вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней

Формула изобретения

Вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Вирусный материал из штамма
Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5	10,33-11,74
Сахароза	4,31-4,80
Пептон ферментативный	3,13-3,69
Казеин	0,78-1,11
Тиомочевина	0,04-0,70
Аэросил AM-1-300	1,00-2,00
Смола КБ-4П-2	Остальное

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии вирусных вакцинных ветеринарных препаратов, в частности к вакцине «ОРОВАК-ТГЭ» против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, предназначенной для пероральной иммунизации супоросных свиноматок, поросят и хряков ремонтной и основной групп.

Известна вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 (SU 734279, 21.12.1978).

Недостатком данной вакцины является значительная потеря ее антигенной и иммуногенной активности при производстве и последующем хранении, из-за низкой устойчивости вакцинного вируса к сублимационному высушиванию и, как следствие, к снижению ее эффективности.

Целью изобретения является повышение эффективности вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Указанная цель достигается тем, что она дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

вирусный материал из штамма
Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5	10,33-11,74
сахароза	4,31-4,80
пептон ферментативный	3,13-3,69
казеин	0,78-1,11
тиомочевина	0,04-0,70
аэросил АМ-1-300	1,00-2,00
смола КБ-4П-2	остальное.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Для получения вирусного материала из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 используют культуру СПЭВ, выращенную в роллерных условиях с образованием монослоя через 20-48 часов. Ростовую среду заменяют поддерживающей средой того же состава, но без сыворотки, с добавлением вируса. Множественность заражения составляет 1-10 ТЦД ₅₀ на 1 клетку. Инфицированную культуру инкубируют в роллерных условиях в течение 16-30 часов. Вирусный материал хранят при минус 20°С.

Перед приготовлением вакцины "ОРОВАК-ТГЭ" компоненты вакцины: сахарозу, пептон ферментативный, казеин и тиомочевину (каждый компонент в отдельности) подвергают тепловой обработке, при температуре 90°С, а смолу КБ-4П-2 в смеси с гидрофобным аэросилом при температуре 102±2°С в течение 4 часов, с последующим их охлаждением до температуры 4±2°С. В аппарат типа РТ-1 последовательно загружают вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 в объеме 14-15 л; сахарозу в количестве 5,5-6,5 кг; пептон ферментативный в количестве 4-5 кг; казеин в количестве 1-1,5 кг и 0,05-0,1 кг тиомочевины. Смешение - растворение компонентов в аппарате проводят при 8000 об/мин в течение 2 минут.Полученную суспензию вакцинного полуфабриката переносят в барабан шаровой мельницы, в котором осуществляют его смешивание и обезвоживание, в соотношении 1:4, с ионнообменной смолой КБ-4П-2 с нанесенным на поверхность ее частиц гидрофобного аэросила АМ-1-300, взятого по массе в количестве 1,25-2,50%. Скорость вращения барабана 60-90 об/мин.

Получают 3 состава предложенной вакцины, приведенной в таблице 1. Готовый вакцинный продукт «ОРОВАК-ТГЭ» представляет собой сыпучий порошок серо-желтого цвета. Биологическая активность препарата не ниже 6,0 lg ТЦД₅₀/г^-1. Массовая доля влаги в пределах 10-14%.

Вакцину расфасовывают по 100-200 г в стерильные флаконы или двойные полиэтиленовые пакеты. Флаконы укупоривают стерильными резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а пакеты герметично запаивают.

Срок годности вакцины - 6 месяцев при условии хранения в темном помещении при температуре 2-10°С.

Пример 2.

Изучают биологическую активность 3-х образцов вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», приготовленных по примеру 1 и хранившихся в течение 12 месяцев при температуре минус 8-12°С; 2-10°С; 18-20°С. Количественную оценку вирусной активности определяют путем титрования по ЦПЭ в клеточной линии СПЭВ. Клеточную суспензию в концентрации 4·10⁵ клеток в см³ наносят на 96-луночные плашки по 0,01 см³ в каждую лунку. Инкубирование проводят в СО₂ инкубаторе. Монослой формируется на вторые сутки. В опытах используют плашки со сплошным монослоем. Готовят 10-кратные разведения вируса с 10^-1 до 10^-8. На каждое разведение используют по 4 лунки, вирус вносят по 0,05 см³. Зараженную куль-туру инкубируют 5-7 дней. Титр вируса выражают в ТЦД₅₀/см ³. Результаты по изучению устойчивости вирусвакцины «ОРОВАК-ТГЭ» в зависимости от условий хранения представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует, что наилучшие условия сохранности биологическоской активности вакцины обеспечивает температурный режим минус 8-12°С, при этом за 12 месяцев хранения активность снижается в среднем на 0,8 lg ТЦД₅₀. Температура 2-10°С обеспечивает сохранность активности на высоком уровне только в течение 6 месяцев, а температура 18-20°С вызывает значительную инактивацию вируса.

Пример 3.

Исследуют безвредность 3 образцов вакцины "ОРОВАК-ТГЭ", приготовленных по примеру 1 из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5. Для контроля используют 6 подсвинков, серонегативных к вирусу ТГЭ свиней (по 2 на каждый образец). Навески вакцины массой 1 г суспендируют в 10 см³ стерильного физиологического раствора. Приготовленную суспензию вводят животным в объеме 5 см ³ в область шеи или бедра.

Контрольное наблюдение за животными ведут в течение 10 суток с ежедневным измерением температуры тела. Все животные остались живы. Клиническое состояние подопытных животных не отличалось от нормы и от группы контроля.

Таким образом, исследуемые образцы вакцины безвредны.

Пример 4.

Изучают антигенную активность 2-го опытного образца вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», приготовленного по примеру 1 и хранившегося в течение 6 месяцев при температуре 2-10°С. Сухую вакцину смешивают с небольшим количеством (100-200 г) сухого корма, который раскладывают равномерным слоем в кормушки для скармливания животным перед утренним кормлением. Супоросным свиноматкам дозу вакцины скармливают за 10-14 дней до опороса по 10 г препарата на голову. Поросятам дозу вакцины (5 г) скармливают через 10-14 суток после отъема.

Об антигенной активности судят по образованию вируснейтрализующих антител к вирусу ТГЭ у иммунизированных свиноматок на 7, 14, и 21 день после вакцинации; у иммунизированных поросят на 35 день после применения вакцины. Определение титра антител проводят в реакции нейтрализации против вируса ТГЭ, штамм «ВГНКИ-5», в разведении, соответствующему 100 ТЦД₅₀/0,1 см³. Реакцию ставят стандартным методом, используя культуру клеток СПЭВ. Результат учитывают через 5 дней после постановки реакции. За титр нейтрализующих антител принимают наивысшее разведение сыворотки, которое полностью ингибирует цитопатический эффект вируса ТГЭ.

Свиней считают серонегативными к вирусу ТГЭ, если их сыворотка крови в разведении 1:2 не обладала вируснейтрализующей активностью. До вакцинации в сыворотке крови подопытных животных специфические вируснейтрализующие антитела к вирусу ТГЭ отсутствовали.

Динамика антител у животных, вакцинированных вторым опытным образцом «ОРОВАК-ТГЭ», представлена в таблице 3.

Как видно из результатов таблицы 3, иммунизация вторым опытным образцом вакцины индуцирует образование вируснейтрализующих специфических антител у свиноматок на 7 день исследования, а у поросят на 35 день в титрах 1:128-256.

Таким образом, антигенный компонент является активным и вакцина пригодна для применения.

Пример 5.

Испытывают иммуногенную активность 2-го опытного образца вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», хранившегося в течение 6 месяцев при температуре 2-10°С, приготовленного по примеру 1. Сухую вакцину с биологической активностью 6,25 lg ТЦД ₅₀/г^-1 смешивают с небольшим количеством (100-200 г) сухого корма. Полученную смесь равномерным слоем расклавают в кормушки для скармливания 4 супоросным свиноматкам. Вакцину скармливают животным перед утренним кормлением в дозе 10 г на голову, в течение 3-х дней подряд, за 10-14 дней до опороса. У всех свиноматок, получивших вакцину «ОРОВАК-ТГЭ» в течение всей продолжительности опыта изменений клинических признаков не отмечено. На 10-14 день поросят отнимают от свиноматок и формируют в 4 опытные группы.

Вакцину скармливают всем поросятам также перед утренним кормлением в дозе 5 г на голову. В качестве контроля используют поросят от не вакцинированных свиноматок, которым вакцину не скармливают.

Эффективность иммунизации поросят контролируют через 21 день по титрам антител, выявленным в реакции нейтрализации и по результатам контрольного заражения привитых поросят культурой вирулентного штамма «Мюллер» вируса ТГЭ в дозе 1000 ЛД₅₀/0,2 см ³. У 12 опытных поросят после заражения отмечали слабость, лихорадку (40,5-41,5°С), 5 из которых на 4-5 сутки после появления сильной диареи погибли.

Результаты по иммунизации поросят 2 опытным образцом вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» представлены в таблицах 4 и 5.

Данные таблиц 4 и 5 говорят о том, что опытный образец вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» №2 индуцирует у всех опытных поросят выработку специфических антител в титрах 1: 32-256, тем самым обеспечивая их надежную защиту от контрольного заражения, в среднем на 84,8%. У поросят из группы контроля на вторые сутки после заражения отмечают отсутствие аппетита, жажду, слабость, лихорадку, сильную диарею - желтоватые пенистые фекалии. На 3 день после наступления комы все поросята погибли.

Вакцина «ОРОВАК-ТГЭ», изготовленная по технологии контактного обезвоживания, для перорального применения безвредна для свиноматок и поросят, не вызывает поствакцинальных реакций; высокоиммуногенна (защита от вируса ТГЭ на 75-100%) и экологически безопасна для обслуживающего персонала.

Использование вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» для иммунизации животных позволит сократить затраты и повысить эффективность мероприятий по борьбе с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней.

Таблица 1
Компоненты:				Содержание компонентов, мас.%:
				Состав 1		Состав 2			Состав 3
Вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5				10,33		11,016			11,74
Сахароза				4,80		4,558			4,31
Пептон ферментативный				3,69		3,419			3,13
Казеин				1,11		0,950			0,78
Тиомочевина				0,70		0,057			0,04
Аэросил AM-1-300				2,00		1,500			1,00
Смола КБ-4П-2				Остальное		Остальное			Остальное
Таблица 2
Вакцина «ОРОВАК-ТГЭ»	Биологическая активность, lg ТЦД50/г-1
	Вакцина после приготовления	Хранение при t (°С) в течение (мес.)
		6					12
		минус 8-12	2-10		18-20		минус 8-12	2-10		18-20
Опытный образец №1	6,7	6,5	6,10		5,0		5,9	4,0		3,8
Опытный Образец №2	6,6	6,6	6,25		4,8		5,8	4,2		4,1
Опытный Образец №3	6,5	6,4	6,10		4,7		5,7	4,2		4,0

Таблица 3
Вид		Сроки исследований, дни
Животных		До вакцинации		7		14	21		35
Свиноматки
№1		0		1:8		1:64	1:256		-
№2		0		1:8		1:64	1:256		-
Поросята
№1		0		-		-	-		1:256
№2		0		-		-	-		1:128
№3		0		-		-	-		1:128
№4		0		-		-	-		1:256
№5		0		-		-	-		1:256
№6		0		-		-	-		1:128
Таблица 4
	Титр вируснейтрализующих специфических антител в сыворотках крови опытных поросят
№	Группа №1		Группа №2		Группа №3			Группа 4
1	1:256		1:256		1:256			1:256
2	1:64		1:128		1:128			1:64
3	1:128		1:128		1:128			1:64
4	1:128		1:128		1:256			1:256
5	1:128		1:128		1:128			1:128
6	1:64		1:64		1:64			16128
7	1:128		1:64		1:128			1:128
8	1:64		1:128		1:64			-
9	-		-		1:128			-
10	-		-		1:32			-

Таблица 5
№ группы	Кол-во поросят в группе	Средний геометрический титр поствакцинальных антител	Результаты контрольного заражения
			Выжило	Клинически переболело	Из них пало	% выживших
1	8	100	6	3	2	75
2	8	230	7	3	1	87,5
3	10	110,2	8	4	2	80
4	7	126,5	7	2	0	100
Всего	33		28	12	5	84,8
Контроль	10	0	0	10	10	0