способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria repens

Классы МПК:A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела
G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Федеральное государственное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН "РостовНИИМП" Роспотребнадзора) (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2008-01-09
публикация патента:

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунодиагностике, и может быть использовано для прижизненной серодиагностики дирофиляриоза у животных и человека. Способ включает получение очищенного соматического антигена Dirofilaria repens при помощи последовательной механической и ультразвуковой гомогенизации с экстракцией белков в 0,25 М водном растворе сахарозы, осаждение супернатанта в охлажденном ацетоне, растворение вакуумно-высушеного осадка в калий-фосфатном буфере. Способ обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности. 3 табл., 1 ил.

способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria   repens, патент № 2356575

Формула изобретения

Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria repens, включающий гомогенизацию ультразвуковую, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что предварительно проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 ч, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20, с экспозицией 1 ч при температуре 4°С.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностике дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.

Дирофиляриоз является одной из важных проблем паразитологии. Несмотря на то, что этот паразитоз отнесен к редким, в последние годы отмечается рост числа случаев данного заболевания у человека. Это обусловлено высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия иммунологических тестов.

Проблема иммунодиагностики этого гельминтоза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способ получения антигена дирофилярий имеет большую научную и практическую ценность.

Известен способ получения антигена дирофилярий, включающий помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц в течение 30 с при температуре 0°С, центрифугирование при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена (Е.Espinoza, M.Cordero, A.Muro, F.Lorente, F.Simon. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / Tropical Medicine and Parasitology. - 1993. - V.44. - № 3. - P.172).

Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена Simon F. et al сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus (F.Simon, A.Muro, M.Corder, J.Marti. A seroepidemiologic survey of human dirofilariosis in Western Spain / Tropical Medicine and Parasitology. - 1991. - V.42. - № 2. - 106-108 p.).

Целью изобретения является разработка способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens с высокими показателями специфичности для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (использование дополнительно механической гомогенизации), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток; использованием экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы, тем самым увеличивается концентрация белка в антигене; проведением дополнительной очистки антигена дирофилярий от липоидов с помощью ацетона, что повышает его специфичность.

Способ включает следующие этапы.

1. Подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации.

Неполовозрелую самку Dirofilaria repens, удаленную хирургическим путем, отмывают многократно физиологическим раствором и помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.

2. Получение полного соматического экстракта.

Проводят механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.

Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С.

3. Очистка экстракта в ацетоне.

Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре +4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.

К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 минут, а затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.

Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.

4. Анализ диагностических свойств полного соматического очищенного антигена.

Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.

Пример 1.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных. В опытах использовали сыворотки крови собак больных дирофиляриозом Dirofilaria repens, дирофиляриозом Dirofilaria immitis, свободных от данной инвазии и собак с другими паразитозами. Кровь всех собак предварительно была исследована на наличие микрофилярий классическим способом.

Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 100%.

Пример 2.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей. В этом эксперименте использовались сыворотки больных дирофиляриозом людей (банк сывороток Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии) и людей вне инвазии: здоровых и больных токсокарозом и другими паразитозами (лямблиозом, описторхозом).

Результаты представлены в таблице 2. По результатам ИФА установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови людей составила 84,62%, специфичность - 87,50%.

Пример 3.

Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибиции антител. Для этого соматический антиген в различных разведениях (концентрация белка от 21,90 до 1,10 мк/мл) добавляли в стандартизированные дозы сыворотки больного дирофиляриозом, инкубировали 30 мин при +37°С. Далее смесь антиген-антитело обрабатывали в ИФА по стандартной методике.

Результаты реакции ингибиции представлены в таблице 3 и на чертеже. Как видно из таблицы и чертежа, отмечалась ярко выраженная зависимость эффекта ингибиции от внесенной дозы антигена. Чем выше концентрация белка вносимого антигена, тем ниже оптическая плотность данной сыворотки.

Таблица 1.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных.
Сыворотки крови собак Количество животных Результаты ИФА
положит.отриц. чувствит. специфич.
Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria repens 126126 0100% 100%
Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria immitis 10- 10
Животные вне данной инвазии 10- 10
Животные с другими паразитозами 10- 10

Таблица 2.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей.
Сыворотки крови людей Количество обследованных Результаты ИФА
положит.отриц. чувствит. специфич.
Больные дирофиляриозом с подтвержденным диагнозом 3934 684,62% 87,50%
Здоровые лица 12 111
Больные токсокарозом 9 27
Больные другими паразитозами (описторхоз, лямблиоз) 111 10

Таблица 3.

Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибирования антител.
способ получения очищенного соматического антигена dirofilaria   repens, патент № 2356575 Оптическая плотность
К-0,057
КДиагн. 0,171
100 мкл Д+ 0,412
100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 21,90 мк/мл) 0,093
100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 5,48 мк/мл)0,119
100 мкл Д + + 100 мкл антигена (концентрация белка 2,74 мк/мл) 0,131
100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 1,10 мк/мл)0,157
100 мкл Д + + 100 мкл жидкости для разведения сывороток 0,277
К- - контроль отрицательный

КДиагн. - контроль диагностический

Д+ - сыворотка крови больного дирофиляриозом в разведении 1:50

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2356575

patent-2356575.pdf

Класс A61K39/00 Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела

лекарственное средство для лечения патологического синдрома и способ лечения острых и хронических заболеваний дыхательноый системы и синдрома кашля -  патент 2529783 (27.09.2014)
холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины -  патент 2529772 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ получения концентрата микробных клеток для получения живой туляремийной вакцины -  патент 2528878 (20.09.2014)
вакцины и компоненты вакцин для подавления микробных клеток -  патент 2528854 (20.09.2014)
рекомбинантная вакцина на основе инактивированного вирусного вектора -  патент 2528750 (20.09.2014)
антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения -  патент 2528738 (20.09.2014)
антитела против альфа5-бета 1 и их применение -  патент 2528736 (20.09.2014)
антагонисты pcsk9 -  патент 2528735 (20.09.2014)
способ лечения больных с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела -  патент 2528641 (20.09.2014)

Класс G01N33/531 получение материалов для иммунологических испытаний

способ получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний -  патент 2521232 (27.06.2014)
новый аллерген-простатический калликреин -  патент 2502074 (20.12.2013)
применение моноклональных антител для идентификации ямагатской или викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа в, штамм гибридомы 4н7 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в ямагатской ветви, штамм гибридомы в/4н1 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в викторианской ветви -  патент 2491338 (27.08.2013)
модифицированный пептид и его использование для тестирования онкологических заболеваний цнс и эффективности терапии -  патент 2491291 (27.08.2013)
способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (рбп) -  патент 2488119 (20.07.2013)
способ получения антигена из сетарий для диагностики дирофиляриоза собак -  патент 2487722 (20.07.2013)
способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1 ингибитора по способности связываться с igal-протеазой -  патент 2475756 (20.02.2013)
способ получения слабоположительной контрольной сыворотки, содержащей ad и ay субтипы hbsag -  патент 2473913 (27.01.2013)
способ изготовления панели сывороток с hbsag ad- и ay-субтипов для контроля качества диагностики гепатита в -  патент 2463610 (10.10.2012)
способы получения растворимых многопроходных трансмембранных белков -  патент 2441071 (27.01.2012)
Наверх