способ получения препарата антитромбина iii из плазмы крови человека

Классы МПК:A61K35/14 кровь
A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные
A61K38/55 ингибиторы протеаз
A61P7/02 антитромботические средства; антикоагулянты; ингибиторы аггрегации тромбоцитов
Автор(ы):, , , ,
Патентообладатель(и):Общество с ограниченной ответственностью "БиоГениус" (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-02-28
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа получения антитромбина III из плазмы крови человека. Способ предусматривает стадию аффинной хроматографии, очистку от вирусов и концентрирование продукта, при этом предварительно плазму центрифугируют, после отделения осадка к супернатанту добавляют ПЭГ 4000, инкубируют, центрифугируют, диафильтруют против буферного раствора рН 7,20, содержащего трис HCl и цитрат натрия, пропускают через колонну с ДЕАЕ-сефарозой, к не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляют гепарин три-н-бутилфосфат и твин-80, смесь инкубируют и наносят на колонну с Q-сефарозой, белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюируют трис-HCl буфером рН 9,0 с проводимостью 40.0±0.8 мСи, элюат диализуют против трис-HCl буфера, рН 7,40, содержащего хлорид натрия и цитрат натрия, пастеризуют при 60°С в течение 10 часов, обогащенную ATIII смесь белков диализуют против буфера с рН 7,40, содержащего трис-HCl и цитрат натрия, наносят на колонну с гепарин-сефарозой, промывают колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно хлорид натрия, целевой продукт элюируют тем же буфером, содержащим 1,50±0.03 М хлорид натрия, раствор ATIII диафильтруют против формулирующего буфера, стерильно фильтруют, разливают и лиофильно высушивают. Способ позволяет повысить выход по активности продукта до 60%, а также обеспечивает его высокое качество и чистоту.

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способов получения лиофилизированного высокоочищенного препарата антитромбина III (ATIII) из плазмы крови.

Антитромбин III - гликопротеин с молекулярной массой 58 кДа, относится к классу серпинов и, в первую очередь, участвует в инактивации тромбина. Как врожденный, так и приобретенный дефицит ATIII характеризуется тромбофилиями различной степени выраженности, требующими медикаментозной коррекции. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, протекающий в рамках разнообразных нозологии, рассматривается среди наиболее частых причин тромбофилий, связанных с дефицитом ATIII. Необходимость заместительной терапии AT в суперфизиологических концентрациях обусловлена противовоспалительными свойствами данного гликопротеина, например, при сепсисе.

Существует ряд способов выделения и очистки ATIII. Почти все они основаны на выделении целевого продукта из плазмы крови с применением хроматографии.

Например, известен способ выделения ATIII из нормальной плазмы путем пропускания ее через колонку с сульфированным декстраном, активированным BrCN, и элюции градиентом NaCl в буфере. Способ является достаточно простым, но характеризуется недостаточно высоким выходом и не обеспечивает требуемой чистоты получаемого препарата (SU патент 447876, 1974).

Известен способ выделения антитромбина III из плазмы крови или фракции Кона IV-1, предусматривающий несколько стадий хроматографии: на сильноосновной анионообменной смоле с четвертичными аммониевыми группами, на аффинном сорбенте - гепарин-сефарозе с элюцией раствором NaCl в буфере и на сорбенте Q-сефарозе. Способ обеспечивает получение препарата антитромбина с приемлемой степенью чистоты, но является сложным и трудоемким (JP 10-168100, 1998).

Известен способ, согласно которому ATIII получают из плазмы крови или фракции Кона IV-1, когда на первом этапе освобождаются от балластных белков путем осаждения 20% полиэтиленгликолем (ПЭГ). Далее супернатант пропускают через колонну, заполненную гепарин-сефарозой. Связавшийся с носителем ATIII элюируют, добавляют 0,5 М цитрат натрия в качестве стабилизатора, пастеризуют, удаляют избыток цитрата натрия с помощью гель-фильтрации, стерильно фильтруют, разливают и лиофилизируют. Выход по активности составляет около 32% в случае использования плазмы в качестве сырья. Если сырьем служила фракция Кона IV-1, то выход по активности составлял 16% (Wickerhauser М. et al., Vox Sang, 36, 5, 281-293, 1979).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения и очистки ATIII из плазмы крови, который сводится к следующим основным этапам: 1) получению супернатанта фракции II+III по методу Кона (Cohn E.J. et al, J Am Chem Soc 68, 459-475, 1946), 2) первой аффинной хроматографии на гепарин-агарозном геле, элюции и концентрации ATIII, 3) пастеризации (60°С, 10 часов), 4) второй аффинной хроматографии на таком же геле для удаления денатурированного ATIII, 5) элюции ATIII, его концентрации, замены буферного раствора на формулирующий буфер, содержащий стабилизатор (D-маннитол), стерильной фильтрации, розлива и лиофильной сушки (Biescas Н. et al., Haematologica, 83, 305-311, 1998). Выход процесса около 30%. Чистота препарата составляла более 95%.

Недостатками данного способа являются небольшой выход целевого продукта и однократность процедуры вирусной инактивации, что уменьшает надежность способа по вирусной безопасности получаемого препарата.

Как показали сами авторы, причиной невысокого выхода являются, в первую очередь, большие потери ATIII на этапе извлечения его из супернатанта фракции Кона II+III.

Задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, при этом конечный препарат должен иметь высокий уровень чистоты и активности ATIII, а технология не должна быть чрезмерно трудоемкой.

Чтобы решить поставленную задачу, предлагается не использовать супернатант фракции Кона II+III в качестве материала, который наносится на колонну с гепарин-сефарозой, а использовать для этой цели криосупернатант, полученный из свежезамороженной плазмы, из которого последовательно будут удаляться балластные белки (в том числе и гепарин-связывающие). Для этого криосупернатант предлагается обработать полиэтиленгликолем (ПЭГ), а затем, отбросив осадок, удалить из надосадочной жидкости ряд других белков с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. К не связавшимся с носителем белкам добавляют гепарин. Это позволяет изменить электростатические характеристики поверхности гепарин-связывающих белков и повысить стабильность, в частности ATIII. Такой методический прием позволил, во-первых, провести сольвент-детергентную обработку концентрата, содержащего ATIII, с меньшими потерями активности целевого белка, а во-вторых, более полно собрать антитромбин, используя колонну с Q-сефарозой. Дальнейшее использование гепарин-сефарозы позволило получить конечный препарат высокой степени очистки и с большим выходом (до 60%) несмотря на использование этапа пастеризации.

Предлагается способ, согласно которому предварительно плазму центрифугируют, после отделения осадка к супернатанту добавляют 20,0±0,4% ПЭГ 4000, инкубируют 2 часа, центрифугируют, диафильтруют против уравновешивающего буфера рН 7,20±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис HCl и 50±1 мМ цитрат натрия, пропускают через колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой (к этой стадии остается около 78-80% активности ATIII), к не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляют 1×107 ME гепарина и после 20-минутной инкубации в раствор вносят три-н-бутилфосфат (0,3%) и твин-80 (1%), смесь инкубируют 16 часов (на этой процедуре теряется не более 5% активности) и наносят на колонну с Q-сефарозой, белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюируют 100±2 мМ трис-HCl буфером, рН 9,0±0,1 с проводимостью 40,0±0,8 мСи (после этой стадии остается 68-70% активности ATIII), элюат диализуют против 10,0±2 мМ трис-HCl буфера, рН 7,40±0,14, содержащего 0,150±0,03 М хлорид натрия, 1,00±0,02М цитрат натрия, и пастеризуют при 60°С в течение 10 часов, обогащенную ATIII смесь белков диализуют против буфера с рН 7,40±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис-HCl и 10,0±0,2 мМ цитрат натрия, наносят на колонну с гепарин-сефарозой, промывают колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно 0,150±0,003М хлорид натрия, целевой продукт элюируют тем же буфером, содержащим 1,50±0,03М хлорид натрия (к этому моменту остается около 60-63% активности ATIII), раствор ATIII диафильтруют против формулирующего буфера. Затем его стерильно фильтруют, разливают и лиофильно высушивают. Выход процесса по активности ATIII составлял 59±2%. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия давал только одну полосу.

Продукт может представлять собой раствор или лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом). В случае необходимости он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам. Наполнителями являются, например, сахара (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза или их смеси), восстановительные сахара (эритрол, маннитол и др.) в физиологически приемлемых концентрациях, в случае необходимости - антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. Дополнительно продукт может содержать неорганические и/или органические соли и их сочетания для поддержания приемлемых значений рН.

Растворителями для лиофилизированного продукта могут служить дистиллированная апирогенная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор.

Также можно лиофилизировать готовый продукт, содержащий антитромбин III и любой из перечисленных вспомогательных веществ или их сочетание.

Осуществление способа поясняется следующим примером.

Пример.

100 л плазмы размораживали и подвергали центрифугированию. После отделения осадка к супернатанту добавляли 20% ПЭГ 4000, инкубировали 2 часа, центрифугировали, диафильтровали против уравновешивающего буфера (10 мМ трис HCl буфером, рН 7,2, содержащим 50 мМ цитрат натрия) и пропускали через колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой. К не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляли 1×107 ME гепарина и после 20-минутной инкубации в раствор вносили три-н-бутилфосфат (0,3%) и твин-80 (1%). Смесь инкубировали при перемешивании 16 часов и наносили на колонну с Q-сефарозой. Белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюировали 100 мМ трис-HCl буфером, рН 9,0 с проводимостью 40 мСи, доводимой хлоридом натрия. Элюат диализовали против 100 мМ трис-HCl буфера, рН 7,40, содержащего 0,15 М хлорид натрия, 1 М цитрат натрия, и пастеризовали при 60°С в течение 10 часов. После этого обогащенную ATIII смесь белков диализовали против уравновешивающего буфера (10 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4, содержащий 10 мМ цитрат натрия) и наносили на колонну с гепарин-сефарозой. Затем промывали колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно 0,15М хлорид натрия. Целевой продукт элюировали тем же буфером, но содержащим 1,5 М хлорид натрия. Раствор ATIII диафильтровали против формулирующего буфера, стерильно фильтровали, разливали и лиофильно высушивали. Выход ATIII по активности составлял 57. Чистота конечного препарата более 95%.

Преимущества данного способа по сравнению со способом-прототипом заключаются в получении препарата с повышенным выходом по активности (около 60% против 30%), что было достигнуто за счет более селективного удаления других белков и за счет введения гепарина, что позволило изменить электростатические характеристики гепарин-связывающих белков, а также в возможности повысить вирусную безопасность препарата и гарантировать его качество.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ получения антитромбина III из плазмы крови человека, предусматривающий стадии аффинной хроматографии, очистки от вирусов, концентрирования продукта, отличающийся тем, что предварительно плазму центрифугируют, после отделения осадка к супернатанту добавляют 20,0±0,4% ПЭГ 4000, инкубируют 2 ч, центрифугируют, диафильтруют против уравновешивающего буфера рН 7,20±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис HCl и 50±1 мМ цитрат натрия, пропускают через колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой, к не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляют 1×10 ME гепарина и после 20 минутной инкубации в раствор вносят три-н-бутилфосфат (0,3%) и твин-80 (1%), смесь инкубируют 16 ч и наносят на колонну с Q-сефарозой, белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюируют 100±2 мМ трис-HCl буфером, рН 9,0±0,1 с проводимостью 40,0±0,8 мСм, элюат диализуют против 100±2 мМ трис-HCl буфера, рН 7,40±0,14, содержащего 0,150±0,003 М хлорид натрия, 1,00±0,02 М цитрат натрия и пастеризуют при 60°С в течение 10 ч, обогащенную ATIII смесь белков диализуют против буфера с рН 7,40±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис-HCl и 10,0±0,2 мМ цитрат натрия, наносят на колонну с гепарин-сефарозой, промывают колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно 0,150±0,003 М хлорид натрия, целевой продукт элюируют тем же буфером, содержащим 1,50±0,03 М хлорид натрия, раствор ATIII диафильтруют против формулирующего буфера, стерильно фильтруют, разливают и лиофильно высушивают.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2357742

patent-2357742.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61K35/14 кровь

Патенты РФ в классе A61K35/14:
биологический материал, подходящий для терапии остеоартроза, повреждения связок и для лечения патологических состояний суставов -  патент 2529803 (27.09.2014)
метод получения антилютеальной крови - алк, способ лечения и профилактики послеродовых акушерско-гинекологических заболеваний у коров -  патент 2526203 (20.08.2014)
способ активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных -  патент 2523574 (20.07.2014)
способ терапии ремиттирующего рассеянного склероза -  патент 2523058 (20.07.2014)
способ лечения хронических воспалительных заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями -  патент 2522972 (20.07.2014)
способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови -  патент 2522237 (10.07.2014)
способ пластики молочной железы -  патент 2521346 (27.06.2014)
очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран -  патент 2520817 (27.06.2014)
способ выбора тактики ведения беременных с плацентарной недостаточностью и синдромом задержки роста плода -  патент 2517374 (27.05.2014)
средство для профилактики синдрома хронической усталости у мужчин -  патент 2517217 (27.05.2014)

Класс A61K38/16 пептиды, содержащие более 20 аминокислот; гастрины; соматостатины; меланотропины; их производные

Патенты РФ в классе A61K38/16:
средство для лечения аутоиммунных заболеваний -  патент 2528337 (10.09.2014)
антибактериальный пептид хоминин klp-1 широкого спектра действия -  патент 2528055 (10.09.2014)
композиции для доставки белков и методы их применения -  патент 2526904 (27.08.2014)
оксинтомодулин человека, его применение, лекарственный препарат на его основе и способ применения препарата для лечения и профилактики гипергликемии -  патент 2524204 (27.07.2014)
композиции клеток и способы их применения для лечения сердечной ткани -  патент 2519762 (20.06.2014)
мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения -  патент 2515063 (10.05.2014)
способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius -  патент 2509801 (20.03.2014)
биологические материалы и их применение -  патент 2508296 (27.02.2014)
лантибиотические карбоксиамидные производные с усиленной антибактериальной активностью -  патент 2506272 (10.02.2014)
остеогенный биорезорбируемый материал для замещения костных дефектов и способ его получения -  патент 2504405 (20.01.2014)

Класс A61K38/55 ингибиторы протеаз

Патенты РФ в классе A61K38/55:
стабильная лекарственная форма аморфных солей периндоприла, способ ее получения в промышленных масштабах и применение для лечения гипертонии -  патент 2464022 (20.10.2012)
2-амидо-4-арилокси-1-карбонилпирролидиновые производные в качестве ингибиторов серинпротеаз, в частности протеазы ns3-ns4a hcv -  патент 2440368 (20.01.2012)
стабильная композиция аморфных солей периндоприла, способ ее получения, в частности промышленного получения, и ее применение в терапии гипертензии -  патент 2429878 (27.09.2011)
аэрозольный препарат на основе апротинина для лечения вирусных респираторных инфекций -  патент 2425691 (10.08.2011)
ингибиторы сериновых протеаз, в частности нс3-нс4а протеазы -  патент 2412198 (20.02.2011)
новые пептиды как ингибиторы ns3-серинпротеазы вируса гепатита c -  патент 2404189 (20.11.2010)
композиция стабилизированной протеазы -  патент 2388486 (10.05.2010)
применение белков теплового шока для улучшения терапевтического эффекта невакцинного лечебного воздействия -  патент 2376029 (20.12.2009)
новые пептиды как ингибиторы ns3-серинпротеазы вируса гепатита с -  патент 2355700 (20.05.2009)
способ купирования хронизации гепатита с -  патент 2331436 (20.08.2008)

Класс A61P7/02 антитромботические средства; антикоагулянты; ингибиторы аггрегации тромбоцитов

Патенты РФ в классе A61P7/02:
способ получения лекарственных соединений, содержащих дабигатран -  патент 2529798 (27.09.2014)
способ профилактики тромбозов у лиц с сердечно-сосудистыми заболеваниями и хронической болью -  патент 2528904 (20.09.2014)
производное сложного эфира тиенопиридина, содержащее цианогруппу, способ его получения, его применение и композиция на его основе -  патент 2526624 (27.08.2014)
гетероциклические соединения и способы применения -  патент 2525116 (10.08.2014)
терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами -  патент 2524129 (27.07.2014)
2-(1s,2r,5s)-6,6-диметилбицикло[3.1.1]гепт-2ил]метил}сульфинил)этановая кислота, обладающая антиагрегационным действием -  патент 2522198 (10.07.2014)
фармацевтическая композиция, обладающая противотромботическим, тромболитическим, иммуномодулирующим, противовоспалительным действиями, нормализующая липидный и углеводный обмен -  патент 2519741 (20.06.2014)
предотвращение образования и/или стабилизации тромбов -  патент 2514878 (10.05.2014)
способ управляемого снижения агрегационной активности тромбоцитов мексидолом в эксперименте -  патент 2512788 (10.04.2014)
средство, обладающее противоопухолевой, антикоагулянтной, ранозаживляющей, противовоспалительной, антиоксидантной активностью, способностью ингибировать коллагеназу и ангиотензинпревращающий фермент (апф), и способ его получения -  патент 2509775 (20.03.2014)


Наверх