синтетический антиген, обладающий способностью связывать аутоантитела к 1-адренорецептору
Классы МПК: | A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний C07K14/705 рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы |
Автор(ы): | Покровский Сергей Николаевич (RU), Афанасьева Ольга Ильинична (RU), Левашов Павел Андреевич (RU), Дмитриева Оксана Александровна (RU), Ефремов Евгений Евгеньевич (RU), Беспалова Жанна Дмитриевна (RU), Сидорова Мария Владимировна (RU), Палькеева Марина Евгеньевна (RU) |
Патентообладатель(и): | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий" (ФГУ "РКНПК Росмедтехнологий") (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2007-12-13 публикация патента:
27.05.2009 |
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Для связывания аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="/images/patents/108/2356012/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору в плазме/сыворотке крови человека предложен синтетический антиген, включающий нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="/images/patents/108/2356012/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора человека, связанные между собой дисульфидной связью. Антиген обладает более высокой аффинностью по сравнению с используемыми последовательностями 1-й и 2-й петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="/images/patents/108/2356012/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора. Изобретение может быть использовано для диагностики и лечения больных с дилатационной кардиомиопатией. 1 табл., 1 ил.
Формула изобретения
Синтетический антиген для связывания аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="/images/patents/108/2356012/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору в плазме крови человека, включающий нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="/images/patents/108/2356012/946.gif" BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора человека, отличающийся тем, что заявляемый антиген представляет собой индивидуальное химическое соединение, в котором оба пептида связаны дисульфидной связью.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии, и служит для связывания аутоантител специфичных, к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору из плазмы и сыворотки человека.
Кардиомиопатия - группа заболеваний сердечной мышцы неизвестной этиологии, среди них наиболее угрожающей является дилатационная кардиомиопатия. Как правило, ей страдают мужчины молодого и среднего возраста. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) является одной из главных причин тяжелой сердечной недостаточности и наиболее частой причиной пересадки сердца. Несмотря на успехи в терапии ДКМП смертность пациентов, страдающих этим заболеванием, очень велика. В течение 10 лет 70% таких больных погибают. Патогенез этого заболевания до конца не изучен - рассматриваются гипотезы хронической вирусной инфекции и генетической детерминированности, однако последние литературные данные однозначно указывают на аутоиммунную природу этого тяжелейшего заболевания [1, 2]. Также есть литературные данные о том, что проведение процедур терапевтического афереза приводит к существенному улучшению состояния больных ДКМП [3-5]. Аутоантитела, обнаруженные в сыворотке больных ДКМП, являются антителами против собственных антигенов, таких как: миозин, адениннуклеотидный транслокатор, сарколемальный ламинин, 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептор, белок мускаринового М2-рецептора и др. [6]. Большинство аутоантител относятся к IgG классу иммуноглобулинов с молекулярной массой около 150 кДа.
Уровень аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору у больных с ДКМП варьирует у разных авторов, однако литературные данные однозначно говорят о том, что именно эти аутоантитела наиболее часто встречаются у больных с ДКМП [7]. На животных моделях показано, что введение синтетического пептида, соответствующего последовательности второй петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, приводит к развитию ДКМП у кроликов [8], следовательно, присутствие антител данной специфичности играет решающую роль в патогенезе этого заболевания. Кроме того, показано, что наличие аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору может быть одним из факторов развития тахиаритмий и острой сердечной недостаточности [9, 10].
Поэтому определение уровня аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору черезвычайно важно для возможной диагностики дилатационной кардиомиопатии.
Известен пептид, использующийся для определения уровня аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору, представляющий собой участок 197-222 [7, 11] 2-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора. Наиболее подробный анализ ИФА с использованием пептида 2-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора дан в статье [7]. Уровень положительного сигнала при разведении тестируемых сывороток 1/40 у больных ДКМП составлял в среднем 0,2 о.е. При этом только у 13 пациентов из 43 (31%) больных ДКМП был обнаружен достоверный положительный ответ (превышение сигнала в ИФА в 2 и более раз относительно фона здоровых доноров с отрицательным ответом). На популяции здоровых доноров доля положительных ответов составляла 12% [7].
Основным недостатком используемого пептида является ограниченная специфичность, так как с данным пептидом могут взаимодействовать только аутоантитела к антигенной детерминанте 2-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, представленной последовательностью данного пептида. Тогда как у больных ДКМП аутоантитела могут быть представлены шире - как к 1-ой, так и ко 2-ой петлям, так и к комплексу двух петель, связанных в природной молекуле 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора дисульфидной связью. Таким образом, ограниченная антигенная специфичность данного пептида может, в свою очередь, объяснять заниженную чувствительность (количество положительных ответов) у больных ДКМП.
Прототипом заявляемого синтетического антигена является сочетание двух индивидуальных пептидов последовательности 125-133 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu (прототип I), соответствующий 1-ой петле 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, и последовательности 206-218 Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe (прототип II) из 2-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора. Пептиды иммобилизованы на агарозную матрицу, активированную BrCN, полученный сорбент является активным ингредиентом колонки «Coraffin», используемой для удаления аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору у больных ДКМП [3]. Упомянутый сорбент представляет собой механическую смесь двух сорбентов с иммобилизованными индивидуальными пептидами, что указано в патенте [12].
Существенным недостатком данного сорбента является, во-первых, то, что механическая смесь двух сорбентов с двумя индивидуальными пептидами позволяет связывать аутоантитела, специфичные к антигенным детерминантам, расположенным либо только на 1-ой, либо только на 2-ой внеклеточной петле 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора. Тогда как в природной молекуле эти две внеклеточные петли связаны дисульфидной связью и, следовательно, образуют дополнительную антигенную детерминанту, к которой могут образовываться аутоантитела другой специфичности. Следовательно, аффинность такого сорбента неизбежно будет не достаточной для удаления всех аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору, что доказано в собственных экспериментах авторов.
Исходя из вышесказанного актуальной является задача создания синтетического антигена, наиболее близко повторяющего антигенные свойства природного антигена - 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, который, следовательно, обладал бы более высокой аффинностью.
Поставленная задача решается синтезом антигена, представляющего собой индивидуальное химическое соединение, в котором пептиды последовательности 125-133 и 206-218 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора соединены дисульфидной связью, в отличие от смеси (сочетания) данных пептидов (прототип). Способность такого синтетического антигена связывать аутоантитела к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1 адренорецетору неочевидна, так как заявляемый антиген - искусственная конструкция, не являющаяся линейным эпитопом (в случае линейних эпитопов антигенность можно предсказать, используя компьютерные программы для анализа аминокислотной последовательности белка [13]), включающая 2 фрагмента 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора (125-133 и 206-218), далеко отстоящие друг от друга и соединенные в одну молекулу спонтанным окислением сульфгидрильных групп фрагментов 125-133 и 206-218 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора с помощью перекиси водорода [14].
Синтез заявляемого синтетического антигена осуществляли окислением перекисью водорода эквимолекулярной смеси предшественников - нонапептида (125-133) и тридекапептида (208-218).
Синтез пептидов последовательности 125-133 1-ой внеклеточной петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора (нонапептид) и последовательности 206-218 2-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора (тридекапептид) осуществляли по стандартной технологии синтеза на твердой фазе [15] с использованием Fmoc* - методологии на полимере Ванга. В работе использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIC, HOBT, TIBS фирмы Fluka (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту (Applied Biosystems, США). DMF очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильной функции серина и тирозина; трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - защиту для 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -аминогруппы лизина; тритильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции аспарагина и Pmc - для гуанидиновой функции аргинина. О защите цистеиновых остатков см. примеры 1 и 2. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием карбодиимидного метода с добавкой 1-гидроксибензотриазола.
Синтез проводили на автоматическом пептидном синтезаторе Applied Biosystems, модель 431 А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. В каждом случае исходили из 0.25 ммоль Fmoc-аминоацилполимера (Bachem, Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария).
Стандартный протокол твердофазного синтеза включает следующие стадии:
Протокол твердофазного синтеза
№ | Операция | Реагент | Время обработки |
1 | Промывка | 5×NMP | 3 мин |
2 | Деблокирование 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -аминогрупп | 20% Pip/NMP | 10 мин |
3 | Промывка | 5×NMP | 3 мин |
4 | Активация | 1 ммоль Fmoc-аминокислоты + 1 ммоль HOBt + 1 ммоль DIC в NMP | 20 мин |
5 | Конденсация | 1 ммоль активированного производного Fmoc-аминокислоты в NMP | 90 мин |
6 | Промывка | 5×NMP | 3 мин |
Список сокращений: Boc - трет-бутилоксикарбонил; Acm - ацетамидометильная; АсОН - уксусная кислота; But - трет-бутил; DIC - N,N 1-диизопропилкарбодиимид; DCM - дихлорметан; DMF - N,N-диметилформамид; DMSO - d6 - дейтерированный диметилсульфоксид; Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил; HOBT - 1-гидроксибензотриазол; NMP - N-метилпирролидон; Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил; Pip - пиперидин; TIBS - триизобутилсилан; TFA - трифторуксусная кислота; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТФС - твердофазный синтез пептидов |
Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Деблокирование сульфгидрильных групп цистеиновых остатков осуществляли действием ацетата ртути. Линейные нонапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ до 97-98% чистоты. Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Beckman (США), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA. Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы Technopharm (РФ). Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Ultrasphere ODS (Beckman, США), (5 мкм, 4,6×250 мм); на хроматографе фирмы Gilson (Франция). В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, рН 2.0, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.
Синтезированные пептиды характеризовали данными 1H-ЯМР - спектроскопии (1Н-ЯМР - спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300 К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана), масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI, Kratos, Англия).
Пример 1. Синтез нонапептида последовательности 125-133 1-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I)
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (предшественник IAcm) проводили исходя из 0,34 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0.25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильную группу остатка цистеина защищали ацетамидометильной защитой.
Заключительное деблокирование и отщепление нонапептида (I Acm) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимера смесью 10 мл TFA и 0.5 мл H2O в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.25 г сырого продукта (IAcm), содержащего по данным ВЭЖХ 94% целевого пептида.
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.15 г (51% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (IAcm). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав по данным 1Н-ЯМР - спектроскопии: Glu 2, Ser 1, Gly 1, Leu 1, Phe 2, Туг 1, Cys 1.
Масс-спектр, m/z: 1165.5 [М+Н]+, вычислено 1164.7, для C54 H72N10О17S1.
Стадия 2. Получение нонапептида H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I)
0.05 г (0.043 ммоль) H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (IAcm) растворяли в 5 мл 30% АсОН, добавляли 0.03 г (0.09 ммоль) ацетата ртути в 1.5 мл 30% АсОН, так как пептид плохо растворим, доводили концентрацию раствора до 50% АсОН и перемешивали 1.5 ч при 20°С, затем пропускали ток сероводорода в течение 30 мин. Осадок отфильтровывали, промывали 2×5 мл 30% АсОН. Фильтрат упаривали до объема ~2 мл и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом. Элюирование проводили градиентом буфера Б (0.5% в мин, от 20 до 80%) в буфере А со скоростью потока 10 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Выход 0.038 г (80.0%). Масс-спектр (MALDI-MS): найдено m/z - 1095.2 ([М+Н+]), вычислено 1094.2 для C51H67N9O16S.
Пример 2. Синтез тридекапептида последовательности 206-218 2-ой петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (предшественник IIAcm) проводили исходя из 0,37 г Fmoc-Phe-полимера, содержащего 0.25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильные группы остатков Cys4 и Cys10 цистеина защищали тритильной защитой, а Cys11 - ацетамидометильной.
Заключительное деблокирование и отщепление тридекапептида (IIAcm) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего тридекапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл Н2O и 0.25 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получали 0.42 г сырого продукта (IIAcm), содержащего по данным ВЭЖХ 60% целевого пептида.
После этого проводили очистку пептида с помощью препаративной ВЭЖХ так же, как в примере 1. В итоге получали 0.13 г (32% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (IIAcm). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляла 98%. Аминокислотный состав 1Н-ЯМР-спектроскопии: Asn 1, Asp 2, Ala 1, Phe 1, Tyr 1, Lys 1, Arg 2, Pro 1, Cys 3.
Масс-спектр, m/z: 1661.2 [М+Н]+, вычислено 1661.9 для С68 Н104N22O21S3.
Стадия 2. Получение тридекапептида H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)
Деблокирование остатка цистеина Cys11 в тридекапептиде H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (IIAcm) проводили действием ацетата ртути, как описано в примере 1.
Выход тридекапептида 0.027 г (90.0%). Масс-спектр (MALDI-MS): найдено m/z - 1591.9 ([М+Н+ ]), вычислено 1590.8 для C65H99N21 O20S3.
Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, соединенные дисульфидной связью
0.007 г (0.006 ммоль) нонапептида (участок 125-133 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора) и тридекапептида (208-218 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора) 0.009 г (0.006 ммоль) растворяли в 20 мл 10% водного диоксана, добавляли 1 мл 5% водного аммиака до рН 8.0. Вносили в смесь 0.1 мл 3% водной перекиси водорода и перемешивали в течение 10 мин. Полноту окисления SH-групп контролировали с помощью реагента Эллмана (бесцветный раствор). По окончании реакции целевой продукт хроматографировали на колонке 25×600 мм с Sephadex G-25, уравновешенной 2% раствором уксусной кислоты, с целью удаления низкомолекулярных примесей. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и лиофилизировали. Получено 0.013 г синтетического антигена (81%). Масс-спектр: 2679.8 ([М+Н +]), вычислено 2680.9 для С116Н162 N30О36S4.
Иммуноферментный анализ аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору на синтетическом антигене
Сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом, представляющим собой 2-ую внеклеточную петлю 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, проводили в одинаковых условиях постановки непрямого твердофазного ИФА. Методика и условия постановки ИФА были аналогичными описанным в литературе [7].
В состав набора реагентов для определения аутоантител входили следующие компоненты: 96-луночный планшет для иммуноанализа, фирма «Costar», кат. № 9018; синтетический антиген (см. пример 3) и пептид 197-222 2-ой внеклеточной петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора; 0,1 М Na-карбонатный буфер; раствор для разведения образцов, конъюгатов, блокирующий раствор и раствор для отмывки планшетов - 0,01М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 8 г/л М NaCl, 0,1% Твин-20, 3% обезжиренное сухое молоко и бактериостатик катон CG 2,0 мл/л (ФСБМ-Т); раствор для отмывки планшетов - 0,01 М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т); конъюгат - реагент для анализа: мышиные моноклональные антитела против IgG человека, меченые биотином; конъюгат стрептавидин-пероксидаза; раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 1 мМ/л в диметилформамиде; субстратный буферный раствор - натрий цитрат 5,5-водный, 26 г/л; лимонная кислота 6,92 г/л, натрия перборат 1,1 г/л и катон CG 2,0 мл/л; стоп-реагент - фосфорная кислота 5%.
Протокол анализа
Перед проведением анализа компоненты набора выдерживали при температуре +20°С в течение 60 мин. Для иммобилизации антигена на планшетах для проведения ИФА препараты пептидов разводили до концентрации 5 мкг/мл в 0,1 М Na2CO3-NaHCO3 рН 9,6. Вносили в лунки планшетов по 100 мкл и инкубировали 20 часов при +20°С. Для исключения неспецифических взаимодействий в лунки планшета вносили по 100 мкл ФСБМ-Т и инкубировали 3 часа при +20°С со встряхиванием. Для удаления несвязанных антигенов лунки планшета промывали 3 раза ФСБМ-Т. Образцы, разведенные в ФСБМ-Т в 20 и 100 раз, вносили пипеткой в соответствующие лунки по 100 мкл, инкубировали при температуре +4°С в течение 12 часов. Промывали планшет ФСБМ-Т не менее 3-х раз. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора реагента для анализа в ФСБМ-Т, инкубировали при температуре +20°С в течение 60 мин со встряхиванием. Промывали планшет раствором ФСБМ-Т три раза. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата в ФСБМ-Т, инкубировали планшет при температуре +20°С в течение 30 мин со встряхиванием. Промывали раствором ФСБ-Т четыре раза, затем немедленно вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора свежеприготовленной субстратной смеси (7 объемов субстратного буферного и 1 объем раствора ТМБ). Закрывали планшет крышкой и инкубировали при температуре +20°С без перемешивания в течение 15 мин, затем вносили по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь. В течение 5 мин после добавления стоп-реагента регистрировали оптическую плотность в планшете при длине волны 450 нм.
Определение связывания сорбента с иммобилизованным синтетическим антигеном и характеристика специфичности
Иммобилизацию заявляемого синтетического антигена и сопоставляемого с ним сочетания пептидов последовательности 125-133 и 206-218 молекулы 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора по прототипу на бромцианактивированную Sepharose 4 FF проводили в соответствии со стандартной методикой иммобилизации белковых лигандов на агарозную матрицу.
Пептиды растворяли до концентрации 0,3-2,5 мг/мл и иммобилизовали на агарозную матрицу, для чего растворы пептидов в 0,2 М боратном буфере с рН 8,0 инкубировали в течение 10 часов с предварительно активированной бромцианом агарозной матрицей.
Концентрацию иммобилизованного лиганда оценивали по разнице в количестве пептида, использованного для проведения реакции иммобилизации и оставшегося в растворе после окончания инкубации с матрицей. Концентрацию пептида в растворе измеряли по оптическому поглощению при 280 нм. По окончании иммобилизации сорбент промывали 10 объемами дистиллированной воды. Затем к полученному сорбенту (2 мл суспензии, содержащий 1 мл осевшего геля) добавляли по 0,5 мл 1М раствора этаноламина, подкисленного HCl до значения рН 8. Смесь перемешивали при 20°С в течение 30 минут, затем сорбент промывали 20 объемами воды.
Для определения количества адсорбированных антител на сорбенте с иммобилизованным заявляемым синтетическим антигеном и прототипом проводили аффинную хроматографию плазмы крови пациентов больных ДКМП и здорового донора. Соотношение объема сорбента к объему плазмы составлял 2:1, время инкубации - 1 час. После окончания инкубации сорбенты промывали 50-кратным объемом буферной смеси 0.01 М KH2PO4-NaOH с рН 7.0, связавшийся белок элюировали 20-кратным объемом буферной смеси 0,2М глицин-HCl рН 2,5.
Результаты
Чувствительность и специфичность выявления аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору
Сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом участка 197-222 2-ой внеклеточной петли 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора, проводили в опыте с унифицированными условиями. Условия постановки ИФА соответствовали условиям ИФА, описанным для прототипа [7]. Определение аутоантител проводили в группе больных ДКМП (группа 1, n=9), в смешанной группе больных с пониженной фракцией выброса левого желудочка (как с ДКМП, так и с тахиаритмиями) (группа 2, n=16) и в группе здоровых доноров (группа 3, n=24).
Результаты чувствительности ИФА для определения аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору в образцах плазмы/сыворотки крови пациентов исследуемых групп и здоровых доноров приведены в таблице.
Таблица. | |||
Сравнение среднего сигнала в ИФА между различными группами | |||
Образец | Пациенты | Здоровые доноры | |
группа 1, n=6 | группа 2, n=16 | группа 3, n=24 | |
Заявляемый синтетический антиген | 0,32±0,12* | 0,36±0,08** | 0,22±0,04 |
пептид 197-222 последовательности 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора | 1,1±0,9 | 1,2±0,7 | 0,8±0,2 |
Данные представлены как среднее ± отклонение для доверительной вероятности по критерию Стьюдента, уровень статистической значимости результатов **p<0,005, *p<0,1.
Приемлемый уровень статистической значимости (p<0,05) между группой здоровых доноров и группами больных в собственных экспериментах авторов наблюдался только для ИФА с использованием синтетического антигена, что свидетельствовало о большей специфичности взаимодействия заявляемого синтетического антигена с аутоантителами к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору, чем пептида 197-222.
Согласно литературным данным частота выявления аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренопецептору у больных ДКМП на пептиде 197-222 последовательности 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора составляет 13 положительных ответов из 42, что составляет 30%
[7]. В наших собственных экспериментах при использовании заявляемого синтетического антигена частота выявления аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору у больных ДКМП составило 44% (4 положительных ответа из 9 пациентов ДКМП), тогда как на пептиде 197-122 последовательности 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептора - 33% (3 положительных ответа из 9 пациентов ДКМП) (данные не приведены). Положительным ответом считали сигнал, в два раза превышавший значение среднего уровня фона. Полученные данные свидетельствуют о большей чувствительности метода выявления аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору при использовании заявляемого синтетического антигена.
Связывание аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору на сорбентах
Нужно отметить, что в литературе отсутствуют данные, позволяющие сравнить по сорбционным характеристикам заявляемый синтетический антиген с прототипом. Поэтому сорбционные свойства сорбента, содержащего синтетический антиген, и сорбента с прототипом проверяли методом аффинной хроматографии с плазмой крови человека в одинаковых условиях в экспериментах in vitro. Для этого использовали плазму крови пациентов ДКМП (пациент 1 и 2), пациента с тахиаритмией (пациент 3) и здорового донора. Количество связавшихся с тестируемыми сорбентами иммуноглобулинов класса G при проведении аффинной хроматографии индивидуальных плазм больных ДКМП и плазмы здорового донора приведены на чертеже.
На чертеже - Количество связанных аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору из плазмы пациентов и плазмы здоровых доноров на сорбентах с иммобилизованным прототипом и заявляемым синтетическим антигеном.
По результатам собственных исследований авторов среднее количество сорбированных антител для сорбента с иммобилизованным заявляемым синтетическим антигеном (количество IgG в элюате с 1 мл сорбента) в опытах тремя образцами плазмы крови больных ДКМП составляло 227±35 мкг, тогда как на прототипе 70±65 мкг (p<0,05).
Таким образом, заявляемый синтетический антиген позволяет со значительно большей чувствительностью и аффинностью связывать аутоантитела из плазмы/сыворотки больных с наличием аутоантител к 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-адренорецептору по сравнению с прототипом.
Литература
1. San Martin M.A. et al. Dilated cardiomyopathy and autoimmunity: an overview of current knowledge and perspectives. // Rev Esp Cardiol. - 2002. - V.55 (5) P.514-524.
2. Fu M. et al. Is cardiomyopathy an autoimmune disease? // 2002. - V.51 (4). - P.208-212.
3. Rönspeck W. et al. Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption. // Ther Apher Dial. - 2003. -. V.7 (1). - P.91-97.
4. Staudt A. et al. Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution. // Circulation. - 2001. - V.103 (22). - P.2681-2686.
5. Коновалов Г.А. и др. Аферез иммуноглобулинов - новый подход к лечению тяжелых форм дилатационной кардиомиопатии. // Кардиология. - 2002 - № 6 - С.123-127
6. Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy. // Artificial Organs. - 2004. - V.28 (2). - P.171-181.
7. Magnusson Y. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. // Circulation. - 1994. - V.89 (6). - P.2760-2767.
8. Matsui S. et al. Active immunization of combined betal-adrenoceptor and M2-muscarinic receptor peptides induces cardiac hypertrophy in rabbits. // J Card Fail. - 1999. - V.5 (3). - P.246-254.
9. Zhang L et. al. Autoantibodies against the myocardial betal-adrenergic and M2-muscarinic receptors in patients with congestive heart failure Chin Med J (Engl). 2002; 115 (8): 1127-31.
10. Chiale PA, et. al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001; 103 (13): 1765-71.
11. Iwata M. Et al, Autoimmunity Against the Second Extracellular Loop of 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> 1-Adrenergic Receptors Induces 1-адренорецептору, патент № 2356576" SRC="" height=100 BORDER="0" ALIGN="absmiddle"> -Adrenergic Receptor Desensitization and Myocardial Hypertrophy In Vivo. // Circulation Research. - 2001 - V.88. - P.578-586.
12. Rönspeck W. Peptides for combating the autoantibodies that are responsible for dilatative cardiomyopathy (DCM). // EP 1214350.
13. Hopp N., Woods К. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.72. 72. P.3824-3828.
14. M.B.Сидорова, А.С.Молокоедов, А.А.Азьмуко, Е.В.Кудрявцева, Е.Краузе, М.В.Овчинников, Ж.Д.Беспалова. Применение перекиси водорода для замыкания дисульфидных мостиков в пептидах. // Биоорганическая химия, 2004, том 30, № 2, с.115-125.
15. Barany G., Merrifild R.B. Solid phase synthesis. // The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. / Ed. Е.Gross, J.Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P.3-254.
Класс A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела
Класс G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний
Класс C07K14/705 рецепторы; клеточные антигены; клеточные поверхностные детерминаторы