Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани hep-2

Классы МПК:C07K14/59 гормон, стимулирующий фоликулы (ФСГ); хорионные гонадотропины, например ХСГ; гормон лютеинизации (ГЛ); гормон стимулирующий щитовидную железу (ГСТ)
A61K38/24 фолликулостимулирующий гормон (FSH); хорионные гонадотропины, например HCG, лютеинизированный гормон (LH); тироидостимулирующий гормон (TSH)
A61P35/00 Противоопухолевые средства
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кировская государственная медицинская академия (ГОУ ВПО Кировская ГМА) Росздрава (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2007-05-17
публикация патента:

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области клеточной биологии и экспериментальной онкологии, и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса. Хорионический гонадотропин человека (ХГч) используют для стимуляции патологических процессов и дезорганизации культуры клеток карциномы гортани Нер-2. Изобретение позволяет воздействовать на опухолевые линии типа Нер-2, исключая лимфоцитарное опосредование, а также воздействия гормона через специфические рецепторы и при этом получать признаки дегенерации опухоли в условиях культуры клеток. 2 ил., 2 табл.

Рисунки к патенту РФ 2349600

способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600

Изобретение относится к клеточной биологии и экспериментальной онкологии и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса как in vitro, так и in vivo.

Хорионический гонадотропин человека (ХГч), как признают многие исследователи [4], обусловливает нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в период эмбриогенеза. В связи с этим было предложено стимулировать эти процессы во многих патологически измененных органах. Так, до сих пор гормон с успехом применяли при лечении фиброзов и циррозов, при этом возрастала митотическая активность гепатоцитов и происходила резорбция соединительной ткани. Считается, что митотический сигнал в данном случае опосредован лимфоцитами. Достоверно известно, что ХГч способен подавлять стимулированную митогеном реакцию бласттрансформации лимфоцитов [5]. Кроме того, гормон способен вызывать миграцию полипотентных стволовых клеток костного мозга в центральные органы иммуногенеза и Т- и В-лимфоцитов в кровоток, но тормозить при этом антителообразование [4]. Замечено, что ХГч обнаруживается не только в сыворотке крови больных с хорионэпителиомой и пузырным заносом, но и с другими опухолями не трофобластического происхождения.

Установлено, что на клетках гемопоэтического ряда (в том числе и при гемобластозах) имеются специфические рецепторы к ХГч [1,5]. После воздействия гормона на такие опухоли последние подвергаются регрессу. Аналогичным ХГч действием обладает и синтетический полипептидный фрагмент способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 -субъединицы хорионического гонадотропина, состоящий из 18 аминокислотных остатков. В связи с этим рядом авторов было предложено использовать гормон для влияния на лейкозы и саркому Капоши. В отличие от цитостатиков, которые обладают первично повреждающим действием на геном не только опухолевых клеток, но и нормальных, ХГч действует на геном опухолевых клеток только опосредованно, подавляя пролиферацию и дифференцировку этих клеток, тем самым приводит к дезорганизации и дегенерации карциномы.

Культура Нер-2 не является лимфоцитарной, к тому же нет никаких указаний на то, что у карциномы гортани и сходных с ней унифицированных раков длительных сроков культивирования могут быть специфические рецепторы к ХГч. Однако замечено, что даже у опухолей, изначально чувствительных к гормональным воздействиям по неизвестным причинам через несколько пассажей, последняя может резко снижаться. Так, спонтанный рак молочной железы крыс РМК-1, бывший в первых генерациях очень чувствительным к синестролу (95% торможения роста), овариэктомии (60% торможения) и тиофосфамиду (98% торможения), к 10-й генерации полностью утерял эти свойства (13% торможения роста при лечении синестролом и стимуляция роста под влиянием овариэктомии) [6]. Также в условиях монослойной культуры клетки простаты утрачивали способность реагировать на тестостерон. Более того, в культуре клеточные линии могут резко понижать степень дифференцировки. Есть данные о том, что лейкозы в культуре спонтанно приобретали фибробластоподобные черты, причем такое превращение сопровождалось значительным обеднением ультраструктуры клеток: уменьшалось число митохондрий, свободных рибосом, в таких клетках были гораздо слабее выражены гранулярный ретикулум и аппарат Гольджи. И тем не менее, при заражении животных такие клетки давали опухолевый процесс. Некоторые авторы называют эти процессы унификацией. Можно предположить, что Нер-2 в этом отношении является той культурой, которая через 60 лет от начала культивирования сохранила наименее специфические механизмы рецепции митотического сигнала. А это значит, что механизм рецепции митотического сигнала и подавление митотической активности у унифицированных опухолей, таких как Нер-2, будет являться наиболее общим, в связи с чем можно экстраполировать его и на другие раки. К тому же, в условиях культуры клеток исключается воздействие данного гормона на опухоль со стороны иммунологически активных лимфоцитов, что показано в экспериментах И.М. Солопаевой на лимфосаркоме Плисса in vivo [8]. До настоящего времени действие препарата ХГч на культуру Нер-2 неизвестно.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала препаратов, способных подавлять пролиферативную активность и вызывать дезорганизацию и патологические изменения в опухолях типа Нер-2.

Эксперименты выполнены на культуре карциномы гортани Нер-2. Культивирование велось по общепринятым методам работы с монослойными культурами. Клетки поддерживались на пластиковых флаконах 25 см 2, 50 мл («Orange Scientific», Бельгия) в смеси из 95% питательной среды Игла MEM и 5% сыворотки эмбрионов коровы производства ООО «Биолот». В культуры добавляли пенициллин в дозе 50 ЕД/мл и стрептомицин в дозе 100 мкг/мл. Для контроля чистоты работ проводили периодические пассажи без антибиотиков. Все манипуляции с культурой и средами выполняли в строго стерильных условиях в операционной под защитой ламинарбокса с горизонтальным потоком воздуха; пересевы выполняли в утренние часы. Для посева новой генерации монослой обрабатывали версеном по щадящему методу, клетки легким встряхиванием переводили во взвесь в небольшое мерное количество свежей теплой (37°C) среды. После подсчета в камере Горяева суспензию разводили до концентрации 50000 клеток в миллилитре, и после добавления определенного количества сыворотки и антибиотиков засевали в новые флаконы, а для цитологического исследования - на половинки покровных стекол, помещенные в пенициллиновые флаконы. Для этого в каждый флакон с помещенной в него половинкой покровного стекла вносили 1 мл клеточной взвеси. В этот же момент ампулу с ХГч разводили оффицинальным физиологическим раствором. В опытные флаконы микропипеткой вносили 50 мкл гормона (50 МЕ/мл смеси), а в контрольные флаконы вносили такое же количество физиологического раствора, но без гормона.

Для цитологического исследования ровно через 24 и 48 часов контрольные и опытные препараты фиксировали в жидкости Карнуа 10 минут, а затем окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином с последующим заключением в глицерин-желатиновую смесь. Для достоверности изучались препараты из разных серий поставленного эксперимента. При этом участки монослоя изучались при помощи светового микроскопа «Микмед-2» (увеличение 15×40). Не мене чем на 6000 клеток подсчитывали число митозов с обязательным выделением патологических форм, а также количество поликариоциотов. Отмечались изменения клеточного пласта, формы клеток. В случае необходимости участок рассматривали более детально под увеличением 15×100 с использованием масляной иммерсии.

Примеры.

Пример 1.

20 октября 2006 года был произведен очередной пересев культуры на покровные стекла. Через 24 часа стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследовано 6280 клеток, причем митотически делящихся всего 160 (25,47способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 ), из них патологических форм 31 (4,9способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 ). Количество поликариоцитов составило 106 (16,87способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 ). Доля патологических митозов в препарате - 19,37%.

Пример 2.

15 октября 2006 г.был произведен пересев культуры на покровные стекла. В ряд тест-флаконов внесено по 50 ME гормона. Через 48 часов стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследована 6351 клетка, причем митотически делящихся было 253 (39,8способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 ), из них патологических форм 86 (13,5способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 ). Количество поликариоцитов составило 162 (25,5способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 ). Доля патологических митозов в препарате - 33,99%.

Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблиц, митотическая активность контрольных культур (фиг.1) с течением времени возрастает от 27,29±1,36способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 до 45,55±1,34способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 . Число патологических митозов в них также держится в пределах среднестатистической для этой культуры нормы [2]. Такой показатель, как симпластообразование, для оценки жизнеспособности опухолевой культуры в литературе встречается редко. Похожие данные отмечены для цитопатического действия различных штаммов вируса полиомиелита [2]. Наличие таких постклеточных структур, существенно отличных по морфологии от исходной линии, в данном случае можно считать признаками дезорганизации клеточной культуры.

Культуры после воздействия хорионического гонадотропина имеют характерный вид: помимо возрастания количества поликариоцитов (фиг.2), которые ряд авторов расценивают как одну из патологических форм клеточного деления [2], изменения митотического индекса, распадаются клеточные комплексы - «островки роста», что является похожим на слабые радиационные поражения [3]. Клетки округляются, но одновременно с этим у них появляются тонкие псевдоподии. Это бывает, когда клетка совершает перемещение по поверхности.

Таблица 1

Показатели митотической активности клеток культуры через 24 часа после введения хорионического гонадотропина человека
Показатели Контроль, М±m Опыт, М±mПроцент отличий Достоверность
Митотический индекс27,29±1,36способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 24,67±1,83способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 9,6 >0,05
Нормальные митозы 20,65±0,58способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 16,1±0,93способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 22,0 способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 0,003
Патологические митозы 6,54±1,02способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 8,55±2,363способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 23,5 >0,05
Процент патологических митозов23,6±5,317% 34,27±4,509%45,2 <0,01
Поликариоциты 16,2±0,315способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 26,53±1,69способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 63,8 <0,001
Таблица 2

Показатели митотической активности клеток культуры через 48 часов после введения хорионического гонадотропина человека
Показатели Контроль, М±mОпыт, М±m Процент отличийДостоверность
Митотический индекс 45,55±1,34способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 37,72±1,08способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 17,2<0,01
Нормальные митозы 35,91±1,12способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 24,55±1,0способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 31,6<0,01
Патологические митозы 9,63±0,36способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 13,17±0,82способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 36,7<0,05
Процент патологических митозов 21.01±0,84% 34,92±1,93%65,9 <0,05
Поликариоциты 14,19±1,61способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 25,4±1,88способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 79,0<0,01

Наряду с этим возрастает доля патологических митозов на 45 - 65% от исходного уровня. Митотический индекс при этом снижается в рамках от 9% до 17%.

Причины таких изменений еще не до конца определены. Будучи гормоном, определяющим нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в эмбриогенезе, ХГч ответственен за эти же процессы и во взрослом организме. Отсутствие у клеточной культуры Нер-2 специфических рецепторов, характерных только для гонадотропинов, еще не является преградой для проявления таких эффектов. Так, по данным Peter Petrusz, Madhabananda et al., [7], при помощи авторадиографических и гистохимических методов ХГч удалось обнаружить «...в желтом теле яичников, в интерстициальных клетках, в некоторых развивающихся фолликулах, а также в стенке (преимущественно в гладкомышечных клетках) мелких артериол стромы яичников...». Кроме того, по данным этих же авторов, гормон способен проникать через клеточную стенку не только в цитоплазму, но и в ядро.

Следовательно, помимо доказанного ранее лимфоцитарно-опосредованного действия на опухоль гормон способен оказывать действие на процессы экспрессии некоторых генов, определяющих в том числе дифференцировку и пролиферацию клеток. Такое воздействие возможно через активацию системы антионкогенов, которые способны привести клетку к апоптозу или же затормозить митотический процесс через его нарушение, создав различные летальные формы клеточного деления, что и показано в данном техническом решении.

Литература

1. Биологическое действие хорионического гонадотропина и его синтетического пептидного фрагмента на клеточную линию HL-60./ Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Макаров Е.В., Сухих Г.Т. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.

2. Блюмкин В.Н., Жданов В.М. Влияние вирусов на хромосомный аппарат и деление клеток. М.: Медицина, 1973 - 266 с.

3. Влияние способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в   культуре клеток карциномы гортани hep-2, патент № 2349600 -облучения в различных режимах на образование клеточных комплексов в популяции клеток культуры HeLa. / Г.А. Бажутова, Г.С. Календо, А. С. Ягубов и др. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.

4. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. - Н.Новгород: Изд.-во ННГУ, 2000. - 191 с.

5. Синтетический пептид - фрагмент бета-субъединицы хорионического гонадотропина угнетает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов человека in vitro. / Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Сухих Г.Т., Макаров Е.В. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №3.

6. Химиотерапия злокачественных опухолей. А.К.Белоусова, Н.Н.Блохин, В.И.Борисов и др. / Под ред. Н.Н.Блохина. М.:Медицина, 1977, с.320, ил.

7. Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: междисциплинарный подход: Пер. с англ./ Под ред. Р.У. Штрауба, Л. Болисс.- М.: Медицина, 1983, - 368 с., ил.

8. Солопаева И.М. (RU); Новиков В.В. (RU); Иванова Н.Л. (RU); Аксенова Т.В. (RU) Средство для торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани Нер-2, предусматривающий использование хорионического гонадотропина человека.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2349600

patent-2349600.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C07K14/59 гормон, стимулирующий фоликулы (ФСГ); хорионные гонадотропины, например ХСГ; гормон лютеинизации (ГЛ); гормон стимулирующий щитовидную железу (ГСТ)

Патенты РФ в классе C07K14/59:
конъюгаты дисоразолов, фармацевтическая композиция на их основе, названные конъюгаты для изготовления лекарственного средства, набор и способ их получения -  патент 2473562 (27.01.2013)
гонадотропный гормон, полученный из беспозвоночных, и его синтез -  патент 2349601 (20.03.2009)
промежуточные соединения для синтеза антагониста рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (lhrh), способ их получения и способ получения антагониста lhrh -  патент 2307125 (27.09.2007)
фармацевтический компонент на основе паратиреоидного гормона человека и содержащая его фармацевтическая композиция для интраназального применения -  патент 2292219 (27.01.2007)
одноцепочечный белок, модулятор гормонов лютеинизирующего, фолликулостимулирующего, тиреостимулирующего и хорионического гонадотропина (варианты), молекула нуклеиновой кислоты (варианты), вектор (варианты), линия трансформированных клеток сно (варианты), способ продуцирования одноцепочечного белка (варианты) -  патент 2213099 (27.09.2003)
антагонист лг-рилизинг-фактора (lhrh), комплекс, способ химической кастрации и/или лечения гонадотропинзависимых расстройств -  патент 2130464 (20.05.1999)
производные декапептидов и содержащая их фармацевтическая композиция -  патент 2124023 (27.12.1998)
очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции -  патент 2105012 (20.02.1998)
производные пептидов и композиция, вызывающая иммунный ответ на lhrh -  патент 2078770 (10.05.1997)

Класс A61K38/24 фолликулостимулирующий гормон (FSH); хорионные гонадотропины, например HCG, лютеинизированный гормон (LH); тироидостимулирующий гормон (TSH)

Патенты РФ в классе A61K38/24:
способ профилактики внутриутробного инфицирования плода -  патент 2504364 (20.01.2014)
способ комплексного лечения нормогонадотропного бесплодия у мужчин -  патент 2480256 (27.04.2013)
конъюгаты дисоразолов, фармацевтическая композиция на их основе, названные конъюгаты для изготовления лекарственного средства, набор и способ их получения -  патент 2473562 (27.01.2013)
способ лечения доброкачественных гиперпластических процессов репродуктивной системы женщин -  патент 2471485 (10.01.2013)
способ проведения суперовуляции у коров-доноров эмбрионов -  патент 2469738 (20.12.2012)
способ лечения инфертильности при варикоцеле -  патент 2419453 (27.05.2011)
водные композиции чфсг -  патент 2407514 (27.12.2010)
способ экстракорпорального оплодотворения -  патент 2398537 (10.09.2010)
применение lh для лечения отсутствия либидо и достижения оргазма у женщин -  патент 2351358 (10.04.2009)
способ улучшения маточного кровотока и состояния эндометрия у женщин с ранее безуспешными исходами программы экстракорпорального оплодотворения -  патент 2337726 (10.11.2008)

Класс A61P35/00 Противоопухолевые средства

Патенты РФ в классе A61P35/00:
способ лечения рака толстой кишки -  патент 2529831 (27.09.2014)
способ оценки эффекта электромагнитных волн миллиметрового диапазона (квч) в эксперименте -  патент 2529694 (27.09.2014)
новые (поли)аминоалкиламиноалкиламидные, алкил-мочевинные или алкил-сульфонамидные производные эпиподофиллотоксина, способ их получения и их применение в терапии в качестве противораковых средств -  патент 2529676 (27.09.2014)
производные 1, 2-дигидроциклобутендиона в качестве ингибиторов фосфорибозилтрансферазы никотинамида -  патент 2529468 (27.09.2014)
фармацевтическое средство, содержащее эпитопные пептиды hig2 и urlc10, для лечения рака, способы и средства для индукции антигенпрезентирующей клетки и цитотоксического т-лимфоцита (цтл), антигенпрезентирующая клетка и цтл, полученные таким способом, способ и средство индукции иммунного противоопухолевого ответа -  патент 2529373 (27.09.2014)
модульный молекулярный конъюгат для направленной доставки генетических конструкций и способ его получения -  патент 2529034 (27.09.2014)
модулирующие jak киназу хиназолиновые производные и способы их применения -  патент 2529019 (27.09.2014)
лечение опухолей с помощью антитела к vegf -  патент 2528884 (20.09.2014)
способ лечения местнораспространенного неоперабельного рака поджелудочной железы -  патент 2528881 (20.09.2014)
новые бензолсульфонамидные соединения, способ их получения и применение в терапии и косметике -  патент 2528826 (20.09.2014)

Наверх