способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria repens

Формула изобретения

Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria repens, включающий гомогенизацию ультразвуковую, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что предварительно проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 ч, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20, с экспозицией 1 ч при температуре 4°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностике дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.

Дирофиляриоз является одной из важных проблем паразитологии. Несмотря на то, что этот паразитоз отнесен к редким, в последние годы отмечается рост числа случаев данного заболевания у человека. Это обусловлено высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия иммунологических тестов.

Проблема иммунодиагностики этого гельминтоза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способ получения антигена дирофилярий имеет большую научную и практическую ценность.

Известен способ получения антигена дирофилярий, включающий помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц в течение 30 с при температуре 0°С, центрифугирование при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена (Е.Espinoza, M.Cordero, A.Muro, F.Lorente, F.Simon. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / Tropical Medicine and Parasitology. - 1993. - V.44. - № 3. - P.172).

Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена Simon F. et al сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus (F.Simon, A.Muro, M.Corder, J.Marti. A seroepidemiologic survey of human dirofilariosis in Western Spain / Tropical Medicine and Parasitology. - 1991. - V.42. - № 2. - 106-108 p.).

Целью изобретения является разработка способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens с высокими показателями специфичности для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (использование дополнительно механической гомогенизации), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток; использованием экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы, тем самым увеличивается концентрация белка в антигене; проведением дополнительной очистки антигена дирофилярий от липоидов с помощью ацетона, что повышает его специфичность.

Способ включает следующие этапы.

1. Подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации.

Неполовозрелую самку Dirofilaria repens, удаленную хирургическим путем, отмывают многократно физиологическим раствором и помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.

2. Получение полного соматического экстракта.

Проводят механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.

Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С.

3. Очистка экстракта в ацетоне.

Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре +4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.

К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 минут, а затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.

Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.

4. Анализ диагностических свойств полного соматического очищенного антигена.

Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.

Пример 1.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных. В опытах использовали сыворотки крови собак больных дирофиляриозом Dirofilaria repens, дирофиляриозом Dirofilaria immitis, свободных от данной инвазии и собак с другими паразитозами. Кровь всех собак предварительно была исследована на наличие микрофилярий классическим способом.

Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 100%.

Пример 2.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей. В этом эксперименте использовались сыворотки больных дирофиляриозом людей (банк сывороток Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии) и людей вне инвазии: здоровых и больных токсокарозом и другими паразитозами (лямблиозом, описторхозом).

Результаты представлены в таблице 2. По результатам ИФА установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови людей составила 84,62%, специфичность - 87,50%.

Пример 3.

Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибиции антител. Для этого соматический антиген в различных разведениях (концентрация белка от 21,90 до 1,10 мк/мл) добавляли в стандартизированные дозы сыворотки больного дирофиляриозом, инкубировали 30 мин при +37°С. Далее смесь антиген-антитело обрабатывали в ИФА по стандартной методике.

Результаты реакции ингибиции представлены в таблице 3 и на чертеже. Как видно из таблицы и чертежа, отмечалась ярко выраженная зависимость эффекта ингибиции от внесенной дозы антигена. Чем выше концентрация белка вносимого антигена, тем ниже оптическая плотность данной сыворотки.

Таблица 1. Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных.
Сыворотки крови собак	Количество животных	Результаты ИФА
положит.	отриц.	чувствит.	специфич.
Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria repens	126	126	0	100%	100%
Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria immitis	10	-	10
Животные вне данной инвазии	10	-	10
Животные с другими паразитозами	10	-	10

Таблица 2. Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей.
Сыворотки крови людей	Количество обследованных	Результаты ИФА
положит.	отриц.	чувствит.	специфич.
Больные дирофиляриозом с подтвержденным диагнозом	39	34	6	84,62%	87,50%
Здоровые лица	12	1	11
Больные токсокарозом	9	2	7
Больные другими паразитозами (описторхоз, лямблиоз)	11	1	10

Таблица 3. Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибирования антител.
	Оптическая плотность
К-	0,057
КДиагн.	0,171
100 мкл Д+	0,412
100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 21,90 мк/мл)	0,093
100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 5,48 мк/мл)	0,119
100 мкл Д + + 100 мкл антигена (концентрация белка 2,74 мк/мл)	0,131
100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 1,10 мк/мл)	0,157
100 мкл Д + + 100 мкл жидкости для разведения сывороток	0,277
К- - контроль отрицательный КДиагн. - контроль диагностический Д+ - сыворотка крови больного дирофиляриозом в разведении 1:50