способ определения относительного содержания протопорфирина iх в биологических тканях

Формула изобретения

Способ определения относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях, включающий проведение спектроскопии при возбуждении флуоресценции гелий-неоновым лазером 632.8 нм и запись спектров аутофлуоресценции в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z₁, Z ₂, Z₃ Z_n}, отличающийся тем, что дополнительно формируют массивы данных, состоящие из интенсивностей флуоресценции кератина {Y₁, Y₂, Y₃ Y_n} и протопорфирина IX {Х₁, Х ₂, Х₃ Х_n} для тех же значений длин волн, и определяют относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях по формуле



где I%_ППIX - относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях, где {k₁ k₂ k_n} и {l₁ l₂ l_n} вычисляют по формулам



где и вычисляют по формулам





где {a₁ a₂ a_n}, {b₁ b₂ b_n}, {ab₁ ab₂ ab_n}, {f₁ f₂ f_n}, {fa₁ fa₂ fa_n}, {fb₁ fb₂ fb_n} вычисляют по формулам





где Х_ср, Y_сp и Z_cp вычисляют по формулам

Х_ср=(Х₁+Х ₂+Х₃ Х_n)/n;

Y_cp=(Y₁ +Y₂+Y₃ Y_n)/n;

Z_cp=(Z₁ +Z₂+Z₃ Z_n)/n,

где n - количество записей в массивах данных, состоящих из значений интенсивности флуоресценции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и предназначено определения относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях без использования экзогенных фотосенсибилизаторов и препаратов, индуцирующих аутофлуоресценцию.

Относительное содержание протопорфирина IX в тканях близко пропорционально удельной доле флуоресценции протопорфирина IX в суммарном спектре аутофлуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 632.8 нм. Ранее вклад флуоресценции протопорфирина IX в суммарный спектр аутофлуоресценции не оценивался. В ближайшем аналоге относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях также оценивается путем анализа спектра аутофлуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 632.8 нм, с тем отличием, что полученный спектр аутофлуоресценции тканей оценивается как полностью определяющийся люминесценцией протопорфиринов без учета вклада в суммарный спектр аутофлуоресценции других эндогенных флуорофоров [http://vrach-aspirant.ru/lib_show/12.html]. Поэтому до настоящего времени не существовало метода определения удельной доли протопорфирина IX в суммарном спектре аутофлуоресценции, основанного только на анализе спектра нативной аутофлуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 632.8 нм.

Задачей изобретения является разработка нового способа определения относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях путем анализа спектра нативной аутофлуоресценции без использования экзогенных флуорофоров и препаратов, индуцирующих аутофлуоресценцию.

Ткани человека содержат большое число разнообразных природных флуорофоров, которые имеют различные спектральные области флуоресценции. Некоторые флуорофоры имеют близкие или перекрывающиеся области флуоресценции, в результате чего полученное от тканей излучение флуоресценции имеет сложный спектральный состав. Например, если регистрируются два сигнала флуоресценции: первый - от флуорофора 1 (спектр 1, фиг.1) в диапазоне длин волн l₁ и второй - от флуофора 2 (спектр 2, фиг.1) в диапазоне l₂, то часть спектра 1 может перекрываться со спектром 2. В результате в диапазоне l₂ будет регистрироваться не сигнал, пропорциональный количеству флуорохрома 2, а суммарный сигнал от спектров 1 и 2 (спектр 3, фиг.1) [Van Dilla M.A., Dean P.N., Laerum O.D., Melamed M.R. (eds.) Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis , Acad. Press, London, 1985]. Поэтому спектр нативной аутофлуоресценции тканей носит сложный составной характер. Аутофлуоресценция тканей в красной области спектра характеризуется меньшей интенсивностью флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции в УФА и коротковолновой видимой областях. Одним из эндогенных флуорофоров, флуоресцирующих в красной области спектра, является протопорфирин IX. В силу преимущественного накопления протопорфирина IX в опухолевой ткани возникает флуоресцентный контраст между опухолью и окружающей ее здоровой тканью, что может применяться с целью флуоресцентной диагностики новообразований различной локализации. Ранее считалось, что протопорфирин IX полностью формирует спектр аутофлуоресценции при использовании длины волны возбуждающего излучения 632.8 нм [Синичкин Ю.П., Утц С.Р. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека. - Саратов: 2001].

Техническим результатом предлагаемого способа является возможность определения истинного относительного содержания протопорфирина IX в биологических тканях с исключением ошибок, связанных со сложным составным характером суммарного спектра аутофлуоресценции.

Технический результат достигается за счет того, что относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях оценивают как пропорциональное удельной доле его флуоресценции в суммарном спектре аутофлуоресценции, которую определяют по формуле.

При анализе спектра нативной аутофлуоресценции тканей человека нами были получены данные, что коллаген, кератин и порфирин определяют более 97% суммарного спектра в диапазоне 650-800 нм, при ех=632,8. Одновременно с этим спектр флуоресценции кератина практически неотличим от спектра флуоресценции высокогидратированного коллагена. Из последнего следует, что любой произвольный спектр моделируется суммой двух спектров эталонов, взятых с разными коэффициентами. Первым эталоном может выступать нативный спектр коллагена или кератина, вторым - спектр водного раствора синтетического протопорфирина-IX.

F_мод( )=k* F_кер( )+m*F_пп( ),

где F_мод( ) - модельный суммарный спектр, F_кер( ) - эталонный спектр кератина, F_пп( ) - эталонный спектр протопорфиринов при 650 800.

При вычислении долевого участия протопорфирина IX в формировании произвольного суммарного спектра критерием оценки может служить максимальная корреляция между произвольным суммарным спектром и модельным. Модельный синтезированный спектр из двух спектров-эталонов коррелирует с наблюдаемым спектром с коэффициентом 0.97-0.99, что является доказательством того, что доля спектра флуоресценции протопорфирина IX в анализируемом суммарном спектре аутофлуоресценции вычислена достоверно (фиг.2).

Способ осуществляют следующим образом. Проводят спектроскопию анализируемого участка кожи или слизистой оболочки с помощью флуоресцентно-спектроскопической установки, например ЛЭСА-01 (ГОСТ Р 50460-92)(гелий-неоновый лазер, 632.8 нм). Регистрацию полученного суммарного спектра аутофлуоресценции проводят с помощью компьютерной программы LESA-Soft '9 для MS Windows 1998-2000. Запись спектра аутофлуоресценции производят в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z₁, Z₂, Z₃ Z_n}. Эталонный спектр кератина записывают в виде массива данных, состоящего из интенсивностей флуоресценции кератина для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Y₁, Y₂, Y₃ Y_n} и для протопорфирина IX для тех же значений длин волн {X₁, X₂, X₃ X_n}. Относительное содержание протопорфирина IX (I%_ППIX) в суммарном спектре аутофлуоресценции вычисляют по формуле

,

где {k₁ k₂ k_n} и {l₁ l₂ l_n} вычисляют по формулам

; ,

где и вычисляют по формулам

,

где {a₁ а₂ a_n}, {b₁ b₂ b_n}, {ab₁ аb₂ ab_n}, {f₁ f₂ f_n}, {fa₁ fa₂ fa_n}, {fb₁ fb₂ fb_n} вычисляют по формулам

где Хср, Ycp и Zcp вычисляют по формулам

X_cp=(X₁+X₂+X ₃ X_n)/n;

Y_cp=(Y ₁+Y₂+Y₃ Y_n)/n;

Z_cp=(Z ₁+Z₂+Z₃ Z_n)/n;,

где n - количество записей в массивах данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции;

Полученное значение доли флуоресценции протопорфирина IX в анализируемом спектре аутофлуоресценции является пропорциональным относительному содержанию протопорфирина IX в биологических тканях.

Пример 1

Пациент И., 30 лет.

Клинический диагноз: каппилярная гемангиома кожи груди.

С помощью флуоресцентно-спектроскопической установки (гелий-неоновый лазер 632.8 нм) проводят спектроскопию зоны гемангиомы и окружающей ее здоровой кожи груди. Регистрацию полученных суммарных спектров аутофлуоресценции проводят с помощью компьютерной программы LESA-Soft '9 для MS Windows 1998-2000. Запись спектра аутофлуоресценции производят в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z₁, Z₂, Z₃ Z_n}. Эталонный спектр кератина записывают в виде массива данных, состоящего из интенсивностей флуоресценции кератина для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Y₁, Y₂, Y₃ Y_n} и для протопорфирина IX для тех же значений длин волн {X₁, X₂, X₃ X_n}. Относительное содержание протопорфирина IX (I%_ППIX) в суммарном спектре аутофлуоресценции вычисляют по указанной в описании формуле.

Доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции капиллярной гемангиомы составила 27.8%, удельная доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции кожи груди составила 29.4%. Полученные значения пропорциональны относительному содержанию протопорфирина IX в ткани гемангиомы и в окружающей его коже груди.

Пример 2

Пациентка Ф., 65 лет.

Клинический диагноз: Базально-клеточный рак (БКР) кожи нижнего века левого глаза.

С помощью флуоресцентно-спектроскопической установки (гелий-неоновый лазер 632.8 нм) проводят спектроскопию зоны БКР и окружающей ее здоровой кожи нижнего века. Регистрацию полученных суммарных спектров аутофлуоресценции проводят с помощью компьютерной программы LESA-Soft '9 для MS Windows 1998-2000. Запись спектра аутофлуоресценции производят в виде массива данных, состоящего из значений интенсивности флуоресценции для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Z₁, Z₂, Z₃ Z_n}. Эталонный спектр кератина записывают в виде массива данных, состоящего из интенсивностей флуоресценции кератина для последовательности длин волн от 649 нм до 850 нм с шагом 0.43 нм {Y₁, Y₂, Y₃ Y_n} и для протопорфирина IX для тех же значений длин волн {X₁, X₂, X₃ X_n}. Относительное содержание протопорфирина IX (I%_ППIX) в суммарном спектре аутофлуоресценции вычисляют по указанной в описании формуле.

Доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции БКР составила 36.8±2.6%, в то же время удельная доля флуоресценции протопорфирина IX в спектре аутофлуоресценции кожи нижнего века составила 26.4±3.0%. Полученные значения пропорциональны относительному содержанию протопорфирина IX в ткани БКР и в окружающей его коже нижнего века.

Таким образом, предложенный способ позволяет определить относительное содержание протопорфирина IX в биологических тканях с исключением погрешностей, связанных с включением в суммарный спектр аутофлуоресценции спектров флуоресценции других эндогенных флуорофоров, что в дальнейшем может использоваться для диагностики новообразований.