адъювант

Формула изобретения

1. Применение экстракта бересты в качестве адъюванта.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт бересты используют в виде наночастиц.

3. Применение по п.2 в виде водного раствора наночастиц.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к области медицины и ветеринарии, более конкретно к вирусологии.

Угроза вирусных эпидемий продолжает волновать человечество. При выработке стратегии борьбы с вирусными возбудителями вирусологи единодушны во мнении, что главенствующее место должны занять вакцины, как наиболее эффективные медицинские средства профилактики и снижения смертности населения.

Поэтому последние несколько лет во всем мире ведутся интенсивные разработки вакцинных препаратов, поскольку вакцины (живые и инактивированные) показали себя как безвредные, безопасные для окружающих иммуногенные препараты, хотя, в ряде случаев, их эффективность оставляет желать лучшего.

Применительно к инактивированным вакцинам наибольшую эффективность можно прогнозировать в случае использования в качестве основы вирулентного вирусного штамма, но при этом резко возрастает сложность производства, обусловленная, опасностью работы и необходимостью строгого контроля за полнотой инактивации возбудителя.

Отличительной особенностью инактивированных вакцин является включение в их состав адъювантов. Адъювант - это субстанция, добавляемая в вакцинный препарат для увеличения выработки организмом антител. Наиболее часто в этих целях используют гидроокись алюминия. Последние исследования показали, что помимо увеличения времени нахождения антигена в месте введения и его адсорбции, она повышает экспрессию HLA-антигенов II класса, молекул В 7-2 (CD 86 и CD 83), экспрессию костимулирующих молекул, молекул адгезии и продукцию интерлейкина - 4, что сопровождается изменением морфологии в сторону дендритных клеток.

В результате исследований последних лет разработаны и другие, более активные адъюванты. В экспериментах на животных показана эффективность использования при иммунизации GpG-олигодезоксинуклеотидов, выделенных из бактериальных ДНК и синтетически созданных. Эффективность мукозальной риппозной вакцинации повышается при использовании токсинов холерного вибриона и энтеротоксинов кишечной палочки, кораубазидана (полисахарида, продуцируемого внеклеточно апатогенным грибом), хитозана (полисахарида, полученного из оболочки ракообразных), бакуловируса и синтетического агониста TLR4, синтетической двуцепочечной РНК-поли (1:С). Профилактическая активность инактивированных вакцин с новым адъювантом MF 59 при иммунизации пожилых людей, особенно с хроническими заболеваниями, оказалась выше, чем обычных сорбированных препаратов.

Применяемые в медицинской практике адъюванты, в частности адъювант Фрейнда, дороги, содержат остатки клеточных структур, способных вызвать выработку посторонних антител. Их высокая вязкость затрудняет работу на мелких животных.

Задачей настоящего изобретения является поиск нового адъюванта, лишенного в значительной степени указанных недостатков. Проведенные авторами настоящего изобретения исследования привели к обнаружению возможности использования в качестве такого адъюванта экстракта бересты (белой части березовой коры) с преобладающим содержанием бетулина. Предпочтительным является использование указанного препарата в виде наночастиц.

Объектом исследования являлись экспериментальные образцы инактивированных вирусных антигенов в комплексе с адъювантом на основе наночастиц «Бересты экстракта сухого» с преобладающим содержанием (65%) бетулина (далее по тексту бетулин). Указанный экстракт производится заявителем настоящей заявки - ООО «Березовый мир» и используется в качестве БАД.

Осуществлялось сравнительное изучение иммуногенных свойств рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и инактивированного антигена клещевого энцефалита (КЭ) в комплексе с адъювантами на основе наночастиц бетулина.

Для иммунизации животных использовали следующие препараты:

- Рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (полуфабрикат вакцины), концентрация HBsAg - 50 мкг/мл;

- Инактивированный антиген вируса клещевого энцефалита (цельновирионный полуфабрикат вакцины), концентрация белка Е-10 мкг/мл;

- Адъювант 1 (АД-1): экстракт бересты сухой с содержанием бетулина 65%, (БЭС-65);

- Адъювант 2 (АД-2): высушенный препарат наночастиц БЭС, (РЯ);

- Адъювант 3 (АД-3): 0,5% водный раствор наночастиц бетулина (ГИПХ).

- Известный адъювант (гидроксид алюминия, ГАл): 0,5% водный раствор.

Адъюванты АД-2 и АД-3 готовились следующим образом. Адъювант АД-3 (0,5% водный раствор наночастиц):

- растворение бересты экстракта сухого (БЭС-65) в органическом растворителе при концентрации 2,5-5 г/л;

- добавление (впрыскивание) к указанному раствору большого количества воды (до 25 объемов воды по отношению к объему раствора);

- удаление растворителя и основной части воды.

Адъювант АД-2 (высушенный препарат наночастип):

- к полученному водному раствору наночастип (см. получение АД-3) добавляют криопротектор (например, сорбит) и лиофилизируют.

Перед иммунизацией адъюванты АД-1 и АД-2 растворяли в фосфатном буфере (рН 7,5), обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, после чего охлаждали.

В опытах изучали препараты следующего состава:

На основе рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В

Препарат 1, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, ГАл - 500 мкг/мл

Препарат 2, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-1 - 500 мкг/мл

Препарат 3, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-2 - 500 мкг/мл

Препарат 4, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-3 - 500 мкг/мл

Препарат 5, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-1 - 100 мкг/мл

Препарат 6, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-2 - 100 мкг/мл

Препарат 7, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-3 - 100 мкг/мл

На основе инактивированного антигена клещевого энцефалита (ВКЭ)

Препарат 8, состав: ВКЭ белок Е -1 мкг/мл, ГАл - 500 мкг/мл

Препарат 9, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-1 - 500 мкг/мл

Препарат 10, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-3 - 500 мкг/мл

Препарат 11, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-1 - 100 мкг/мл

Препарат 12, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-3 - 100 мкг/мл

В качестве референс препаратов использовали:

Реф. 1: HBsAg - 10 мкг/мл

Реф. 2: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл

Реф. 3: АД-1 - 500 мкг/мл

Реф. 4: Физраствор

Титры специфических антител в сыворотках крови иммунизированных мышей определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) и торможения гемагглютинации (РТГА). Для количественного определения вируса КЭ применяли экспериментальную тест-систему с использованием моноклональных антител к поверхностному гликопротеину Е.

Протективную активность препаратов с вирусом КЭ определяли введением внутрибрюшинно 300-400 летальных доз референс-штамма «Абсеттаров» через неделю после последней иммунизации. В течение 14 дней после заражения вели учет на специфичность умерших животных.

Пример 1

Иммуногенные и протективные активности различных вирусных препаратов оценивали при подкожной иммунизации беспородных белых мышей массой 14-16 г. Препараты вводили однократно и двукратно с интервалом 14 дней. В качестве контроля белым мышам подкожно однократно и двукратно вводили референс препараты.

Через 21 день после окончания цикла иммунизации у животных из каждой группы брали кровь и готовили объединенный пул сывороток крови для определения титра AT в ИФА и РТГА.

Результаты, характеризующие иммунологическую эффективность различных препаратов, представлены в таблице 1.

Таблица 1
Препарат №	Антиген	Титр при однократном введении	Титр при двукратном введении
	ИФА	РТГА	ИФА	РТГА
1	HBsAg	1:320		1:640
2	HBsAg	1:640		1:1280
3	HBsAg	1:320		1:2560
4	HBsAg	1:640		1:1280
5	HBsAg	1:80		1:320
6	HBsAg	1:160		1:160
7	HBsAg	1:80		1:320
8	КЭ	1:80	1:40	1:320	1:80
9	КЭ	1:80	1:40	1:640	1:80
10	КЭ	1:160	1:40	1:1280	1:160
11	КЭ	1:40	1:20	1:320	1:40
12	КЭ	1:20	<1:20	1:160	1:80
Реф.1	HBsAg	1:40		1:160
Реф.2	КЭ	1:20	1:10	1:40	1:40
Реф.3		<1:20	<1:10	1:10	<1:10
Реф.4		<1:10	<1:10	<1:10	<1:10

По иммуногенности препараты, содержащие адъюванты, мало отличались друг от друга, за исключением титров ИФА при иммунизации HBs Ag с АД-2.

Как следует из полученных данных, в условиях одно- и двукратной иммунизации экспериментальные образцы антигенов при введении с адъювантами на основе наночастиц экстракта бересты проявляли более высокую иммуногенность, чем сам антиген и антиген, адсорбированный на гидроокиси алюминия.

Наибольшую иммуногенную эффективность показал препарат HBs Ag, введенный с адъювантом АД-2. Данный адъювант повышал эффективность иммунизации как для HBs Ag, так и для инактивированного КЭ. Разница заключалась в том, что для инактивированного КЭ более выраженные результаты были получены после второй иммунизации.

Пример 2

Для приготовления опытной вакцины адъювант АД-2 Сбэс=2% смешивали с антигеном вируса ньюкаслской болезни в соотношении 1:1. Смесь тщательно встряхивали и вводили цыплятам в грудную мышцу в объеме 0,5 мл. Другую группу цыплят привили инактивированной вакциной против ньюкаслской болезни, изготовленной в ФГУ "ВНИИЗЖ" на основе адъюванта ISA-70 (соотношение Аг:Ад 30:70). Третья группа цыплят оставалась невакцинированной.

Сыворотки крови отбирались на 14, 21 и 31 сутки после вакцинации и исследовались в РТГА эритроцитов петуха вирусом ньюкаслской болезни.

Результаты испытания представлены в таблице 2.

Таблица 2
Название препарата	Кол-во голов в группе	Доза препарата	Средний по группе титр антител в лог2
До вакцинации	Через 14 сут после вакцинации	Через 21 сут после вакцинации	Через 31 сут после вакцинации
Образец № 2 Сбэс=2% с антигеном вируса ньюкаслской болезни 1:1	10	0,5 мл	2	7,8	8,6	7,9
Вакцина против ньюкаслской болезни инактивированная эмульсионная на основе ISA-70	10	0,5 мл	2	7,7	8,7	8,8
Невакцинированные цыплята	10	0	2	2	4	4

Пример 3

Опытный образец вакцины с адъювантом АД-2 готовили смешиванием препарата с инактивированным антигеном реовируса птиц в соотношении 1:1 и тщательным их перемешиванием. Одновременно с этим используя тот же антиген готовили образец на основе адъюванта ISA 70 в соотношении антиген-адъювант 30:70, который использовали для сравнения иммунного ответа.

Цыплят 45-суточного возраста вакцинировали опытным образцом с препаратом наночастиц и контрольным образцом на основе ISA 70 в дозе 0,5 мл в область груди. Группу цыплят оставили невакцинированными.

Сыворотки крови отбирались через 15 и 30 суток после вакцинации и исследовались в ИФА с использованием соответствующего набора для определения уровня антител.

Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3
Название препарата	Кол-во голов в группе	Доза препарата	Средний титр по группе
До вакцинации.	Через 15 сут после вакцинации	Через 30 сут после вакцинации
Образец 1. Антиген реовируса птиц с препаратом наночастиц № 2 Сбэс=2% в соотношении 1:1	10	0,5 мл	1125	2473	3104
Образец 2. Антиген реовируса птиц с адъювантом ISA-70 (30:70)	9	0,5 мл	1034	3233	4026
Невакцинированные цыплята	10	0	1164	1235	1267

Пример 4

Опытный образец вакцины с адъювантом АД-2 готовили смешиванием его с инактивированным антигеном метапневмовируса птиц в соотношении 1:1 и тщательным перемешиванием. Как и в опыте 2 готовили контрольный образец на основе адъюванта ISA 70.

Цыплят 45-суточного возраста вакцинировали опытными с препаратом наночастиц и контрольными образцами на основе ISA 70 в дозе 0,5 мл в область груди. Группу цыплят оставили невакцинированными.

Сыворотки крови отбирались через 15 и 30 суток после вакцинации и исследовались в ИФА с использованием соответствующего набора для определения уровня антител.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4
Название препарата	Кол-во голов в группе	Доза препарата	Средний % блокирования по группе
До вакцинации	Через 15 сут после вакцинации	Через 30 сут после вакцинации
Образец 3. Антиген метапневмовируса птиц с препаратом наночастиц № 2 Сбэс=2% в соотношении 1:1	9	0,5 мл	22,5 (отрицательный)	46,2 (положительный)	43,1 (положительный)
Образец 4. Антиген метапневмовируса птиц с адъювантом ISA-70 (30:70)	7	0,5 мл	24,3 (отрицательный)	63,9 (положительный)	66,5 (положительный)
Невакцинированные цыплята	10	0	27,6 (отрицательный)	25,4 (отрицательный)	27,8 (отрицательный)

Результаты исследований показывают, что использование препарата наночастиц экстракта бересты совместно с антигенами вируса ньюкаслской болезни, реовируса птиц и мета пневмовируса птиц в соотношении 1:1 и внутримышечном применении в дозе 0,5 мл на цыпленка имеет выраженное адъювантное действие, проявляющееся в повышении титра антител против соответствующего антигена и не уступающего по значению с действием адъюванта ISA70 для вируса ньюкаслской болезни и реовируса птиц.