способ увеличения резерва стволовых клеток в организме

Формула изобретения

Способ увеличения резерва стволовых клеток в организме, характеризующийся введением препарата, в качестве которого используют гиалуронидазу, которую вводят внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям, и касается способа увеличения резерва стволовых клеток в организме.

Известны способы увеличения содержания в организме коммитированных клеток-предшественников гемопоэза с помощью факторов роста: эритропоэтина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гранулоцитомакрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), интерлейкина-3 (ИЛ-3). Наиболее широким спектром действия и наиболее выраженным влиянием обладают раннедействующие факторы роста - ГМ-КСФ и ИЛ-3 [1, 2, 3]. В то же время их стимулирующее влияние ограничено гемопоэтическими предшественниками и не затрагивает популяцию истинных (мезенхимальных) стволовых клеток (СК), способных давать начало большинству известных клеточных типов (элементы соединительной, мышечной, нервной ткани, печени и др.) и являющихся «глубоким» резервом регенерации [4, 5]. В свете вышеизложенного чрезвычайно важное значение приобретает проблема создания способов увеличения в организме резерва истинных (мезенхимальных) стволовых клеток.

Предлагаемый способ увеличения резерва стволовых клеток в организме адекватного прототипа по широте воздействия на разные классы СК и терапевтической (фармакодинамической) сущности среди существующих способов не имеет.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание эффективного способа увеличения резерва стволовых клеток в организме.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ увеличения резерва стволовых клеток в организме, заключающийся во внутрибрюшинном введении лабораторным животным (мыши) препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гиалуронидазы, вводимого внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней.

На сегодняшний день известна важная роль гиалуроновой кислоты (ГК) в регуляции функцонального состояния клеточных элементов (на примере фибробластов, макрофагов) [6, 7]. ГК является наиболее распространенным гликозаминогликаном (ГАГ), участвующим в образовании межклеточного матрикса различных тканей, в том числе и костного мозга, в котором она составляет около 40% от всех ГАГ [7]. При этом стволовые клетки и клетки-предшественники различных классов in situ связаны с гиалуронатом через CD44 и RHAMM-рецепторы [7, 8]. Вместе с тем известен фермент-гиалуронидаза, введение которого приводит к гидролитическому расщеплению ГК и образованию в организме ее полимеров с различной длиной полисахаридной цепи. При этом известно, что низко- и среднемолекулярные формы ГК стимулируют ангиогенез, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток. В то время как молекулы ГК с высокой молекулярной массой, напротив, тормозят сосудообразование, ингибируют деление клеток и снижают их способность к миграции [6]. Тем не менее, роль гиалуронидазы в регуляции функций стволовых клеток до сих пор во многом остается не известна, так же как не известна и принципиальная возможность увеличения резерва стволовых клеток в организме путем введения гиалуронидазы извне.

Факт применения гиалуронидазы с достижением нового технического результата: создание эффективного способа увеличения резерва стволовых клеток в организме за счет изменения свойств межклеточного матрикса для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют создать эффективный способ увеличения резерва стволовых клеток в организме. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному интактному животному (мыши) 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводят гиалуронидазу в дозе 1000 УЕ/кг.

Заявляемая доза и режим введения гиалуронидазы подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения отменяют получение заявленного технического результата. Снижение дозы и/или однократное введение препарата значительно снижают эффективность способа.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 98 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

На 3, 5, 8-е сутки с помощью метода лимитирующих разведений определяли количество мезенхимальных (истинных) стволовых клеток (МСК) [9], а также методом клонирования в полувязкой среде изучали содержание гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) - гранулоцитарно-эритро-макрофагально-мегакариоцитарных единиц (КОЕ-ГЭММ) [10], коммитированных мезенхимальных, эритроидных и грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге [11], представляющим собой по современным представлениям депо СК [4, 5].

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Частоту встречаемости МСК в костном мозге и периферической крови определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивалось посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок _i распределялась как _i=exp(-fx_i), где f - частота встречаемости МСК, xi - количество клеток, высаженных в лунку [9, 12]. Использовалась программа Statistica 6.0.

Пример 1

Гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенную в 0,3 мл физиологического раствора, вводили интактным животным внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней в дозе 1000 УЕ/кг (УЕ - условные еденицы). Контрольным мышам в эквивалентном объеме внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.

Введение интактным животным гиалуронидазы приводило к существенному возрастанию содержания всех исследуемых прогениторных элементов в костном мозге.

Так, количество МСК было повышенным на протяжении всего эксперимента и достигало максимальных значений на 5-е опыта (до 386,2% от контроля).

Динамика содержания КОЕ-ГЭММ в гемопоэтической ткани носила аналогичный характер. Имело место увеличение их числа на 3, 5, 8-е сут исследования, с максимумом на 8-е сутки (356,6% от фона).

Кроме того, расщепление ГК приводило к возрастанию числа комитированных кроветворных прекурсоров: КОЕ-Э (3, 5, 8-е сутки) и КОЕ-ГМ (3, 5, 8-е сутки) (с максимумом КОЕ-Э до 286,17% на 8-е и КОЕ-ГМ до 286,8% на 5-е сутки соответственно); а также мезенхимальных клеток-предшественников (фибробластных колониеобразующих едениц) в костном мозге на 3, 5-е сутки (табл.).

В целом, изменение свойств межклеточного матрикса с помощью гиалуронидазы приводило к выраженному возрастанию содержания стволовых клеток, причем в большей степени ранних родоначальных элементов - мезенхимальных и кроветворных стволовых клеток, в их депо - в костном мозге.

Предлагаемый способ позволяет значительно увеличить резерв стволовых клеток в организме путем введения гиалуронидазы.

Таблица Динамика содержания стволовых клеток и коммитированных клеток-предшественников гемопоэза в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при введении гиалуронидазы, (Х±m)
Сроки исследования (сутки)	МСК, на 106 миелокариоцитов	КОЕ-Ф, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК (КОЕ-ГЭММ), на 105 миелокариоцитов	КОЕ-Э, на 105 миелокариоцитов	КОЕ-ГМ, на 105 миелокариоцитов
фон	29,0±3,01	7,67±0,51	7,74±0,69	6,0±0,7	5,17±0,98
3-е	90,0±10*	13,67±1,03*	14,6±1,32*	12,33±0,61*	7,83±0,7*
5-е	112,0±12*	18,0±1,2*	16,5±0,74*	16,0±1,63*	14,83±1,19*
8-е	90,0±10*	6,17±0,57	27,6±1,58*	17,17±0,6*	11,17±0,87*
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при p<0,05

Источники информации

1. Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol.15. - P.825-827.

2. Platzer E. Human hemopoietic growth factors // Eur. J. Haematol. - 1989. - V.42. - N1. - P.1-15.

3. Натан Д.Г., Зифф К.А. Регуляция кроветворения // Гематол. и трансфузиол.. - 1994. - Т.39. - №2. - С.3-10.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.

6. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. - Vol.13. - №12. - P.105-115.

7. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. e.a. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34 ⁺ stem/progenitor cells to bone marrow // Blood. - 2004. - Vol.103. - №8. - P.2981-2989.

8. Nedvetzki S., Gonen E., Assayag N. e.a. RHAMM, a receptor for hyalu-ronan-mediated motility, compensates for CD44 in inflamed CD44-knockout mice: A different interpretation of redundancy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol.101. - №52. - P.18081-18086.

9. In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. e.a. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol.88. - P.845-852.

10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - 114 с.

11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

12. Bonnefoix Т., Bonnefoix P., Callanan M. e.a. Graphical representation of a generalized linear model-based statistical test estimating the fit of the single-hit poisson model to limiting dilution assays // J. Immunol. - 2001. - Vol.167. - P.5725-5730.