способ диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе

Формула изобретения

Способ диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе, включающий исследование ликвора и крови пациента в динамике на фоне лечения сочетанной инфекции с определением в нем возбудителя инфекции путем проводимых параллельно культурального, генетического и иммунологического методов, отличающийся тем, что сыворотку венозной крови пациента, полученную центрифугированием, и ликвор исследуют посредством электрофореза с определением полос в окрашенном геле, выявляя в них олигоклональные иммуноглобулины, и при не обнаружении хламидийной инфекции в ликворе, но при выявлении в нем олигоклонального иммуноглобулина и не выявлении последнего в сыворотке крови, и независимо от присутствия сочетанной инфекции в ликворе проводят провокацию, состоящую из 4-х ежедневных процедур лейкоцитафереза с адсорбцией рифампицина в разовой дозе 450 мг и пефлоксацина в разовой дозе 800 мг на аутолейкоцитах, и после 4-х недель проводят контрольное исследование ликвора культуральным, генетическим и иммунологическим методами, и при обнаружении в контрольном исследовании положительного результата на хламидийную инфекцию диагностируют хроническую скрытую хламидийную инфекцию в центральной нервной системе.

Описание изобретения к патенту

Способ диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе относится к области медицины, а именно неврологии, нейрохирургии и инфектологии, и может быть использован при определении этиологии инфекционно-воспалительных, иммунологически-опосредованных демиелинизирующих заболеваний нервной системы, а также для оценки эффективности и коррекции тактики проводимого лечения.

Поражение нервной системы хламидийной инфекцией встречается чаще, чем диагностируется. Диагностические сложности вызывает хроническое течение заболевания. При экспериментальном моделировании хламидийной инфекции доказано, что возбудитель может обнаруживаться внутри клеток центральной (ЦНС) и периферической нервной системы. Имеющиеся способы диагностики хламидийной инфекции часто неэффективны из-за отсутствия возбудителя в исследуемом материале.

Известны различные лабораторные методы определения хламидийной инфекции (инфекционных возбудителей), направленные на выявление самих хламидий, или их антигенов, или антихламидийных антител: морфологические методы с выявлением морфологических структур возбудителя, культуральные методы с выделением возбудителя, иммунологические методы с выявлением антигенов и антител, генетические методы с ДНК-диагностикой. «Золотым стандартом» диагностики считают культуральный метод с выделением возбудителя на культуре клеток и гинетический - полимеразная цепная реакция (ПЦР). Более достоверные результаты лабораторного исследования получают при одновременном параллельном использовании различных методов. Все указанные методы используют для определения хламидийной инфекции в различных биологических материалах, взятых у пациентов для исследования.

Известен способ диагностики хламидийной инфекции в ЦНС по обнаружению возбудителя в мозговой ткани путем использования различных лабораторных методов диагностики, полученной при операции на головном мозге или при вскрытии погибшего пациента, см. Серопегин А.Д., Одинак М.М., Михайленко А.А. «Хламидийные поражения нервной системы», «Военно-медицинский журнал», 2006, № 11, с.36-41. Однако биопсия мозговой ткани - нейрохирургическая операция, сопряженная с риском для жизни пациента, и существует вероятность, что в биопсийном материале не окажется возбудителя. Результат посмертного исследования не имеет значения для дальнейшего лечения.

Известен способ диагностики хронической хламидийной инфекции в ЦНС при исследовании ликвора с параллельным исследованием других биологических материалов: смывов, соскобов из аногенитальной области, носоглотки, конъюнктивы, крови, см. Вайншенкер Ю.И., Неустроева Ю.А. «Хроническая хламидийная инфекция ЦНС как причина демиелинизирующего поражения головного мозга», журнал «Неврологический Вестник им. В.М.Бехтерева», 2007, т.39, вып.1, с.62-65, путем использования различных лабораторных методов диагностики. Диагностическую значимость для поражения ЦНС имеет только исследование ликвора, поскольку хламидийная инфекция может находиться в различных органах и системах организма. Способ неинформативен при малой концентрации или отсутствии возбудителя в ликворе, а также неэффективен при диагностике скрытой хронической хламидийной инфекции в ЦНС.

Известен способ диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в ЦНС при исследовании ликвора больного в динамике на фоне лечения сочетанной инфекции, выявленной в ликворе, путем параллельно проводимых культурального, генетического (ПЦР) и иммунологического (прямой иммунофлюоресценции (ПИФ)) методов определения возбудителя, см. Вайншенкер Ю.И., Мелючева Л.А., Позняк А.Л., Ивченко И.М., Деденева И.В. «Отдельные проявления пароксизмального синдрома при вялотекущем хламидийном менингоэнцефалите», Материалы Всероссийской научной конференции ЭЭГ и нейротерапия, 25-16 октября 2007 г., СПб., с.19. Эта статья является самым близким решением предлагаемого способа диагностики. Способ эффективно и достоверно выявляет хламидийную инфекцию в ЦНС при достаточном для реализации лабораторных методов количестве возбудителя в ликворе. Параллельное применение «золотых стандартов диагностики» увеличивает точность и чувствительность выявления хламидийной инфекции. Динамическое исследование ликвора на фоне лечения сочетанной инфекции, выявленной в ликворе, увеличивает вероятность выявления скрытого возбудителя, количество которого при первичном исследовании было недостаточным для его определения.

Недостатками вышеуказанного способа являются: этот способ диагностики не реализуется при отсутствии сочетанной инфекции в ликворе; случайность и неточность полученных результатов; не установлены критерии, указывающие на необходимость проведения повторных диагностических мероприятий для выявления скрытой хламидийной инфекции в ЦНС, не определившейся в ликворе при первичном исследовании; увеличение количества возбудителя в ликворе может оказаться как случайным в ходе течения заболевания, так и спровоцированным при лечении сочетанной инфекции; не установлены инфекционные возбудители, скрывающие хламидийную инфекцию в ЦНС; не установлены лечебные мероприятия, направленные на элиминацию сочетанной инфекции: фармакологические препараты, дозы, способы и пути введения, длительность введения; не установлены сроки повторной диагностики хламидийной инфекции, что может привести к ложно-отрицательным результатам диагностики и ошибочному лечению.

Техническим результатом предлагаемого решения является повышение точности и эффективности диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в ЦНС посредством увеличения количества возбудителя в ликворе, достигаемого при установлении хронического иммунологически-опосредованного воспалительного процесса в пределах ЦНС и неповрежденном гематоэнцефалическом барьере и вне зависимости от присутствия сочетанной инфекции в ликворе.

Этот результат достигается тем, что в способе диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе, включающем исследование ликвора пациента в динамике на фоне лечения сочетанной инфекции с определением в нем возбудителя инфекции путем проводимых параллельно культурального, генетического и иммунологического методов, сыворотку венозной крови пациента, полученную центрифугированием, и ликвор исследуют посредством электрофореза с определением полос в окрашенном геле, выявляя в них олигоклональные иммуноглобулины, и при необнаружении хламидийной инфекции в ликворе, но при выявлении в нем олигоклонального иммуноглобулина и не выявлении последнего в сыворотке крови независимо от присутствия сочетанной инфекции в ликворе проводят провокацию, состоящую из 4-х ежедневных процедур лейкоцитафереза с адсорбцией рифампицина в разовой дозе 450 мг и пефлоксацина в разовой дозе 800 мг на аутолейкоцитах, и после 4-х недель повторно исследуют ликвор путем указанных методов определения возбудителя.

Сущность изобретения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками предложенного способа диагностики, совпадающими с признаками прототипа, являются: исследование ликвора пациента в динамике на фоне лечения сочетанной инфекции с определением в нем возбудителя инфекции путем проводимых параллельно культурального, генетического и иммунологического методов.

Существенными отличительными признаками решения являются: А - сыворотку венозной крови пациента, полученную центрифугированием, и ликвор исследуют путем электрофореза с определением полос в окрашенном геле, выявляя в них олигоклональные иммуноглобулины; Б - при необнаружении хламидийной инфекции в ликворе, но при выявлении в нем олигоклонального иммуноглобулина и не выявлении последнего в сыворотке крови независимо от присутствия сочетанной инфекции в ликворе проводят провокацию, состоящую из 4-х ежедневных процедур лейкоцитафереза с адсорбцией рифампицина в разовой дозе 450 мг и пефлоксацина в разовой дозе 800 мг на аутолейкоцитах; В - после 4 недель повторно исследуют ликвор путем указанных методов определения возбудителя.

Способ диагностики скрытой хронической хламидийной инфекции в центральной нервной системе осуществляют следующим образом. Больному с подозрением на хламидийную инфекцию в ЦНС выполняют люмбальную пункцию и производят забор ликвора -1 мл. Предварительно исследуют его в динамике на фоне лечения сочетанной инфекции в ликворе параллельно разными методами определения возбудителя: культуральным с определением антибиотикочувствительности, генетическим (ПЦР) и иммунологическим (ПИФ). После этого производят забор крови из вены больного (5 мл), путем центрифугирования (1500 об/мин в течение 10 мин) получают из нее сыворотку (1 мл). Ликвор и сыворотку крови исследуют путем электрофореза с определением полос в окрашенном геле для выявления в них олигоклональных иммуноглобулинов (IgG). При хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе повышается продукция иммуноглобулинов (Ig) и их компонентов в пределах нервной системы. Наличие олигоклонального IgG в ликворе и сыворотке крови является критерием проявления хронического воспалительного иммунологического процесса и результатом нарушения синтеза иммуноглобулинов. Выявление олигоклонального IgG в ликворе является наиболее чувствительным и информативным показателем при ряде заболеваний центральной нервной системы (энцефалитах, демиелинизирующих заболеваниях). Выявление олигоклонального IgG не только в ликворе, но и в крови свидетельствует о генерализованном процессе с вовлечением гематоэнцефалического барьера. Для определения клональности IgG путем электрофореза выявляют полосы в окрашенном геле, которые соответствуют индивидуальным клонам IgG, и при олигоклональном синтезе иммуноглобулина в геле появляется больше 10 окрашенных полос. Если хламидийной инфекции в ликворе не обнаружено и при этом олигоклональный IgG не выявлен или выявлен в ликворе и в сыворотке крови, то результат диагностики отрицательный. Если хламидийной инфекции в ликворе не обнаружено, но при этом олигоклональный IgG выявлен в ликворе и не выявлен в сыворотке крови, то проводят провокацию (фармакологическую пробу) в виде 4-х ежедневных процедур лейкоцитафереза с адсорбцией фармакопрепаратов: рифампицина в разовой дозе 450 мг и пефлоксацина в разовой дозе 800 мг на аутолейкоцитах. В процессе лейкоцитафереза производят эксфузию крови пациента в объеме 1000 мл, центрифугированием выделяют аутологичные аутолейкоциты и после кондиционирования на них адсорбируют антибиотики, чувствительные к микрофлоре пациента. Затем после 4-х недель повторно исследуют ликвор больного параллельно культуральным, генетическим, иммунофлюоресцентным методами определения хламидийной инфекции (возбудителя) и, если хламидийной инфекции не обнаруживают, то результат диагностики отрицательный, а если обнаруживают, то результат положительный.

Антибиотики, к которым определяется чувствительность хламидий на перевиваемой культуре клеток, часто имеют низкую биодоступность и плохо проникают или вообще не проникают через гематоэнцефалический барьер, даже при его повреждении. Рифампицин - антибактериальный, противолепрозный и противотуберкулезный препарат нарушает синтез РНК в бактериальной клетке, хорошо проникает в ткани и жидкости организма, действует на хламидии. Его суточная доза составляет 450 мг. Пефлоксацин - это противомикробный препарат широкого спектра действия из группы фторхинолонов, имеет бактерицидное действие, блокируя ДНК-гиразу, нарушает репликацию А-субъединицы ДНК и РНК и синтез белков бактерий, активен в отношении внутриклеточных хламидий, хорошо проникает в ткани и жидкости организма, в ликворе его концентрация выше, чем в плазме крови. Его суточная доза - 800 мг. Метод лейкоцитафереза с адсорбцией на лейкоцитах фармакопрепаратов увеличивает биодоступность последних в очаги воспаления.

Предложенный способ диагностики прошел клинические испытания на базе Института мозга человека РАН при обследовании 5 больных с хронической скрытой хламидийной инфекцией в ЦНС с и без сочетанной инфекции в ликворе. При обследовании пациентов использовался комплекс клинико-лабораторного обследования, нейрохирургических методов, включающих электроэнцелографию, позиционно-эмиссионную томографию, магнитно-резонансную томографию (МРТ), МРТ-ангиографию. В ходе клинических испытаний было улучшено качество диагностики и лечения больных с демиелинизирующими заболеваниями ЦНС, поскольку была выявлена хламидийная этиология этих заболеваний, что позволило адекватно и точно корректировать лечение пациентов.

Пример. 1 Больной Ш. 46 лет. Диагноз перед началом обследования: подозрение на хронический энцефалит, эпилептический синдром, цефалгический синдром.

По данным МРТ выявлены мелкие очаги демиелинизации и последствия перенесенной геморрагии. В табл.1 представлены данные исследований.

Таблица 1
Исследуемый (выявляемый) показатель	исходно	На фоне лечения соч. инф.	Через 4 нед. после провокации
Хлам. инфекция	Культуральный метод	-	-	+
в ликворе	Генетический (ПЦР)	-	-	-
	Иммунологический	-	-	-
Олигоклональный	Нет
IgG	В ликворе и в крови			+
	В ликворе	+	+
Соч. инфекция в ликворе		+	-	-
(+) выявлена, (-) не выявлена, соч. инфекция - сочетанная инфекция.

Согласно способу прототипа у пациента в ликворе хламидийная инфекция не определена, но есть сочетанная инфекция (вирус группы герпеса). На фоне противовирусной терапии проводились повторное исследование ликвора с целью определения хламидийной инфекции. Результат отрицательный.

Согласно заявляемому способу хламидийная инфекция не определена, но олигоклональный IgG выявлен в ликворе и не выявлен в сыворотке крови. Был проведен 4-х дневный курс лейкоцитафереза с адсорбцией на лейкоцитах рифампицина и пефлоксацина, и через 4 недели при контрольном исследовании в ликворе выявлены хламидии.

В данном примере согласно способу прототипа был установлен герпетический энцефалит, однако причина демиелинизирующего поражения головного мозга осталась бы не установленной. Выявление хламидийной инфекции согласно заявляемому способу позволило точно установить бактериально-вирусную причину энцефалита и провести адекватное лечение.

Пример.2. Пациент Б., 26 лет. Диагноз перед началом обследования: острый диссеминированный энцефаломиелит. В табл.2 представлены данные проведенных исследований.

Таблица 2
Исследуемый (выявляемый) показатель	исходно	Через 4 недели после провокации
Хламид. инфекция	Культуральный метод	-	+
	Генетический (ПЦР)	-	+
в ликворе	Иммунологический	-	+
Олигоклональный	Нет		+
	в ликворе и крови
IgG	в ликворе	+
соч. инф. в ликворе		-	+
(+) - выявлена, (-) - не выявлена, соч. инф. - сочетанная инфекция

По табл.2 согласно способу прототипа в ликворе хламидии не выявлены и не выявлены другие возбудители. Способ неприменим.

Согласно заявляемому способу хламидийной инфекции в ликворе нет, но олигоклональный IgG выявлен в ликворе и не выявлен в сыворотке крови. Был проведен 4-х дневный курс лейкоцитафереза с адсорбцией на лейкоцитах рифампицина и пефлоксацина, и через 4 недели при контрольном исследовании в ликворе выявлены хламидии и сочетанная инфекция (патогенные формы бактероидов). Результат диагностики - хроническая хламидийная инфекция центральной нервной системы - положительный.

В данном примере, руководствуясь способом прототипа, демиелинизирующий процесс с поражением головного и спинного мозга был бы расценен как аутоиммунный, что привело бы к ошибочной лечебной тактике с назначением гормонов и цитостатиков с дальнейшим ухудшением состояния больного. Выявление хламидийной инфекции, а также сочетанной инфекции согласно заявляемому способу способствовало установлению правильного диагноза - демиелинизирующего хламидийно-бактероидного энцефаломиелита, а проведенная в последующем полная санация организма от инфекции привела к выздоровлению.

Пример 3. Больной Д. 19 лет. Диагноз перед началом обследования больного: перинатальная постгипоксическая энцефалопатия, отставание в психоречевом развитии, синдром двигательных нарушений. На МРТ - признаки глиоза. В течение жизни больной постоянно получал курсы различных нейропротекторов и других фармпрепаратов, направленных на улучшение неврологического статуса, но без должного эффекта. Руководствуясь способом прототипа, состояние пациента продолжало бы трактоваться как перинатальное постгипоксическое поражение мозга с дальнейшим проведением соответствующих лечебных мероприятий. В табл.3 представлены данные проведенных исследований.

Таблица 3
Исследуемый (выявляемый) показатель	исходно	Через 4 недели после провокации
Хламидийная	Культуральный метод	-	+
инфекция	Генетический (ПЦР)	-	-
в ликворе	Иммунологический	-	-
Олигоклональный	Нет		+
IgG	В ликворе и крови
В ликворе	+
соч.инфекция в ликворе		-	-
(+) - выявлена, (-) не выявлена, соч./инф. - сочетанная инфекция

По табл.3 согласно способу прототипа в ликворе хламидийной инфекции нет и не выявлена сочетанная инфекция в ликворе, поэтому способ неприменим.

Согласно заявляемому способу в ликворе хламидийной инфекции нет, но олигоклональный IgG выявлен в ликворе и не выявлен в сыворотке крови. Проведен курс лейкоцитафереза с адсорбцией на лейкоцитах рифампицина и пефлоксацина. Через 4 недели хламидии выявлены. Согласно заявляемому способу удалось выявить хроническую хламидийную инфекцию в ЦНС, после санации которой было получено значительное уменьшение психоневрологических нарушений и двигательных расстройств.

Таким образом, как показывают приведенные примеры, предлагаемый способ способствует улучшению качества диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе, что приводит к улучшению результатов лечения.

Использование изобретения «Способ диагностики хронической скрытой хламидийной инфекции в центральной нервной системе» по сравнению с известными решениями позволило повысить точность диагностики острых, хронических, вялотекущих и скрытых иммунологически опосредованных демиелинизирующих хламидийно-обусловленных поражений нервной системы, а также других демиелинизирующих хламидийно-обусловленных поражений нервной системы, а также других заболеваний ЦНС со сходной клинической картиной посредством увеличения количества возбудителя в ликворе больного при наличии иммунопатологического воспалительного процесса в пределах центральной нервной системы. При отсутствии хламидий и вне зависимости от сочетанной инфекции был введен критерий, устанавливающий наличие иммунологически-опосредованного воспалительного процесса в центральной нервной системе с косвенной оценкой состояния гематоэнцефалического барьера. Предложенный способ диагностики был апробирован на практике при лечении заболеваний центральной нервной системы в Институте мозга человека РАН и может быть рекомендован как способ диагностики хронических вялотекущих и скрытых инфекционно-воспалительных заболеваний центральной нервной системы. Способ способствует улучшению качества диагностики и, как следствие, приводит к улучшению результатов лечения при иммунологически-опосредованных и аутоиммунных демиелинизирующих заболеваниях центральной нервной системы, последствий перинатальной патологии и других неврологических заболеваний с возможным хламидийным генезом. Предлагаемый способ диагностики точен, информативен, устанавливает сроки повторной диагностики хламидийной инфекции, он позволяет увеличить количество возбудителя в ликворе больного, что повышает эффективность методов определения хламидийной инфекции в центральной нервной системе.