способ ацилирования пептидов

Классы МПК:C07C235/72 с атомами углерода карбоксамидных групп, связанными с ациклическими атомами углерода
C07K1/06 с использованием защитных групп или активирующих агентов
C07K14/605 глюкагоны
C07K14/62 инсулины
Автор(ы):, ,
Патентообладатель(и):НОВО НОРДИСК А/С (DK)
Приоритеты:
подача заявки:
2003-09-25
публикация патента:

Настоящее изобретение относится к способу ацилирования одной или нескольких аминогрупп пептида, который выбирают из группы, включающей экзендин-3, экзендин-4, Arg34 -GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-амид, Gly 8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-амид, Val8-GLP-1(7-37), Val8 -Asp22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Asp22-GLP-1(7-37), Val 8Glu22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Glu22-GLP-1(7-37), Val 8Lys22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Lys22-GLP-1(7-37), Val 8Arg22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Arg22-GLP-1(7-37), Val 8His22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8His22-GLP-1(7-37), дез(В30)-инсулин человека и их аналоги, в котором реакцию ацилирования проводят в водной смеси, содержащей менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя, и осуществляют взаимодействие пептида с ацилирующим агентом общей формулы I, где n равно 0-8; R1 означает COOR4; R2 означает липофильную часть молекулы; R3 вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R 3, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир; и R4 выбирают из группы, включающей водород, С1-12-алкил и бензил; в основных условиях в водной смеси, при этом ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора, стабилизированного путем добавления кислоты. 16 з.п. ф-лы, 2 табл.

способ ацилирования пептидов, патент № 2345062

Формула изобретения

1. Способ получения N-ацилированного пептида, который включает стадии:

а) осуществление взаимодействия пептида, который выбирают из группы, включающей экзендин-3, экзендин-4, Arg 34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-амид, Gly8-GLP-1(7-37), Val8 -GLP-1(7-36)-амид, Val8-GLP-1(7-37), Val 8Asp22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Asp22-GLP-1(7-37), Val 8Glu22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Glu22-GLP-1(7-37), Val 8Lys22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Lys22-GLP-1(7-37), Val 8Arg22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8Arg22-GLP-1(7-37), Val 8His22-GLP-1(7-36)-амид, Val 8His22-GLP-1(7-37), дез(В30)-инсулин человека и их аналоги, с ацилирующим агентом общей формулы I

способ ацилирования пептидов, патент № 2345062

где n равно 0-8;

R1 означает COOR4;

R 2 означает липофильную часть молекулы;

R 3 вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R3, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир; и

R 4 выбирают из группы, включающей водород, С 1-12алкил и бензил;

в основных условиях в водной смеси;

b) омыление сложноэфирной группы ацилированного пептида (COOR4) в основных условиях, если R не является водородом;

c) выделение N-ацилированного пептида;

характеризующийся тем, что водная смесь, используемая на стадии а), содержит менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя, в котором ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора, стабилизированного путем добавления кислоты.

2. Способ по п.1, в котором реакцию на стадии а) выполняют в водной смеси, содержащей менее 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя, предпочтительно менее 5% мас./мас. апротонного полярного растворителя и еще предпочтительнее менее 3% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

3. Способ по п.1, в котором реакцию на стадии а) выполняют в присутствии апротонного полярного растворителя, причем указанный апротонный полярный растворитель выбирают из группы, включающей N-метил-2-пирролидон, тетрагидрофуран и диметилсульфоксид.

4. Способ по п.1, в котором весь апротонный органический растворитель добавляют к реакционной смеси в качестве растворителя для ацилирующего агента.

5. Способ по п.1, в котором указанную кислоту добавляют к апротонному полярному растворителю в концентрации от 0,01 до 1% мас./мас., предпочтительно в концентрации от 0,05 до 0,5% мас./мас..

6. Способ по п.1, в котором указанную кислоту выбирают из группы, включающей серную кислоту, метансульфоновую кислоту и трифторуксусную кислоту.

7. Способ по п.1, в котором реакцию на стадии а) выполняют без апротонного полярного растворителя.

8. Способ по п.1, в котором R 4 означает водород.

9. Способ по п.1, в котором R 4 выбирают из группы, включающей C1-8 -алкил и бензил.

10. Способ по п.1, в котором R 3 вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R3, означает реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир.

11. Способ по п.1, в котором сложный эфир ацилированного пептида подвергают омылению при значении рН в пределах 10-14, предпочтительно при рН в пределах 9-13.

12. Способ по п.1, в котором рН реакционной смеси на стадии а) находится в пределах от рН 9 до рН 13, предпочтительно в пределах от рН 10 до рН 12 или более предпочтительно в пределах от рН 11,0 до рН 11,5.

13. Способ по п.1, в котором температура реакционной смеси на стадии а) находится в интервале 0-50°С, предпочтительно в интервале 5-40°С и более предпочтительно в интервале 10-30°С.

14. Способ по п.1, в котором R2 выбирают из группы, включающей С3-39-алкил, С 3-39-алкенил, С3-39-алкадиенил и стероидные остатки.

15. Способ по п.1, в котором R 2-С(=O)- выбирают из группы, включающей литохолоил и гексадеканоил.

16. Способ по п.1, в котором пептид, используемый в качестве исходного вещества на стадии а), имеет чистоту, равную по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 93%, по крайней мере 95% или по крайней мере 97%, при определении методом ВЭЖХ с обращенной фазой.

17. Способ по п.1, в котором реакционная смесь, используемая на стадии а), содержит буфер, пригодный для сохранения, по существу, постоянного значения рН в течение всей реакции.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам ацилирования пептидов и белков. В частности, данное изобретение относится к способу введения одной или нескольких ацильных групп в пептид или белок.

Уровень техники

Многие пептиды признаны пригодными для использования в медицинской практике, причем указанные пептиды могут быть продуцированы в приемлемых клетках-хозяевах методами рекомбинантных ДНК или синтезированы хорошо известными методами синтеза пептидов. Однако нативные пептиды и их аналоги характеризуются высокой скоростью клиренса, неприемлемым для многих клинических показаний, при которых необходимо сохранение высокой концентрации пептида в плазме в течение длительного периода времени. Примеры пептидов, которые в нативной форме отличаются высоким клиренсом, включают АСТН, фактор высвобождения кортикотропина, ангиотензин, кальцитонин, инсулин, глюкагон, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2), инсулиноподобный фактор роста 1, инсулиноподобный фактор роста 2, пептид, подавляющий выделение желудочного сока, фактор высвобождения гормона роста, пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу, секретин, энтерогастрин, соматостатин, соматотропин, соматомедин, паратиреоидный гормон, тромбопоэтин, эритропоэтин, релизинг-факторы гипоталамуса, пролактин, стимулирующие гормоны щитовидной железы, эндорфины, энкефалины, вазопрессин, окситоцин, опиоиды и их аналоги, пероксид-дисмутазу, интерферон, аспарагиназу, аргиназу, аргининдезаминазу, аденозиндезаминазу и рибонуклеазу.

Установлено, что разные производные пептидов и их аналогов благоприятно влияют на скорость клиренса пептидов. Одним способом получения такого производного является введение липофильной ацильной группы в терапевтический пептид, вызывающее требуемый более продолжительный профиль действия по сравнению с неацилированным пептидом. Благодаря более редкому введению терапевтического белка улучшается соблюдение больным режима и схемы предписанного лечения и уменьшается количество вводимого пептида. Указанный способ описан в заявке WO 98/08871, в которой рассмотрено ацилирование GLP-1 и его аналогов, в заявке WO 98/08872, в которой рассмотрено ацилирование GLP-2 и его аналогов, и в заявке WO 99/43708, в которой рассмотрено ацилирование экзендина и его аналогов. Установлено, что между пептидом и ацильной группой желательно использовать моно- и дипептидные спейсеры, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Спейсеры, включающие свободную группу карбоновой кислоты, необходимо защитить до ацилирования и затем удалить защитную группу.

В европейском патенте № 1227107 описано ацилирование способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -аминогрупп инсулина человека.

В заявке WO 00/55119 описан способ ацилирования пептидов (например, GLP-1) и новые ацилирующие агенты.

Чтобы терапевтические пептиды были экономически выгодными, важное значение имеют производственные затраты при получении пептидов, а также терапевтическая дозировка пептида. Наибольшие затраты при производстве терапевтических пептидов относятся к стадиям очистки, необходимым для отделения целевого белка от загрязняющих примесей, близко родственных целевому белку, таких как изомеры, дезамидные формы и т.д. Очистки обычно выполняют при помощи хроматографии с использованием дорогостоящих хроматографических матриц и растворителей, что уменьшает общий выход продукта.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа введения липофильных групп в пептиды при помощи спейсеров, представляющих собой способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -амино-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 ,способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -дикарбоновую кислоту. Данный способ является более специфическим, позволяет получить более высокие выходы продукта и уменьшить образование близко родственных загрязняющих примесей. При этом достигается значительное сокращение затрат при производстве ацилированных пептидов. Более дешевые ацилированные пептиды весьма желательны для максимального увеличения числа больных, которым будет доступно лечение вышеуказанными препаратами, а также для реализации преимуществ альтернативных способов доставки, характеризующихся более низкой биодоступностью по сравнению с подкожными инъекциями, таких как чрезкожная и легочная доставка.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу ацилирования одной или нескольких аминогрупп пептида или белка, который включает стадии:

а) осуществление взаимодействия пептида, содержащего по крайней мере одну свободную аминогруппу, с ацилирующим агентом общей формулы I

способ ацилирования пептидов, патент № 2345062

где

n равно 0-8;

R 1 означает COOR4;

R 2 означает липофильную часть молекулы;

R 3 вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R3, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир; и

R 4 выбирают из группы, включающей водород, С 1-12-алкил и бензил;

в основных условиях в водной смеси;

b) омыление сложноэфирной группы ацилированного пептида (COOR4) в основных условиях, если R4 не является водородом;

с) выделение N-ацилированного пептида;

отличающийся тем, что водная смесь, используемая на стадии а), содержит менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению взаимодействие на стадии а) выполняют в водной смеси, содержащей менее 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя, предпочтительно менее 5% мас./мас. апротонного полярного растворителя и еще предпочтительнее менее 3% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной среде в виде твердого вещества.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора в апротонном полярном растворителе, который стабилизуют добавлением кислоты.

Подробное описание изобретения

Пептиды и белки

Настоящее изобретение относится к введению липофильных ацильных групп в любой пептид (или белок) для уменьшения скорости клиренса in vivo. Примеры таких пептидов и белков включают АСТН, фактор высвобождения кортикотропина, ангиотензин, кальцитонин, экзендин и его аналоги, инсулин и его аналоги, глюкагон и его аналоги, глюкагоноподобный пептид-1 и его аналоги, глюкагоноподобный пептид-2 и его аналоги, инсулиноподобный фактор роста 1, инсулиноподобный фактор роста 2, пептид, подавляющий выделение желудочного сока, фактор высвобождения гормона роста, пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу, секретин, энтерогастрин, соматостатин, соматотропин, соматомедин, паратиреоидный гормон, тромбопоэтин, эритропоэтин, релизинг-факторы гипоталамуса, пролактин, стимулирующие гормоны щитовидной железы, эндорфины, энкефалины, вазопрессин, окситоцин, опиоиды и их аналоги, пероксид-дисмутазу, интерферон, аспарагиназу, аргиназу, аргининдезаминазу, аденозиндезаминазу и рибонуклеазу.

Совершенно очевидно, что пептид (или белок) должен иметь по крайней мере одну свободную аминогруппу, которая является N-концевой аминогруппой или аминогруппой боковой цепи. Пептиды или белок могут содержать аминокислоты, не кодированные генетическим кодом, такие как D-аминокислоты, 3-гидроксипролин, орнитин и пентилглицин. Особенно интересными являются аминогруппы аминокислотных остатков лизина и орнитина. Данный способ, в частности, относится к N-ацилированию способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -аминогруппы остатков лизина. Кроме того, должно быть понятно, что рассматриваемый пептид или белок может содержать две или больше боковых аминогрупп, все из которых могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение особенно относится к ацилированию GLP-1 и его аналогов. Примеры GLP-1 и его аналогов, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, включают GLP-1 и его аналоги с укороченной последовательностью, такие как Arg26-GLP-1(7-37); Arg34-GLP-1(7-37); способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 способ ацилирования пептидов, патент № 2345062

и их производные. Все указанные аналоги GLP-1 и аналоги с укороченной последовательностью относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к ацилированию GLP-2 и его аналогов. Примеры GLP-2 и его аналогов, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, включают аналоги GLP-2 и аналоги с укороченной последовательностью, такие как Lys 20GLP-2(1-33); Lys20Arg 30GLP-2(1-33); Arg30Lys 34GLP-2(1-34); Arg30Lys 35GLP-2(1-35); Arg30,35Lys 20GLP-2(1-35) и Arg35GLP-2(1-35). Все указанные аналоги GLP-2 и аналоги с укороченной последовательностью относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к ацилированию экзендина-3, экзендина-4 и их аналогов. Примеры аналогов экзендина, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, описаны, например, в заявке WO 99/43708. Все вышеуказанные аналоги экзендина и аналоги с укороченной последовательностью относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится также к ацилированию инсулина и его аналогов. Примерами инсулина и его аналогов, которые могут быть N-ацилированы способом по настоящему изобретению, являются инсулин человека и дез(В30)-инсулин человека.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения N-ацилированию подвергают способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -аминогруппу остатков лизина.

Ацилирующий агент

В способе по настоящему изобретению пептид (или белок), имеющий по крайней мере одну свободную аминогруппу, подвергают взаимодействию с ацилирующим агентом общей формулы I

способ ацилирования пептидов, патент № 2345062

Целое число n в формуле I предпочтительно равно 0-8, в частности 0-6, что соответствует, например, аспарагиновой кислоте, глутаминовой кислоте и т.д. Число n предпочтительно равно 0-4, более предпочтительно 0-2, например 0 (аспарагиновая кислота) или 1 (глутаминовая кислота). Все указанные целые числа и диапазоны указанных чисел относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

R 1 в формуле I означает свободную кислотную группу (СООН) или сложноэфирную группу (COOR4). В тех случаях, когда R1 является сложноэфирной группой, R4 выбирают из групп, которые могут быть удалены (в виде соответствующих спиртов) гидролизом в основных условиях. Примеры таких групп включают С 1-12-алкил, например метил, этил, проп-1-ил, проп-2-ил, бут-1-ил, бут-2-ил, 2-метилпроп-1-ил, 2-метилпроп-2-ил (трет-бутил), гекс-1-ил, бензил и т.д. Все указанные группы относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

R 2 в формуле I означает липофильную часть молекулы, вводимую в пептид или белок. Такую липофильную часть обычно выбирают из группы, включающей С3-39-алкил, С 3-39-алкенил, С3-39-алкадиенил и стероидные остатки. Типичными примерами С3-39 -алкила являются гептил, нонил, ундеканил, тридеканил, пентадеканил, гептадеканил и нонадеканил. Все указанные липофильные части молекулы относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Липофильный заместитель или часть молекулы характеризуется растворимостью в воде при 20°С в пределах от около 0,1 мг/100 мл воды до около 250 мг/100 мл воды, предпочтительно в пределах от около 0,3 мг/100 мл воды до около 75 мг/100 мл воды. Например, октановая кислота (С8) характеризуется растворимостью в воде при 20°С, равной 68 мг/100 мл, декановая кислота (С10) характеризуется растворимостью в воде при 20°С, равной 15 мг/100 мл, и октадекановая кислота (С18) характеризуется растворимостью в воде при 20°С, равной 0,3 мг/100 мл. Все пределы растворимости указанных липофильных заместителей относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Термины "С3-39-алкил", "С 3-39-алкенил" и "С3-39-алкадиенил" означают насыщенные, мононенасыщенные и диненасыщенные углеводородные радикалы с прямой и разветвленной цепью, предпочтительно с прямой цепью, содержащие 3-39 атомов углерода. Типичными примерами С 3-39-алкила являются гептил, нонил, ундеканил, тридеканил, пентадеканил, гептадеканил и нонадеканил.

В используемом здесь значении термин "стероидный остаток" означает липофильную группу, которая вместе с карбонильной группой, к которой присоединен R2, представляет собой производное карбоновой кислоты стероида, то есть три-, тетра- и пентациклический, полностью насыщенный или частично ненасыщенный С16-36-углеводород. Примерами таких групп R2-C(=O)- являются литохолоил, дезоксихолоил и холоил.

Среди вышеуказанных липофильных групп С 7-25-алкил, С7-25-алкенил, С 7-25-алкадиенил и стероидные остатки особенно пригодны для использования в настоящем изобретении. Особенно интересными примерами являются гептил, нонил, ундеканил, тридеканил, пентадеканил, гептадеканил, нонадеканил, литохолоил, дезоксихолоил и холоил. Все указанные липофильные группы относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

R 3 в формуле I вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R3, означает реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир. Все указанные сложные эфиры относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения. Реакционноспособные сложные эфиры и реакционноспособные N-гидроксиимидоэфиры хорошо известны в области органической химии (особенно в химии пептидов) в качестве функциональных групп, используемых при ацилировании амино-, тио- и гидроксильных групп. В контексте настоящего изобретения термин "реакционноспособный сложный эфир или реакционноспособный N-гидроксиимидоэфир" означает сложноэфирную функционально активную форму группы карбоновой кислоты, пригодную для ацилирования амина, предпочтительно первичного амина. Таким образом, должно быть понятно, что избирательное ацилирование первичных аминов является более предпочтительным, чем ацилирование гидроксильных и тиогрупп. Особенно предпочтительными являются реакционноспособные N-гидроксиимидоэфиры.

Примерами реакционноспособных сложных эфиров являются сложные эфиры 1-гидроксибензотриазола и их производные. Известен целый ряд высокоэффективных реагентов, например тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония, используемых для получения активированных сложных эфиров карбоновых кислот. Такие реакционноспособные эфиры обычно образуются in situ в присутствии основания, например, органического основания, такого как триалкиламин.

Примеры имидной части реакционноспособных N-гидроксиимидоэфиров приведены в европейском патенте № 0511600 А2, на стр. 3-7. Особенно интересными примерами имидных частей являются сукцинимид, фталимид и т.д. Все указанные имидные части относятся к альтернативным вариантам осуществления настоящего изобретения.

Реакционноспособные N-гидроксиимидоэфиры формулы I можно получить в соответствии с описанием, приведенным в заявках WO 00/55119 и WO 98/02460.

При использовании ацилирующего реагента формулы I в виде свободной способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -карбоновой кислоты (R4 = водород) соединение формулы I, где R4 означает группу, которая может быть избирательно удалена, превращают в соответствующее соединение, где R4 означает водород. Защитной группой карбоновой кислоты может быть бензильная группа, которая может быть удалена каталитическим гидрированием, или аллильная группа, которая может быть избирательно удалена. Бензильную защитную группу можно удалить каталитическим гидрированием в апротонном полярном растворителе, например в ацетоне, при комнатной температуре с использованием палладия-на-угле и водорода. Указанная реакция может быть выполнена в закрытом сосуде в атмосфере водорода (обычно под давлением 0,1-10 атм) при интенсивном перемешивании. Данная реакция обычно продолжается в течение 0,5-12 часов в зависимости от качества палладиевого катализатора. При этом производят обычную обработку.

Условия реакции

Взаимодействие между ацилирующим агентом формулы I и пептидом или белком осуществляют в основных условиях в водном растворе, содержащем менее 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В одном варианте осуществления изобретения реакцию на стадии а) выполняют в водном растворе, содержащем от 0% мас./мас. до 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления изобретения реакцию на стадии а) выполняют в водном растворе, содержащем от 1% мас./мас. до 10% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления изобретения реакцию на стадии а) выполняют в водном растворе, содержащем от 1% мас./мас. до 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

Ацилирующий агент формулы I обычно используют в небольшом избытке по отношению к числу ацилируемых аминогрупп пептида. Соотношение избытка ацилирующего агента обычно составляет от 1:1 до 1:20, предпочтительно от 1:1,2 до 1:5 в зависимости от числа аминогрупп в пептиде. Ацилирующий агент можно добавлять к реакционной смеси в виде твердого вещества или раствора. При добавлении ацилирующего агента в виде раствора указанный агент растворяют в апротонном полярном растворителе и предпочтительно стабилизуют, добавляя кислоту. Для стабилизации обычно используют минеральную кислоту, например серную кислоту.

Должно быть понятно, что пептид может быть полностью N-ацилирован или только частично N-ацилирован в зависимости от используемого количества ацилирующего агента и условий реакции. Желательно, чтобы N-ацилирование было по существу стехиометрическим.

Апротонные полярные растворители являются растворителями с умеренно высокими диэлектрическими константами, не содержащими кислотного водорода (см., например, Morrison and Boyd, Organic Chemistry, 5th ed. p. 229). Апротонный полярный растворитель обычно выбирают из группы, включающей безводный тетрагидрофуран (ТГФ), безводный диметилформамид (ДМФА), ацетон, дихлорметан, диметилсульфоксид (ДМСО), диоксан, диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон и их смеси, из которых предпочтительными являются диметилформамид, диметилсульфоксид, диметилацетамид и N-метил-2-пирролидон и особенно предпочтительным является N-метил-2-пирролидон.

Температура обычно находится в интервале от -10°С до 50°С.

Важно, чтобы значение рН смеси растворителей находилось в пределах 7-14, например 9-13, предпочтительно в пределах 10-12, для более спокойного протекания реакции. Выход и чистота продукта обычно являются оптимальными при значении рН смеси растворителей в пределах 10-12. Требуемое значение рН получают, добавляя гидроксиды щелочных металлов, например гидроксид натрия и гидроксид калия, и/или органические основания, такие как триалкиламины (например, триэтиламин, N,N-диизопропилэтиламин и т.д.). Кроме того, может быть желательно добавить буфер, который позволяет удерживать рН почти у исходного значения до начала реакции. Примеры буфера, который можно использовать для указанной цели, включают фосфатный буфер, боратный буфер и тому подобные.

В качестве типичного примера можно отметить, что реакцию на стадии (а) выполняют с использованием белка и ацилирующего агента формулы I в молярном соотношении от 1:1 до 1:5. Пептид обычно предварительно растворяют в воде при температуре от -10°С до 30°С, например при 0-25°С, и значение рН доводят до требуемого уровня, добавляя гидроксид щелочного металла (например, гидроксид натрия или гидроксид калия). Значение рН может быть далее отрегулировано с использованием кислот, например уксусной кислоты, и оснований, например триалкиламина, но температура предпочтительно находится в вышеуказанном интервале. Альтернативно пептид предварительно растворяют непосредственно в водном растворе соответствующего количества вышеуказанной кислоты или основания. Затем добавляют ацилирующий агент в виде твердого вещества или раствора в апротонном полярном растворителе. Реакцию обычно выполняют до полного завершения (ход реакции можно контролировать ВЭЖХ), обычно достигаемого через 0,2-4 часа, в частности через 0,2-1 час, после чего добавляют воду и кислоту, например уксусную кислоту, до рН 6,5-9,0. Продукт обычно выделяют и очищают при помощи ВЭЖХ, осаждают при изоэлектрическом показателе рН или гидролизуют (стадия (b)) перед очисткой.

При использовании ацилирующего агента формулы I, в которой R4 означает водород, сразу же получают N-ацилированный пептид или белок, содержащий липофильные части и свободные карбоксильные группы. Таким образом, вариант, в котором R4 означает водород, является предпочтительным вариантом осуществления способа по настоящему изобретению.

В альтернативном случае, то есть, когда R4 означает С1-12 -алкил или бензил, сложный эфир N-ацилированного пептида (или сложный эфир белка) подвергают омылению в основных условиях, в результате чего получают N-ацилированный пептид или N-ацилированный белок. Омыление обычно выполняют в 0,01-4,0 М растворе гидроксида щелочного металла, например гидроксида натрия или калия. Показатель рН раствора обычно равен 10-14. Реакцию обычно выполняют в течение 0,1-12 часов, предпочтительно в течение 0,5-4 часов, при 0-40°С, например при комнатной температуре. После окончания реакции продукт очищают, например, путем осаждения при изоэлектрическом значении рН и/или при помощи препаративной ВЭЖХ. Таким образом, вариант, в котором R4 означает С 1-12-алкил или бензил, является другим предпочтительным вариантом осуществления способа по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде твердого вещества.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакцию на стадии а) выполняют в водной смеси, содержащей от 0% мас./мас. до 8% мас./мас. апротонного полярного растворителя, предпочтительно от 0% мас./мас. до 5% мас./мас. апротонного полярного растворителя и еще предпочтительнее от 0% мас./мас. до 3% мас./мас. апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакцию на стадии а) выполняют в присутствии апротонного полярного растворителя, который выбирают из группы, включающей N-метил-2-пирролидон, тетрагидрофуран и диметилсульфоксид.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению весь апротонный органический растворитель добавляют к реакционной смеси в качестве растворителя для ацилирующего агента.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению ацилирующий агент добавляют к реакционной смеси в виде раствора, стабилизированного путем добавления кислоты.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению кислоту добавляют к апротонному полярному растворителю в концентрации от 0,01% мас./мас. до 1% мас./мас., предпочтительно в концентрации от 0,05% мас./мас. до 0,5% мас./мас.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанную кислоту выбирают из группы, включающей серную кислоту, метансульфоновую кислоту и трифторуксусную кислоту.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакцию на стадии а) выполняют без апротонного полярного растворителя.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R 4 в формуле I означает водород.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R 4 выбирают из С1-8-алкила и бензила.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R3 вместе с карбоксильной группой, к которой присоединен R3, означает реакционноспособный N-гидроксимидоэфир.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению сложный эфир ацилированного пептида подвергают омылению при значении рН в пределах 10-14, предпочтительно при рН в пределах 9-13.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению сложный эфир ацилированного пептида подвергают омылению при значении рН в пределах 9-14, в частности при рН в пределах 10-13.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению значение рН реакционной смеси на стадии а) равно от рН 9 до рН 13, предпочтительно от рН 10 до рН 12 или более предпочтительно от рН 11,0 до рН 11,5.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению реакционная смесь, используемая на стадии а), содержит буфер, пригодный для поддержания по существу постоянного значения рН во время реакции. В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный буфер является фосфатным буфером, боратным буфером или их смесью.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению температура реакционной смеси на стадии а) находится в интервале 0-50°С, предпочтительно в интервале 5-40°С и более предпочтительно в интервале 10-30°С.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R2 выбирают из группы, включающей С 3-39-алкил, С3-39-алкенил, С 3-39-алкадиенил и стероидные остатки.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению R 2-C(=O)- выбирают из группы, включающей литохолоил и гексадеканоил.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению пептид, используемый в качестве исходного вещества на стадии а), имеет чистоту, равную по крайней мере 80%, по крайней мере 90%, по крайней мере 93%, по крайней мере 95% или по крайней мере 97%, при определении методом ВЭЖХ с обращенной фазой.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из группы, включающей GLP-1, экзендин-4, GLP-2, глюкагон, инсулин, аналоги и производные любых вышеуказанных веществ.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид является агонистом GLP-1.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из группы, включающей экзендин-3, экзендин-4, Arg34-GLP-1(7-37), Gly8 -GLP-1(7-36)-амид, Gly8-GLP-1(7-37), Val 8-GLP-1(7-36)-амид, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-1(7-36)-амид, Val8Asp22-GLP-1(7-37), Val8Glu22-GLP-1(7-36)-амид, Val8Glu22-GLP-1(7-37), Val8Lys22-GLP-1(7-36)-амид, Val8Lys22-GLP-1(7-37), Val8Arg22-GLP-1(7-36)-амид, Val8Arg22-GLP-1(7-37), Val8His22-GLP-1(7-36)-амид, Val8His22-GLP-1(7-37), дез(В30)-инсулин человека и их производные.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из группы, Val8Trp 19Glu22-GLP-1(7-37), Val 8Glu22Val25 -GLP-1(7-37), Val8Tyr16 Glu22-GLP-1(7-37), Val8 Trp16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Leu16Glu 22-GLP-1(7-37), Val8Tyr 18Glu22-GLP-1(7-37), Val 8Glu22His37 -GLP-1(7-37), Val8Glu22 Ile33-GLP-1(7-37), Val8 Trp16Glu22Val 25Ile33-GLP-1(7-37), Val 8Trp16Glu22 Ile33-GLP-1(7-37), Val8 Glu22Val25Ile 33-GLP-1(7-37), Val8Trp 16Glu22Val25 -GLP-1(7-37) и их аналоги.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид выбирают из HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2 (ZP-10) и его аналогов.

В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид не является инсулиновым пептидом, то есть он не является инсулином или его аналогом. В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид включает только одну полипептидную цепь. В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанный пептид содержит две полипептидные цепи, которые ковалентно связаны по крайней мере одной дисульфидной связью.

Другим объектом настоящего изобретения является применение описанного способа ацилирования для получения производного пептида, выбираемого из группы, включающей Arg 34, Lys26(Nспособ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(Nспособ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -гексадеканоил)))-GLP-1(7-37) и Lys В29(Nспособ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -тетрадеканоил)дез(В30)-инсулин человека и Lys В29(Nспособ ацилирования пептидов, патент № 2345062 [Nспособ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -литохолоил-Glu-OH])дез(В30)-инсулин человека.

ПРИМЕРЫ

Ацилирующие реагенты получены в соответствии с описанием, приведенным в заявке WO 00/55119.

В примерах конечную очистку продукта производили с помощью хроматографии на колонках.

Пример 1

Arg 34GLP-1(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg34GLP-1 (7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg34GLP-1 7-37 (1,47 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,10 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (23 мл) при 10-15°С. Значение рН раствора было равно 11,6. Добавляли способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -N-гидроксисукцинимидоэфир N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (63,7 мг, 0,13 ммоль). Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли воду (42 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 84% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 (способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 и 0,5% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 .

Пример 2

Arg34 GLP-1(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg34GLP-1 (7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg34GLP-1 7-37 (1,57 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,14 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (23 мл) при 10-15°С. Значение рН раствора доводили до 11,5, добавляя триэтиламин. Затем добавляли 1,7 мл способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -N-гидроксисукцинимидоэфира N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (92,1 мг, 0,19 ммоль), растворенного в N-метил-2-пирролидоне, содержащем 0,105% мас./мас. 1 М раствора Н2 SO4. Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли воду (42 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 83% (по площади) Arg34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 и 0,4% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 .

Пример 3

Arg34 GLP-1(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg34GLP-1 (7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg34GLP-1 7-37 (1,53 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,13 ммоль) растворяли в 0,05 моль/кг триэтиламина (25 мл) при комнатной температуре. Значение рН раствора было равно 10,9. Затем добавляли 1,8 мл способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -N-гидроксисукцинимидоэфира N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (94,2 мг, 0,19 ммоль), растворенного в N-метил-2-пирролидоне без добавления Н2SO4 . Реакционную смесь выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре и добавляли воду (48 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 75% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 и 4,0% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 .

Пример 4. Сравнительный пример с использованием апротонного полярного растворителя в концентрации >10% мас./мас.

Arg34GLP-1(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg34GLP-1 7-37 (1,57 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,14 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (23 мл) при 10-15°С. Добавляли N-метил-2-пирролидон (6,8 мл) и значение рН раствора доводили до 11,5, добавляя триэтиламин. Затем добавляли способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -N-гидроксисукцинимидоэфир N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (92,1 мг, 0,19 ммоль), растворенного в 1,7 мл N-метил-2-пирролидона, содержащего 0,105% мас./мас. 1 М раствора Н2 SO4. Реакционную смесь выдерживали в течение 20 минут при комнатной температуре и добавляли воду (54 мл), при этом рН доводили до 8,0, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 87% (по площади) Arg34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 и 0,5% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 .

Пример 5. Сравнительный пример с использованием апротонного полярного растворителя в концентрации >10% мас./мас.

Arg34GLP-1(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg34GLP-1(7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Arg34GLP-1 7-37 (1,51 г замороженного изоосажденного пептида, примерно 0,13 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (20 мл) и N-метил-2-пирролидоне (100 мл) при 10-15°С. Затем добавляли способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -N-гидроксисукцинимидоэфир N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (74 мг, 0,15 ммоль), растворенного в 1,4 мл N-метил-2-пирролидона, содержащего 0,105% мас./мас. 1 М раствора Н2 SO4. Реакционную смесь выдерживали в течение 45 минут при комнатной температуре и добавляли воду (206 мл), при этом рН доводили до 8, добавляя 1,0 М раствор уксусной кислоты.

Выход: результаты анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой показали, что реакционная смесь содержала 57% (по площади) Arg 34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 и 14% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 .

Пример 6

В таблице 1 суммированы экспериментальные условия, используемые для ацилирования Arg 34-GLP-17-37 в экспериментах по примерам 1-5, и указано содержание загрязняющей примеси Arg 34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (сокращенное обозначение способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -glu). Из таблицы видно, что без добавления H 2SO4 в качестве стабилизатора количество загрязняющей примеси способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -glu можно сократить при использовании более низких концентраций апротонного полярного растворителя. При добавлении стабилизатора образование значительных количеств загрязняющей примеси способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -glu начинается при гораздо более высоких концентрациях апротонного полярного растворителя, то есть при концентрации выше 28% мас./мас.

Таблица 1

Содержание апротонного полярного растворителя в реакционной смеси при ацилировании пептидов GLP-1 и полученная фракция загрязняющей примеси Arg 34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -glu). (Данные из примеров 1-5)
№ примераВодный раствор пептида (мл)Добавляемое количество NMP (мл) Содержание NMP (% мас./мас.) Добавляемое количество H 2SO4 способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -glu
1 2300% -0,5%
2 231,7 7%+0,4%
325 1,87%- 4%
423 6,8+1,728% +0,5%
5 20100+1,4 84%+14%

Пример 7

Кристаллизованный натрием дез(В30)-инсулин человека (1,74 г замороженного пептида, выделенного изоэлектрическим осаждением, примерно 0,088 ммоль) растворяли в 0,1 моль/кг триэтиламина (10,85 мл) при комнатной температуре. Значение рН раствора было равно 10,9. Затем добавляли метил-(2S)-5-[(2,5-диоксо-1-пирролидинил)окси]-2-{[(3a,5b)-3-гидрокси-9-метил-24-оксохолан-24-ил]амино}-5-оксопентаноат (55,1 мг, 0,089 ммоль), растворенный в N-метил-2-пирролидоне (1,25 мл). Реакционную смесь выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре и добавляли воду (5°С, 85 мл).

Выход: по результатам анализа методом ВЭЖХ с обращенной фазой реакционная смесь содержала 34% (по площади) N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(литохолоил-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -глутамил)-LysВ29-дез(В30)-инсулина человека.

Пример 8

Arg 34GLP-1(7-37) экспрессировали в дрожжах (S. cerevisiae) обычными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в заявке WO 98/08871. Arg34GLP-1 (7-37), культивируемый в ферментационном бульоне, очищали хроматографией с обращенной фазой и затем осаждали при изоэлектрическом значении рН пептида, то есть при рН 5,4. Осадок отделяли центрифугированием и замораживали.

Осадок, полученный в результате изоэлектрического осаждения и содержащий Arg34GLP-1 (7-37) (5,70 г замороженного осажденного пептида, примерно 0,38 ммоль), растворяли в 0,1 М растворе дигидрата динатрийгидрофосфата (170 мл, рН доводили до 11,35, добавляя 1 М раствор NaOH) при 15°С. Значение рН раствора вторично доводили до 11,4, добавляя 1 М раствор NaOH. Затем в течение 8 минут по каплям добавляли 3 мл способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -N-гидроксисукцинимидоэфира N-гексадеканоилглутаминовой кислоты (248,1 мг, 0,51 ммоль), растворенного в N-метилпирролидоне, содержащем 0,105% мас./мас. 1 М раствора H2 SO4.

Образцы отбирали на протяжении 21,5 часа выполнения реакции при 15°С и добавляли 0,1 М раствор дигидрата динатрийгидрофосфата, содержащий 1 мг/мл глицина, рН 7,5. Конечную реакционную смесь разбавляли водой (300 мл) и рН доводили до 8,0, добавляя ледяную уксусную кислоту.

Выход: По результатам анализа методов ВЭЖХ с обращенной фазой реакционная смесь содержала 78-80% (по площади) Arg 34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 и 0,24-1,67% (по площади) Arg34Lys 26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 .

Таблица 2

Содержание Arg 34Lys26-[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu) и Arg34Lys26 -[N-способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -(способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu(N-гексадеканоил))]-GLP-17-37 (способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu) в зависимости от времени реакции. (Данные из примера 8)
Время (часы) способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu (% по площади)способ ацилирования пептидов, патент № 2345062 -Glu (% по площади)
0,17 78,010,24
179,35 0,31
279,45 0,36
4 80,490,45
21,580,271,67

способ ацилирования пептидов, патент № 2345062

Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2345062

patent-2345062.pdf

Класс C07C235/72 с атомами углерода карбоксамидных групп, связанными с ациклическими атомами углерода

Класс C07K1/06 с использованием защитных групп или активирующих агентов

полипептиды, конкурентно ингибирующие gq- белок, способы их получения и применение -  патент 2487135 (10.07.2013)
способ получения пептида эксенатида -  патент 2458066 (10.08.2012)
пептидоподобное соединение, обладающее противовирусной активностью, и способ его получения -  патент 2450806 (20.05.2012)
способ получения нонапептидэтиламида и промежуточные соединения для его получения -  патент 2444525 (10.03.2012)
способ получения бусерелина и промежуточные соединения для его получения -  патент 2442791 (20.02.2012)
способ получения циклического пептида - октреотида -  патент 2435780 (10.12.2011)
способ получения бициклических пептидных соединений -  патент 2330045 (27.07.2008)
способ получения аналогов аденокортикотропного гормона (актг), последовательности (4-10), обладающих нейротропной активностью, и тетрапептид для его получения -  патент 2315057 (20.01.2008)
способ получения гептапептида и промежуточные соединения для его получения -  патент 2303603 (27.07.2007)
способ синтеза пептида, содержащего остаток триптофана -  патент 2276156 (10.05.2006)

Класс C07K14/605 глюкагоны

способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера -  патент 2495881 (20.10.2013)
пептид, фармацевтическая композиция (варианты) и лекарственное средство на его основе, способ лечения и/или предупреждения диабета или заболеваний, сопутствующих ожирению, способ уменьшения аппетита, уменьшения потребления пищи, уменьшения потребления калорий, уменьшения массы тела и увеличения расхода энергии -  патент 2492183 (10.09.2013)
соединения оксинтомодулина (варианты), фармацевтическая композиция на их основе, способы лечения и профилактики ожирения и сопутствующих заболеваний (варианты) и лекарственное средство (варианты) -  патент 2485135 (20.06.2013)
аналоги глюкагона, обладающие повышенной растворимостью в буферах с физиологическим значением ph -  патент 2477286 (10.03.2013)
способ очистки циклического или нециклического пептида -  патент 2461564 (20.09.2012)
способ получения пептида эксенатида -  патент 2458066 (10.08.2012)
синтез инсулинотропных пептидов -  патент 2448978 (27.04.2012)
ацилированные glp-1 соединения -  патент 2434019 (20.11.2011)
соединения агонисты рецептора глюкагоноподобного белка-1 (glp-1r) -  патент 2432361 (27.10.2011)
пептидные производные эксендина-4 -  патент 2420536 (10.06.2011)

Класс C07K14/62 инсулины

инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения -  патент 2527893 (10.09.2014)
новые производные инсулина с чрезвычайно замедленным профилем время/действие -  патент 2524423 (27.07.2014)
аналоги инсулина, устойчивые к протеазам -  патент 2524150 (27.07.2014)
производные инсулина -  патент 2518460 (10.06.2014)
аналоги инсулина с ацильной и алкиленгликолевой группировкой -  патент 2514430 (27.04.2014)
аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие аминокислотную замену в положении 59 -  патент 2511577 (10.04.2014)
хроматографические способы и соединения, очищенные этими способами -  патент 2508294 (27.02.2014)
способ регулирования условий для сайт-специфического связывания полипептида и непептидильного полимера -  патент 2495881 (20.10.2013)
способ получения рекомбинантного инсулина гларгина -  патент 2495131 (10.10.2013)
препаративный хроматографический способ на основе нелинейного градиента и продукты, очищенные этим способом -  патент 2489441 (10.08.2013)
Наверх