способ обнаружения вируса гриппа а подтипа h5n1

Формула изобретения

Способ обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1, предусматривающий проведение реакции обратной транскрипции с РНК вируса, совмещенной с реакцией амплификации на два гена, анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление РНК штаммов вирусов гриппа А по результатам анализа, отличающийся тем, что в качестве праймеров для проведения совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации как в двух ПЦР, так и мультиплексной ПЦР, используются олигонуклеотиды из 20 и 22 звеньев F-H5 ACAAGGTCCGACTACAGCTT и R-H5 ATTGATTCCAATTTTACTCCAC, комплементарные не менее чем на 95% гену гемагглютинина, и олигонуклеотиды из 22 звеньев F-N1 CAGAACATTAATGAGTTGTCCT и R-N1 TCTCAGTATGTTGTTCCTCCAA, комплементарные не менее чем на 95% гену нейраминидазы, выявление в анализируемых образцах продуктов ПЦР (фрагментов ДНК) размером 184 нуклеотидных пар при использовании праймеров, специфичных к гену гемагглютинина, и 213 нуклеотидных пар при использовании праймеров, специфичных к гену нейраминидазы, свидетельствует о наличии в исходном материале РНК вируса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и может быть использовано для обнаружения вируса гриппа типа А подтипа H5N1, основанного на детекции генетического материала возбудителя, и предназначено для массовых анализов с возможной автоматизацией процесса.

Вирус гриппа типа А относится к семейству Orthomyxoviridae, широко распространен в природе, поражает многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и околоводного комплекса, и способен вызывать эпидемии, пандемии и эпизоотии (Brown I.H. at al 1993, 1995, 1998). Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариабельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 16 антигенных подтипов гемагглютинина (HI-HI5) и 9 подтипов нейраминидазы (N1-N9).

Вирусы гриппа А подтипа H5N1 периодически выделялись от кур и других видов птиц (Castrucci, M.R., et al 1993, Cauthen AN et al 2000). В 1997 году в Гонконге отмечена вспышка заболевания, обусловленная прямой передачей вируса гриппа птиц H5N1 от кур человеку (Capua I. et al 2002). Наблюдается распространение гриппа птиц, вызванного вирусом H5N1, в странах Азии и Европы (Li, Wang J. et al 2004). В течение 2004 года ВОЗ постоянно информировал о случаях заражения людей гриппом птиц, причем болезнь протекала с летальностью более 70%. В 2005 г. отмечены эпизоотии среди птиц в Сибири, на Дальнем востоке, в Калмыкии, Астрахани и других районах Российской Федерации. Доказано, что подтип H5N1 вируса гриппа А способен мутировать с высокой скоростью и образовывать высоко патогенные штаммы вируса гриппа, которые в будущем могут представлять серьезную эпидемическую опасность (Li, Wang J. et al 2004).

Классическими методами диагностики данного возбудителя являются реакция торможения гемагглютинации, реакция связывания комплемента, реакция нейтрализации, позволяющие определять наличие вирусных антигенов, а также метод иммуноферментного анализа, позволяющий определять наличие антител к вирусным антигенам в сыворотках крови. Кроме этого, существует ряд наборов для выявления в биологических пробах генетического материала вируса гриппа А методом полимеразной цепной реакции (WHO 2005), (Payungporn S. Et al, 2004). Научная публикация, представляющая описание тест-системы ПЦР для определения РНК вируса гриппа, описывает способ диагностики, отличающийся от предлагаемого изобретения специфическими компонентами и методическими подходами.

Технической задачей изобретения является создание способа одностадийной экспресс-идентификации вируса гриппа А подтипа H5N1. При этом методика может проводиться как в двух ПЦР, так и с использованием мультиплексной ПЦР (идентификация двух генных участков в одной реакции ПЦР). Мультиплексная ПЦР позволит выявлять вирусный материал в одной реакционной смеси, сократив время диагностики, процент финансовых затрат и технологических ошибок.

Поставленная задача решается путем подбора пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных для вируса гриппа А подтипа H5N1.

Для подбора праймеров использовали более 10000 последовательностей генов НА и NA вируса гриппа А различных подтипов, выделенных до 2007 года. Последовательности были проанализированы с использованием программ Alignment Service и Lasergene (версия 6.0). Уровень гомологии подобранных праймеров не менее чем 95%.

Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ выявления вируса на основе амплификации участка кДНК вируса гриппа А с помощью совмещенной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) участка вирусного гена гемагглютинина и нейраминидазы для увеличения количества копий ДНК вируса гриппа А подтипа H5N1. При этом уровень гомологии подобранных праймеров составляет не менее 95% для обоих генов. Вирус выявляется, если после разделения части реакционной смеси в агарозном геле в анализируемом образце выявляются фрагменты ДНК размером 184 нуклеотидных пар для праймеров, специфичных Н5, и 213 нуклеотидных пар для праймеров, специфичных N1.

Праймеры подбирали и анализировали с использованием программы Oligo (версия 3.3.) (Breslauer et al 1986).

Отсутствие гомологии с другими вирусами семейства Orthomyxoviridae и с другими подтипами вируса гриппа А являлось основным критерием отбора олигонуклеотидов.

Таким образом, для каждого гена (НА и NA) вируса гриппа А подтипа H5N1 была подобрана пара праймеров, которая высококонсервативна и специфична к своему подтипу и не имеет гомологии с другими подтипами вируса гриппа А и с другими родственными вирусами.

Схемы и расчетные фрагменты ПЦР представлены на чертеже.

Рассчитанные олигонуклеотиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе 349 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystems (США)) по стандартной методике.

Предложенный способ включает в себя две основные реакции. Первая - это первая ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к участку гена гемагглютинина вируса гриппа А. Матрицей для этой реакции служит одноцепочечная РНК вируса гриппа, а затравкой - праймеры F-H5, состоящий из 20 звеньев: ACAAGGTCCGACTACAGCTT, и R-H5, состоящий из 22 звеньев: ATTGATTCCAATTTTACTCCAC. Вторая реакция - вторая ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к участку гена нейраминидазы. Матрицей для этой реакции служит одноцепочечная РНК вируса гриппа, а затравкой - праймеры F-N1, состоящий из 22 звеньев: CAGAACATTAATGAGTTGTCCT, и R-N1, состоящий из 22 звеньев: TCTCAGTATGTTGTTCCTCCAA. Применение полимеразной цепной реакции, совмещенной с реакцией обратной транскрипции, сокращает время проведения реакции.

Реакционную смесь анализируют с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Присутствие в анализируемом образце фрагментов ДНК размером 184 нуклеотидных пар свидетельствует о наличии в исходном материале РНК вируса гриппа А подтипа Н5, а фрагменты ДНК размером 213 нуклеотидных пар - вируса гриппа А подтипа N1.

Предложенный метод диагностики вируса гриппа А методом ПЦР является высокочувствительным и высокоспецифичным к вирусу гриппа А подтипа H5N1 и позволяет достоверно определять наличие РНК вируса данного подтипа в биологических пробах без предварительного накопления тестируемого вируса, что особенно важно при работе с высокопатогенными штаммами.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выбор последовательности праймеров.

Учитывая большую вариабельность генома вируса гриппа типа А, при его обнаружении необходимо использовать праймеры, соответствующие наиболее консервативным участкам вирусного генома. Основой для поиска мест отжига праймеров стало сопоставление нуклеотидных последовательностей гена гемагглютинина и нейраминидазы всех вирусов гриппа, представленных в международной базе данных. Всего использовали более 10000 нуклеотидных последовательностей геномов вирусов гриппа.

При выборе мест посадки праймеров учитывались следующие требования: специфичность праймеров для всех последовательностей вирусов подтипа H5N1, отсутствие мест отжига праймеров на последовательности вирусов других подтипов. Эта работа выполнялась с помощью программ Lasergene (версия 6.0), BioEdit (версия 7.00) и Amplify (версия 1.06 Univers. of Wisconsin, Genetics, Madison). В качестве дополнительных критериев, определяющих пригодность праймеров, учитывались следующие: отсутствие дуплексов праймеров и отжига их друг на друга, отсутствие мест ложного отжига на матрицы геномов различных штаммов вируса гриппа А и родственных вирусов. Этим критериям удовлетворяют все отобранные праймеры.

Пример 2. Выделение РНК из образцов.

Выделить РНК из образцов - это получить ее в чистом виде, т.е. отделить от белков и других клеточных молекул, которые могут помешать молекулярному анализу. Во избежание перекрестной контаминации до начала работы маркировали чистые пробирки объемом 1.5 мл и вносили в них по 600 мкл раствора, содержащего гуанидинтиоцианат. Образцы исследуемого материала (в объеме 200 мкл) использовали для анализа. Использовали метод выделения с неорганического сорбента "SiO₂". РНК элюировали в 30 мкл деионизованной воды, свободной от РНК-аз при 56°С в закрытых пробирках.

Пример 3. Проведение ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к участкам генов Н5 и N1.

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N образцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в последовательности, приведенной в таблице. Ферменты добавляют в последнюю очередь.

Реакция ОТ-ПЦР-1 для подтипа Н5 вируса гриппа А.
Реактив	Кол-во на 1 пробу	К-во на N проб
Буфер для ПЦР-1	14.625	14.625×(N+1)
Праймеры для ПЦР-Н5	4.5	4.5×(N+1)
Фермент Taq-полимераза	0.25	0.25×(N+1)
Фермент MMLV ревертаза + ингибитор РНКаз	0.625	0.625×(N+1)
Реакция ОТ-ПЦР-1 для подтипа N1 вируса гриппа А.
Реактив	Кол-во на 1 пробу	К-во на N проб
Буфер для ПЦР-1	14.625	14.625×(N+1)
Праймеры для ПЦР-N1	4.5	4.5×(N+1)
Фермент Taq-полимераза	0.25	0.25×(N+1)
Фермент MMLV ревертаза + ингибитор РНКаз	0.625	0.625×(N+1)

Смесь перемешивают и раскапывают по 20 мкл в пробирки, в каждую пробирку добавляют по 2-3 капли масла (примерно, 40 мкл).

Затем в них вносят отдельным наконечником с фильтром под масло по 5 мкл РНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов (K ⁺ и K^-). Пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом:

50°С	- 40 мин
95°С - 3 мин	1 цикл
95°С	- 20 сек
57°С - 20 сек	40 циклов
72°С	- 20 сек
72°С - 5 мин	1 цикл

Пример 4. Детекция продуктов амплификации.

Детекция продуктов амплификации проводится методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Исследуется аликвота (7 мкл водной фазы амплификационной смеси).

Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля, в течение 60 мин. За это время продукт реакции успевает пройти не менее половины геля. Рекомендуемый размер геля 5-10 см. Направление движения образцов в геле от "-" к

"+".

Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе "Трансиллюминатор". Результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых полос.

Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле на уровне полосы положительного контроля.

Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта).

В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново.

Предлагаемый одностадийный способ обнаружения вируса гриппа А является высокочувствительным к вирусу гриппа А подтипа H5N1 и может быть использован для экспресс-идентификации. Проводится как в двух ПЦР, так и в мультиплексной ПЦР. Мультиплексная ПЦР позволяет сократить процент финансовых затрат и количество технологических ошибок.

ЛИТЕРАТУРА

1. Breslauer et al // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1986. - V.83. - P.3746.

2. Brown I.E., Harris P.A., Alexander D.J. Serological studies of influenza virus in pigs in Great Britain 1991-2 // Epidemiol. Infect. - 1995. - Vol.114. - P.511-520.

3. Brown LH., Done S.H., Spencer Y.I, Cooley W.A., Harris P.A., Alexander D.J. Pathogenicity of swine influenza H1N1 virus antigenically distinguishable from classical and European strains. // Vet. Rec. - 1993. - Vol.132. - P.598-602.

4. Brown, I.H., Harris P.A., McCauley J.W., Alexander D.J. Multiple genetic reassortment of avian and human influenza A viruses in European pigs, resulting in emergence of an H1N2 virus of novel genotype. // J. Gen. Virol. - 1998. - Vol.79. - P.2947-2955.

5. Capua I, Alexander D.J. Avian influenza and human health. // Acta Trop. - 2002 - Vol.83. № 1. - P.1-6. Review.

6. Castrucci M.R., Donatelli I., Sidoli L, Barigazzi G., Kawaoka Y., Webster R.G. Genetic reassortment between avian and human influenza viruses in Italian pigs. // Virology. - 1993. - Vol.l93. - P.503-506.

7. Cauthen A.N., Swayne D.E., Schultz-Cherry S., Perdue M.L., Suarez D.L. Continued circulation in China of highly pathogenic avian influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans. // J.Virol. - 2000. - Vol.74. - N 14. - P.6592-6599.

8. Li, Wang J., Smith G.J.D. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature. - 2004. - Vol.430. - P.209-213.

9. Payungporn S, Phakdeewirot P, Chutinimitkul S, Theamboonlers A, Keawcharoen J, Oraveerakul K, Amonsin A, Poovorawan Y. Single-step multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for influenza A virus subtype H5N1 detection // Viral Immunol. 2004; 17 (4): 588-93.

10. Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans WHO Geneva June 2005.