способ определения антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий по отношению к патогенным микобактериям

Формула изобретения

Способ определения антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий по отношению к патогенным микобактериям, включающий внесение исследуемой пробы пробиотика в количестве 16-32% от объема среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, серно-кислый магний, лимонную кислоту, лимонно-кислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	0,4, г
калий фосфорно-кислый двузамещенный	0,05 г
серно-кислый магний	0,05 г
лимонная кислота	0,2 г
лимонно-кислое аммиачное железо	0,005 г
пируват натрия	0,05 г
глицерин	4,0 г
агар	3,0 г
гумивит	10,0 мл
водный раствор желтка куриного яйца (1:1)	10,0 мл
дистиллированная вода	до 100,0 мл,

прогревание на кипящей водяной бане в течение 5 мин, скашивание среды, посев культуры индикаторного штамма на поверхность косячка, культивирование при температурном и временном оптимуме с последующей количественной оценкой антагонистической активности по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде с добавлением казеинового бульона в количестве 20%, к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде после внесения в нее пробиотика и прогревания.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, касается способа оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий и может быть использовано для отбора препаратов-пробиотиков медицинского и ветеринарного назначения.

Одним из показателей специфической активности пробиотиков и производственных штаммов для их изготовления является наличие антагонистического действия в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры.

Известен способ отсроченного антагонизма, когда подсев индикаторных штаммов на плотную питательную среду проводится через определенный период после посева испытуемой культуры [1].

Антагонистическую активность пробиотиков и бактериальных штаммов можно определить in vitro регламентированными способами, включающими совместное культивирование с индикаторными культурами в жидкой или на плотной питательной среде [2]. Определение антагонистической активности пробиотиков по отношению к индикаторным штаммам методом прямого антагонизма рассматривается нами в качестве предпочтительного аналога.

Общим недостатком известных способов является их неэффективность при определении антагонистической активности пробиотиков по отношению к микобактериям из-за особенностей биологии последних, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирование с другими микроорганизмами.

Цель изобретения - повышение эффективности.

Поставленная цель достигается использованием для совместного культивирования среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов:

L-аспарагин	0,4 г
калий фосфорнокислый двузамещенный	0,05 г
сернокислый магний	0,05 г
лимонная кислота	0,2 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,005 г
пируват натрия	0,05 г
глицерин	4,0 г
агар	3,0 г
гумивит	10,0 мл
водный раствор желтка куриного яйца (1:1)	10,0 мл
дистиллированная вода	до 100,0 мл

Причем исследуемый материал вносят в количестве 16-32% от общего объема среды, после чего пробирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, а антагонистическую активность оценивают по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением среды культивирования (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика (опыт).

Способ осуществляется следующим образом.

Ампулу с сухим пробиотиком вскрывают и регидратируют 0,9% раствором натрия хлорида. В стерильную пробирку с расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, инокулируют пробиотик в количестве 16-32% от общего объема среды, пробирку прогревают на кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего среду скашивают, а затем на поверхность косячка осуществляют посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячки расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей L-аспарагин, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, пируват натрия, глицерин, агар, гумивит, водный раствор желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду, с добавлением среды культивирования.

Для приготовления среды в химически чистую стерильную колбу емкостью 200 мл наливают 30,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 0,2 г лимонной кислоты, 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г сернокислого магния, 0,05 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 10,0 мл гумивита и 3,0 г агара. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов устанавливают рН 7,1-7,2 10% раствором натрия гидроокиси, общий объем доводят до 90,0 мл стерильной дистиллированной водой. Раствор автоклавировают в течение 30 минут при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывают в проточной воде, протирают 96° этиловым спиртом, разбивают в стерильных условиях и отделяют белок от желтка. В стерильной колбе смешивают желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 10,0 мл полученного раствора добавляют в расплавленную агаровую среду и перемешивают.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром) представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот [3]. Раствор солей гумусных кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов [4, 5]. Гумивит - жидкость темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом, благодаря чему готовая среда имеет интенсивно коричневый цвет, на фоне которого хорошо видны даже мелкие колонии в начальной фазе роста.

Исследования проводили с использованием пробиотического препарата окарин (ИмБио, г.Нижний Новгород), представляющего собой лиофилизированную биомассу живых микробных культур - представителей нормальной микрофлоры кишечника здорового человека, включающих три штамма кишечных палочек и фекальный энтерококк.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Определение антагонистической активности окарина (ИмБио, Нижний Новгород) по отношению к M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal).

Ампулу с сухим пробиотиком вскрывали и регидратировали 0,9% раствором натрия хлорида с температурой 15-20°С из расчета 1 мл на одну дозу препарата. Продолжительность регидратации при интенсивном встряхивании составляла 2-5 минут. В стерильную пробирку с 3,0 мл расплавленной и охлажденной до 70°С средой, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл), инокулировали побиотик в количестве 20% от общего объема среды (0,6 мл), пробирку прогревали на кипящей водяной бане в течение 5 минут, после чего среду скашивали, а затем на поверхность косячка осуществляли посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном (37°С) и временном (30 дней) оптимуме. Контроль - косячок (3,0 мл) расплавленной и охлажденной до 70°С среды, содержащей 0,4 г L-аспарагина, 0,05 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,05 г сернокислого магния, 0,2 г лимонной кислоты, 0,005 г лимоннокислого аммиачного железа, 0,05 г пирувата натрия, 4,0 г глицерина, 3,0 г агара, 10,0 мл гумивита, 10,0 мл водного раствора желтка куриного яйца (1:1) и дистиллированную воду (до 100,0 мл) с добавлением казеинового бульона в количестве 20% от общего объема среды (0,6 мл). Количественную оценку проводили по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Оценка антагонистической активности окарина по отношению к патогенным микобактериям
Пробиотический препарат	Индекс блокирования роста*
M.avium ГИСК	M.tuberculosis Academia	M.bovis Vallee	M.bovis Ravenal
Окарин в количестве 20% от общего объема среды	9	7	8	9
Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Пример 2. Эффективность способа оценки антагонистической активности окарина (ИмБио, г.Нижний Новгород) по отношению к референс-штаммам M.tuberculosis (шт.Academia), M.avium (шт.ГИСК), M.bovis (шт.Vallee, Ravenal) в зависимости от количества пробиотика.

Схема оценки антагонистической активности как в примере 1. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Антагонистическая активность окарина по отношению к патогенным микобактериям
Количество пробиотика, % от общего объема среды	Индекс блокирования роста*
M.avium ГИСК	M.tuberculosis Academia	M.bovis Vallee	M.bovis Ravenal
4,0	2	1	1	1
8,0	3	2	2	2
16,0	9	7	8	9
32,0	9	8	8	9
Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Пример 3. Эффективность способа определения антагонистической активности окарина (ИмБио, Нижний Новгород) по отношению к клиническим штаммам M.bovis ( № 2 и 3) и M.avium ( № 4), выделенным из лимфатических узлов крупного рогатого скота, в зависимости от количества пробиотика. Схема определения антагонистической активности как в примере 1. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Антагонистическая активность окарина по отношению к патогенным микобактериям
Количество пробиотика, % от общего объема среды	Индекс блокирования роста*
M.avium № 4	M.bovis
№ 2	№ 3
4,0	3	2	2
8,0	5	2	2
16,0	9	7	7
32,0	9	8	7
Примечание: отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением с добавлением казеинового бульона (контроль), к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде в соответствии с изобретением после внесения в нее пробиотика с последующим прогреванием (опыт).

Проведенные исследования подтвердили возможность оценки антагонистической активности пробиотиков на основе лиофилизированной биомассы аэробных бактерий способом в соответствии с изобретением. Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимости показателей антагонистической активности пробиотиков по отношению к референс-штаммам и клиническим изолятам, полученным от крупного рогатого скота с подтвержденным диагнозом на туберкулез. Применение способа предполагает наличие параметров величины индекса блокирования роста и концентрации исследуемого материала для каждого препарата. Способ прост в осуществлении и может быть использован в качестве основного или дополнительного теста при определении антагонистической активности пробиотиков на основе бактерий и их метаболитов.

Источники информации

1. Бифидобактерин сухой. ФС 42-3947.12.07.2000

2. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. проф. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.341-343.

3. Гришин Г.И., Слинина К.Н. // Практик. - 2004. - № 3-4. - С.80-82.

4. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Марков С.Е., 1999. - 198 с.

5. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфам / Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.