способ идентификации полиморфизма r287q в 8 экзоне гена цитозольной эпоксидгидролазы у человека

Формула изобретения

Способ идентификации полиморфизма R287Q в 8 экзоне гена цитозольной эпоксидгидролазы человека, включающий подготовку образца ДНК, амплификацию содержащего полиморфный сайт участка гена методом ПЦР со специально подобранными праймерами, анализ ПЦР-продукта и составление заключения на основании его результатов, отличающийся тем, что используют праймеры с SEQ ID NO: 1 (прямой праймер) и SEQ ID NO:2 (обратный праймер), где в 3'-конец обратного праймера путем замены одного нуклеотида введен сайт рестрикции для эндонуклеазы BamHI, ПЦР-продукт подвергают гидролизу эндонуклеазой BamHI и фракционируют в агарозном геле, при этом получение двух фрагментов размером 143 и 21 п.о. верифицируют как гомозиготный генотип дикого типа 287RR, трех фрагментов размером 164, 143 и 21 п.о. - как гетерозиготный генотип 287RQ, а одного фрагмента размером 164 п.о. - как гомозиготный мутантный генотип 287QQ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, а именно к ДНК-диагностике предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям у человека.

Изучение генетического полиморфизма гена нитозольной эпоксидгидролазы (soluble epoxide hydrolase, EPHX2} при сердечно-сосудистых заболеваниях является предметом интенсивных исследований в современной кардиологии (Fornage M., Boerwinkle E., Doris P.A., Jacobs D., Liu К., Wong N.D. Polymorphism of the soluble epoxide hydrolase is associated with coronary artery calcification in African-American subjects // Circulation. - 2004. - Vol.109. P.335-339; Lee C.R., North K.E., Bray M.S., Fornage M., Scubert J.M., Newman J.W., Hammock B.D., Couper D.J., Heiss G., Zeidin D.C. Genetic variation in soluble epoxide hydrolase (EPHX2) and risk of coronary heart disease: The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) study // Hum. Mol. Genet. - 2006. - Vol.15. - P. 1640-1649).

На сегодняшний день полностью расшифрована нуклеотидная последовательность гена EPHX2 (NCBI GeneID:2053; OMIM:132811), описана его структурная организация и выявлены многочисленные полиморфные участки гена - т.н. однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП). Однако наиболее привлекательными объектами для генетических исследований стали функционально значимые ОНП, расположенные в кодирующей части гена EPHX2 (Przybyla-Zawislak B.D., Srivastava P.К., Vázquez-Matias J., Mohrenweiser H.W., Maxwell J.E., Hammock B.D., Bradbury J.A., Enayetallah A.E., Zeidin D.C., Grant D.F. Polymorphisms in human soluble epoxide hydrolase // Mol. Pharmacol. - 2003. Vol.64. - P.482-490; Sato K., Emi M., Ezura Y., Fujita Y., Takada D., Ishigami Т., Umemura S., Xin Y., Wu L.L., Larrinaga-Shum S., Stephenson S.H., Hunt S.C., Hopkins P.N. Soluble epoxide hydrolase variant (Glu287Arg) modifies plasma total cholesterol and triglyceride phenotype in familial hypercholesterolemia: intrafamilial association study in an eight-generation hyperlipidemic kindred // J. Hum. Genet. - 2004. Vol.49. - P.29-34). К одному из таких функционально важных полиморфных сайтов цитозольной эпоксидгидролазы относится нуклеотидная замена G860A в 8 экзоне гена (референтная последовательность NCI dbSNP rs751141; Ensembl db 35239), сопровождающаяся аминокислотной заменой аргинина на глютамин в 287 положении полипептидной цепи фермента, приводящей к снижению его активности.

Анализ литературных данных показывает, что на сегодняшний день разработаны высокотехнологичные и высокопроизводительные методы идентификации R287Q полиморфизма кодирующей части 8 экзона гена ЕРНХ2: автоматического секвенирования (Sandberg M., Hassett С., Adman Е.Т., Meijer J., Omiecinski C.J. Identification and functional characterization of human soluble epoxide hydrolase genetic polymorphisms // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275. - P.28873-28881; Saito S., Iida A., Sekine A., Eguchi C" Miura Y., Nakamura Y. Seventy genetic variations in human microsomal and soluble epoxide hydrolase genes (EPHX1 and ЕРНХ2) in the Japanese population // J. Hum. Genet. - 2001. - Vol.46. - P.325-329; Przybyla-Zawislak B.D., Srivastava P.K., Vázqucz-Matias J., Mohrenweiser H.W., Maxwell J.E., Hammock B.D., Bradbury J.A., Enayetallah A.E., Zeidin D.C., Grant D.F. Polymorphisms in human soluble epoxide hydrolase // Mol. Pharmacol. - 2003. Vol.64. - P.482-490) и метод ДНК-чипов (Fornage M., Lee C.R., Doris P.A., Bray M.S., Heiss G., Zeidin D.C., Boerwinkle E. The soluble epoxide hydrolase geneharbors sequence variation associated with susceptibility to and protection from incident ischemic stroke // Hum. Mol. Genet. - 2005.- Vol.14. - P.2829-2837).

Наиболее близким к заявляемому способу идентификации R287Q полиморфизма гена ЕРНХ2 является метод аллельной дискриминации с помощью 5' нуклеазного анализа (TaqMan, Applied Biosystems) (Fornage M., Boerwinkle E., Doris P.A., Jacobs D., Liu K., Wong N.D. Polymorphism of the soluble epoxide hydrolase is associated with coronary artery calcification in African-American subjects // Circulation. - 2004. - Vol.109. - P.335-339), основанного на резонансном переносе энергии флуоресценции (Livak K.J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay // Genet. Anal. 1999. - Vol.14. - P.143-149). Принцип явления заключается в том, что если два флуорофора расположены в непосредственной близости друг от друга и спектр испускания первого совпадает со спектром поглощения второго (тушителя), то при возбуждении первого вместо флуоресценции будет происходить передача энергии на тушитель. При увеличении расстояния между флуорофором и тушителем флуоресценция восстанавливается. Резонансное тушение флуоресценции в TaqMan системе позволяет контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредственно в ходе реакции. Для детекции используется неспособный удлиняться зонд, несущий флуорофор, и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда Taq-полимераза разрушает его в ходе ПЦР реакции за счет экзонуклеазной активности, сопряженной с синтезом ДНК, флуоресцентная группа переходит в раствор и отдаляется от тушителя. Использование двух аллель-специфических зондов с различными флуоресцентными метками (в частности FAM-TAGGACCcGGTAACC и VIC-CTAGGACCtGGTAACC) позволяет дифференцировать гомо (287RR и 287QQ) и гетерозигот (287RQ) с помощью специального прибора ABI7900 (Applied Biosystems) и программного обеспечения детекции нуклеотидных последовательностей (Sequence Detection System Software).

Данный метод обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, но требует специального дорогостоящего оборудования и специфических реагентов, что делает фактически недоступным его использование в стандартных ПЦР-лабораториях России.

Способов идентификации ОНП R287Q гена ЕРНХ2 помощью полимеразной цепной реакции и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) в литературе не описано. Таким образом, существует потребность в создании быстрого, простого, недорогого, чувствительного и специфичного метода, который мог бы быть внедрен в стандартную клиническую лабораторию в качестве рутинного метода генотинирования полиморфизма R287Q гена ЕРНХ2. Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.

Задачей изобретения является уменьшение материальных затрат для проведения генотипирования однонуклеотидного полиморфизма R287Q гена ЕРНХ2 путем разработки метода его идентификации с помощью ПЦР-ПДРФ.

Изобретение поясняется двумя фигурами:

Па фиг.1 изображен фрагмент геномной ДНК (участок 7 интрона и 8 экзона) гена ЕРНХ2 (ориентация 5' 3'). Серым цветом выделены участки расположения подобранных нами праймеров. Значком обозначено место расщепления ДНК эндонуклеазой BamHI (сайт узнавания G GATCC). Неспаренный нуклеотид в 3'-конце антисмыслового праймера подчеркнут (нуклеотид G заменен на А).

На фиг.2 изображено электрофоретическое разделение продуктов ПЦР-рестрикции гена ЕРНХ2. Слева обозначены размеры (п.н.) фракционированных фрагментов ДНК. Сверху обозначены порядковые номера проанализированных образцов 24 человек. Образец 1 - маркер (нерестрицированный ампликон размером 164 п.н.), образцы 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22 и 24 (фрагмент 143 п.н., фрагмент 21 п.н. не визуализируются) - гомозиготные генотипы по аллелю дикого типа 287RR; образец 16 (один фрагмент размером 164 п.н.) - гомозиготный генотип по мутантному аллелю 287QQ; образцы 7, 8, 15, 20 и 23 (фрагменты 164 и 143 п.н., фрагмент 21 п.н. не визуализируются) - гетерозиготные генотипы 287RQ.

В основе предлагаемого способа генотипировапия лежит методология ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза, предложенная Eiken H.G. et al. (Eiken H.G., Odland E., Ramos C. et al. Application of natural and amplification created restriction sites for the diagnosis of PKU mutations // Nucleic Acids Res. - 1991. - Vol.19. - P.1427-1430).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

Сначала на основе нуклеотидной последовательности гена цитозольной эпоксидгидролазы с помощью программы "GeneFisher" 1.3 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de) была подобрана пара праймеров, фланкирующих интересуемую область 8 экзона ЕРНХ2, имеющая следующую структуру:

F: 5'-CTGTGGCTCTTGGTTTGATC-3' (SEQ ID NO 1)

R: 5'-TTCATGTCCATAGCTAGGATC-3' (SEQ ID NO 2) Амплифицируемый участок ДНК выбрали таким образом, чтобы 3'-конец антисмыслового праймера непосредственно примыкал к мутантному сайту (фиг.1). В антисмысловом праймере мы изменили предпоследний нуклеотид с С на Т (на фигуре 1 в антисмысловой цепи G на А соответственно комплементарности нуклеотидов) так, чтобы в сочетании с нуклеотидом мутантного сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для эндонуклеазы BamHI (сайт узнавания G GATCC). Таким образом, ПЦР продукты нормального и мутантного аллеля отличаются по наличию данного индуцированного сайта рестрикции.

При разработке способа генотипирования R287Q полиморфизма гена ЕРНХ2 использовали образцы геномной ДНК, выделенные из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т. и др., 1984). Праймеры были синтезированы в НПО "Литех" (г.Москва). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (ЗАО НПФ "ДНК-Технология", г.Москва). Параметры ПЦР были следующими: "горячий старт" в течение 4 мин при 95°С, затем 36 циклов амплификации в режиме 95°С - 30 сек; 55°С - 40 сек; 72°С - 30 сек, заключительный цикл элонгации ДНК - 3 мин при 72°С. Размер амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента гена ЕРНХ2 составил 164 пары нуклеотидов (п.н.). Нуклеотидную последовательность продукта амплификации гена ЕРНХ2 определяли на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer с использованием набора реактивов BigDye Termination Kit 1.1 ("Applied Biosystems", США).

При приготовлении растворов для проведения ПЦР использовали импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПЦР проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl рН=8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 1,6 mM MgCl₂, 1 мМ -меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) Taq-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали по 30 мкл минерального масла.

Контроль успешного проведения ПЦР осуществлялся с помощью электрофореза продуктов амплификации на 2% агарозном геле. Обнаружение R287Q полиморфизма гена ЕРНХ2 проводилось путем обработки ампликона 6U эндонуклеазы BamHI (ООО "Сибэнзим", г.Новосибирск) согласно протоколу, описанному производителем фермента. Рестрикционную смесь термостатировали в течение ночи при температуре 37°С.После инкубации фрагменты ДНК фракционировали с помощью электрофореза в 2,5% агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ буфера (0,089 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089 М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Фракционирование фрагментов ДНК проводили в камере для горизонтального электрофореза SE-2 (ООО "Хеликон", г.Москва) в течение 80 мин при напряжении 200 V. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага , гидролизированпую эндонуклеазой PstI. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью аналитического пакета Labworks.

Дня демонстрации эффективности разработанного способа идентификации полиморфизма R287Q гена ЕРНХ2 было проведено генотипирование у 23 добровольцев. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-рестрикции полиморфизма R287Q гена ЕРНХ2 представлены на фиг.2. При наличии аллеля дикого типа 287R существует сайт узнавания для эндонуклеазы BamHI, которая расщепляет ампликон размером 164 п.н. на два фрагмента 143 и 21 п.н. (фрагмент размером 21 п.н. не визуализируется). При наличии мутации (аллель 287Q ЕРНХ2) происходит потеря сайта узнавания для эндонуклеазы BamHI: G GATCC (287R) (AGATCC (287Q), в результате чего ампликон остается нерасщепленным данной рестриктазой и визуализируется в виде 1 фрагмента размером 164 п.н. У гетерозиготных носителей 287RQ ЕРНХ2 благодаря наличию обоих аллельных вариантов гена присутствуют все три фрагмента ДНК: 164, 143 и 21 п.н. (фиг.2). Как видно из фигуры 2, достаточно высокое качество визуализации фрагментов ДНК позволило эффективно провести детекцию трех вариантов генотипов полиморфизма Arg287Gln в гене ЕРНХ2 у всех 23 проанализированных образцов.

Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно идентифицировать полиморфизм R287Q в гене цитозольной эпоксидгидролазы с помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза и последующего рестрикционного анализа продуктов амплификации. В связи с низкой себестоимостью анализа, обусловленной низкой ценой на эндонуклеазу BamHI ООО "Сибэнзим", предлагаемый способ генотипирования может быть применен в любой ПЦР-лаборатории с минимальными материальными затратами.