещества.
Для оценки противовирусных свойств соединения (1) и лекарственного средства на его основе использованы известные противовирусные лекарственные препараты - ремантадин, арбидол и рибавирин.
Соединение (1) получено конденсацией 3-метилтил-5-амино-1,2,4-триазола (2) с ацетоуксусным эфиром с последующим нитрованием образующегося 2-метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (3).
Соединение (1) представляет собой бледно-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, этаноле, диметилсульфоксиде, нерастворимое в этилацетате, хлороформе, гексане.
Данные элементного анализа, ЯМР 1Н и ИК-спектроскопии соединения (1) полностью соответствуют приписываемому строению (см. пример 1).
Лекарственное средство может быть использовано либо перорально, либо с помощью парентеральных инъекций в растворе. Оно может применяться самостоятельно, например в форме микрокапсул, либо с подходящими вспомогательными средствами и/или наполнителями.
Подходящие твердые или жидкие лекарственные формы включают, к примеру, гранулы, порошки, покрытые оболочкой таблетки, микрокапсулы, суппозитории, сиропы, эликсиры, суспензии, эмульсии, капли или инъекционные растворы, а также препараты с целевой доставкой активной субстанции, в производстве которых обычно используются вспомогательные вещества, такие как наполнители, дезинтеграторы, связующие, создающие оболочку агенты, разрыхлители, смазочные добавки, отдушки или подсластители. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, диоксид титана, лактоза, маннитол и другие сахара, тальк, молочный альбумин, желатин, мука, целлюлоза и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода, и моноатомные и полиатомные спирты, например глицерин.
Пример 1. Синтез 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]-пиримидин-7(3Н)-она (1)
1 стадия: 2-Метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он (2). Смесь 130 г (1 моль) 3-метилтио-5-амино1,2,4-триазола (3) и 140 мл (1,1 моль) ацетоуксусного эфира в 300 мл уксусной кислоты кипятят в течение 2 часов. После охлаждения реакционной массы выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из воды и сушат на воздухе при комнатной температуре. Выход (2) 125,5 г (64%).
2 стадия: 2-Метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он (1). К смеси 76 мл (1,25 моль) концентрированной азотной кислоты (d 1,4 г/мл) и 250 мл концентрированной серной кислоты (d 1,83 г/мл), охлажденной до 0°С, добавляют порциями 98 г (0,5 моль) 2-метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-она (3) таким образом, чтобы температура реакционной массы не превышала 40°С. После добавления всего вещества реакционную массу перемешивают 3 часа при комнатной температуре и выливают в 500 мл ледяной воды. Полученный раствор нейтрализуют концентрированным водным аммиаком и отфильтровывают выпавший осадок аммониевой соли. Аммониевую соль суспендируют в 40 мл воды, охлаждают до 5°С и аккуратно приливают концентрированную соляную кислоту до рН 1. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Выход (1) 67,5 г (54%).
2-Метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он имеет следующие физико-химические характеристики:
ТПЛ>280°С; 1Н ЯМР-спектр в ДМСО-d 6 , м.д.: 2,57 (3Н, т, С-СН3), 3,02 (3Н, с, SCH 3), 10,2 (1Н, уш.с, NH). Найдено: С - 34.62, Н - 3,07, N - 29,22. Брутто-формула - С7Н7N5 O3S. Вычислено: С - 34.85, Н - 2.92, N - 29.03%. ИК-спектр, , см-1: 1365, 1558 (вал, NO2), 1720 (вал, С=O), 3420 (вал, NH).
Пример 2. Оценка токсичности соединения (1)
1. Оценка цитотоксичности.
Цитотоксичность оценивали в отношении культуры клеток GМК-АН-1(Д) и СПЭВ. Плотность клеток составляла 250 тыс./мл. Суспензию клеток по 1 мл вносили в стеклянные пробирки, в течение 48 ч инкубировали при 37°С для формирования монослоя. Подготовленные на среде поддержания в концентрации от 500 до 2 мкг/мл соединение (1) вносили в пробирки с монослоем культуры клеток. На каждую дозу соединения (1) использовали по 4 пробирки с монослоем. Визуальный учет с помощью светового микроскопа проводили ежедневно. Начальные этапы цитопатического действия (ЦПД) характеризовались изменением морфологии клеток, далее наблюдали их округление и отслоение от стекла, разрушение монослоя. В зависимости от концентрации препарата ЦПД наступало на 1-7 сутки после внесения препаратов.
Деструктивные изменения 50% клеток СПЭВ наблюдали при внесении в питательную среду 500 мкг/мл соединения (1). В 25% случаях деструкцию монослоя клеток вызывало соединение в дозе 250 мкг/мл. В культуре клеток GMK-AH-(Д) 50% деструкцию монослоя вызывало внесение в питательную среду 500 мкг/мл соединения. При внесении соединения в концентрации 250 мкг/мл цитопатические изменения в культуре клеток СПЭВ и GMK-AH-1(Д) не были обнаружены.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что максимально-переносимая доза (МПД) соединения (1) для культуры клеток СПЭВ составляет 125 мкг/мл, GMK-AH-1(Д) - 25 мкг/мл.
2. Острая токсичность для лабораторных животных
Острую токсичность соединения (1) оценивали для неинфицированных 2-недельных белых мышей-сосунков при однократном пероральном введении соединения (1). Разведения соединения (1) в диапазоне от 30 мг/кг до 2000 мг/кг готовили на физ. растворе и вводили животным по 0.05 мл однократно. На каждое разведение использовали не менее 20 животных, за которыми осуществляли наблюдение в течение 14 дней. Рассчитывали ЛД50 по Керберу в модификации И.П.Ашмарина. Контролировали изменения в поведении животных, внешнего вида, веса, а также отсутствие или наличие гибели животных. Результаты оценки токсичности, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что соединение (1) в концентрации от 30 до 250 мг/кг нетоксично для белых мышей массой 4-5 г при однократном пероральном применении. При максимально используемой дозе 100% гибель животных при однократном применении соединения (1) также отсутствовала.
Таким образом, рассчитать ЛД50 для белых мышей не представляется возможным. В более высоких концентрациях в малом объеме растворителя соединение (1) плохо растворимо, густая консистенция их не позволяет использовать конюли для введения животным.
Таблица 1 Оценка токсичности препаратов при однократном пероральном введении белым мышам - сосункам | |||||||
Препарат | Концентрация препарата, мг/кг массы животного | ||||||
2000 | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62 | 31 | |
количество животных павших/количество животных в опыте | |||||||
Соединение (1) | - | 2/20 | 1/20 | 0/20 | 0/20 | 0/20 | 0/20 |
Пример 3. Изучение эффективности соединения (1) в культурах клеток
1. В отношении вируса Западного Нила
Изучение противовирусной эффективности соединения (1) в отношении вируса Западного Нила (ЗН) проводили в культуре клеток GMK-АН-1(Д). Для изучения противовирусной эффективности соединение (1) вносили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 4 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса в течение 60 минут при температуре от (37,0±0,5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Затем вносили свежую среду, содержащую исследуемые дозы соединения (1), и инкубировали в течение 2-х суток при температуре от (37,0±0,5)°С. По окончании инкубации клетки разрушали криодеструкцией: трехкратным быстрым замораживанием (в криостате при температуре минус 30°С) и быстрым оттаиванием (водяная баня при комнатной температуре). Уровень накопления возбудителя в исследуемых пробах определяли титрованием проб методом получения негативных колоний вируса в монослое культуры клеток GMK-AH-1(Д) под твердым агаровым покрытием.
Результаты оценки противовирусной эффективности представлены в таблице 2. При применении в максимально переносимой концентрации соединения (1) подавление репродукции вируса составило 60,0%.
Таблица 2 Изучение влияния препаратов на репродукцию вируса ЗН, штамм Eg 101 в культуре клеток GMK-AH-1(Д) | ||||
Препарат | Доза препарата, мкг/мл | Уровень накопления вируса, lg БОЕ/мл | Уровень подавления репродукции вируса, , lg | Коэффициент ингибирования, процент |
2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Соединение (1) | 100 | 6,5 | 0,4 | 60,0 |
10 | 6,7 | 0,2 | 37,5 | |
1 | 6,8 | 0,1 | 18,8 | |
Рибавирин | 100 | 5,0 | 1,9 | 98,6 |
Контроль дозы вируса | - | 6,9 | - | - |
2. В отношении вируса гриппа A (H5N1)
Оценку эффективности в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили in vitro в культуре клеток МДСК. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных РКЭ с биологической активностью 6,5 lg ЦПД50/мл.
Для изучения противовирусной эффективности соединение (1) и ремантадин вносили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 10 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,1 ЦПД50/клетку. После адсорбции вируса в течение 60 минут при температуре от (37,0±0,5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, затем вносили свежую среду, содержащую различные концентрации исследуемых препаратов, и инкубировали в течение 3-х суток при температуре от (37,0±0,5)°С. По окончании инкубации визуально учитывали цитопатический эффект, вызванный в культуре клеток вирусом, с использованием светового микроскопа (объектив х 8-10, окуляр х 7-10).
Результаты изучения подавления цитопатической активности вируса гриппа препаратами в культуре клеток MDCK, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что при использовании соединения (1) через 1 ч после инфицирования культуры клеток уровень подавления ЦПД вируса составил 40%.
Таблица 3 Оценка эффективности препаратов в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) в культуре клеток MDCK по подавлению цитопатического действия вируса | |||
Препарат | Доза препарата, мкг/мл | Частота выявления ЦПД, Х | Подавление ЦПД, процент, Х± х |
Соединение (1) | 100,0 | 19/30 | 36,6±3,3 |
10,0 | 25/30 | 16,7±3,3 | |
1,0 | 10/10 | 0 | |
Ремантадин | 25 | 3/30 | 86,7±3,3 |
Контроль дозы | - | 30/30 | - |
Контроль среды | - | 0/10 | - |
В таблице 4 проведены результаты изучения подавления репродукции вируса в культуре клеток MDCK. Уровень накопления вируса оценивали титрованием проб по гибели РКЭ. Соединение (1) в максимальной концентрации также статистически значимо подавляет репродукцию вируса гриппа. При этом коэффициент ингибирования составил 98,2%. Препарат сравнения ремантадин практически полностью подавлял репродукцию вируса.
Таблица 4 Оценка эффективности препаратов в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) в культуре клеток MDCK по подавлению репродукции вируса | |||||
Препарат | Доза препарата, мкг/мл | Схема внесения препарата | Уровень накопления вируса, lg ЭЛД50/мл | Уровень подавления накопления вируса, , lg | Коэффициент ингибирования, процент |
Соединение (1) | 100 | +1 ч | 5,3 | 1,7 | 98,2 |
Ремантадин | 25 | +2 ч | 2,0 | 5,0 | 99,99 |
Контроль | - | - | 7,0 | - | - |
Пример 4. Изучение эффективности препаратов на лабораторных животных 1. Изучение эффективности препаратов в отношении вируса гриппа А (H5N1)
Оценку эффективности в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили in vivo с использованием белых мышей массой 12-15 г. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных РКЭ с биологической активностью 6,5 lg ЦПД50/мл, 9,01g ЭЛД50/мл, 5,0 lg ЛД50/мл.
Соединение (1) и соединение сравнения вводили белым мышам перорально по профилактической и лечебной схемам, а также по схеме экстренной профилактики.
Результаты изучения профилактической эффективности соединения в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1), представлены в таблицах 5. Защита от гибели при использовании соединения (1) составила в среднем 20%.
Таблица 5 Изучение профилактической эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) | |||||||
Препарат | Схема введения препарата | Доза препарата, мг/кг | Количество животных в группе | Гибель животных | Защитная эффективность от гибели, процент | Среднее время жизни животных в группе, дни | Увеличение средней продолжительности жизни, , дни |
-120 ч | 9,4 | 0,7 | |||||
Соединение (1) | -24 ч, -1 ч | 50 | 20 | 16 | 20 | ||
60 | 20 | 11 | 47 | 11,3 | 2,8 | ||
Арбидол | -24 ч, -1 ч | ||||||
30 | 20 | 11 | 45 | 11,6 | 2,5 | ||
Контроль дозы | - | - | 20 | 20 | - | 8,7 | - |
Контроль стада | - | - | 20 | 0 | - | 14 | - |
Результаты изучения эффективности соединения (1) и препаратов сравнения при применении его по схеме экстренной профилактики и лечебной схеме, представленные в таблицах 6 и 7, свидетельствуют об эффективности заявляемого соединения.
Таблица 6 Изучение эффективности в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) при введении его по схеме экстренной профилактики | ||||||
Препарат | Схема введения препарата | Доза препарата, мг/кг | Частота гибели животных | Защитная эффективность от гибели, процент | Среднее время жизни животных в группе, дни | Увеличение средней продолжительности жизни, , дни |
Соединение (1) | +1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч, +120 ч, 144 ч | 50 | 10/20 | 50 | 11,7 | 3,5 |
Арбидол | 30 | 16/20 | 20 | 9,4 | 1,2 | |
Контроль дозы | - | - | 20/20 | - | 8,2 | |
Контроль стада | - | - | 0/20 | - | 14,0 | - |
Таблица 7 Изучение лечебной эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) | ||||||
Препарат | Схема введения препарата | Доза препарата, мг/кг | Частота гибели животных | Защитная эффективность от гибели, % | Среднее время жизни животных в группе, дни | Увеличение средней продолжительности жизни, , дни |
Соединение (1) | +24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч, | 15/20 | 25 | 8,4 | 1,7 | |
+120 ч, +144 ч | 50 | |||||
Арбидол | +24 ч, +48 ч, +7 | 135 | 18/20 | 10 | 7,1 | 0,4 |
2 ч, +96 ч | ||||||
Контроль дозы | - | - | 20/20 | - | 6,7 | - |
Контроль стада | - | - | 0/20 | - | 14,0 | - |
2. Изучение эффективности в отношении вируса Западного Нила
Для оценки протективной эффективности белых мышей инфицировали подкожно в дозе 10ЛД 50. Препараты вводили перорально в дозе 50 мг/кг по следующим схемам: профилактика - в течение 6 суток до инфицирования раз в день и за 1 ч до инфицирования; экстренная профилактика - через 1 ч после инфицирования и далее в течение 5 суток; лечение - через 24 ч после инфицирования и далее в течение 6 суток. Результаты оценки эффективности, представленные в таблице 8, свидетельствуют о том, что соединение (1) эффективно в отношении экспериментальной формы ЛЗН у белых мышей и защищает от гибели 20% инфицированных животных. При этом удлинение СВЖ составило 2,3 суток. При экстренной профилактике защитная эффективность составила 20%.
Таблица 8 Результаты оценки эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы лихорадки Западного Нила у белых мышей | ||||||
Препарат | Схема | Коэффици- ент защиты, % | Среднее время жизни, сутки | Удлинение среднего времени жизни, сутки | Уровень накопления вируса в головном мозгу павших животных | |
lg БОЕ/мл | , lg | |||||
-144 ч, -120 ч, -96 ч, | 20,0 | 14,5 | 2,3 | 7,4 | 0,9 | |
-72 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч | ||||||
Соединение | +1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, | 20,0 | 14,0 | 1,8 | 7,5 | 0,8 |
(1) | +96 ч, +120 ч, +144 ч | |||||
+24 ч, +48 ч, +72 ч, +9 | 0 | 12,1 | 0 | 8,5 | 0 | |
6 ч, +120 ч, +144 ч | ||||||
-72 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч | 50,0 | 17,1 | 4,9 | 6,1 | 2,2 | |
+1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, | 85,0 | 21,0 | 8,8 | 0 | 8,3 | |
Рибавирин | +96 ч, +120 ч, +144 ч | |||||
+24 ч, +48 ч, +72 ч, +9 | 10,0 | 12,3 | 0,1 | 7,8 | 0,5 | |
6 ч, +120 ч, +144 ч | ||||||
Контроль дозы | - | - | 12,2 | - | 8,3 | - |
Контроль стада | - | - | 21,0 | - | - |
Таким образом, лекарственное средство, содержащее в качестве активной составляющей соединение (1) - 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он, обладает высоким противовирусным действием, превышающим действие известных лекарственных средств, и может быть использовано в качестве противовирусного средства.
Класс C07D487/04 орто-конденсированные системы
Класс A61K31/4196 1,2,4-триазолы
Класс A61P29/00 Анальгетики нецентрального действия, жаропонижающие или противовоспалительные средства, например противоревматические средства; нестероидные противовоспалительные средства (НПВС)