способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом

Формула изобретения

Способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом, характеризующийся тем, что в течение времени, не превышающем 15 с, производят забор образцов из пораженного участка кожи и без предварительной обработки замораживают в жидком азоте, после этого образцы измельчают, не допуская размораживания, из проб выделяют суммарные клеточные водорастворимые белки с использованием лизирующего буфера, содержащего 50 мМ HEPES, рН 7,4; 5 мМ CHAPS, 5 мМ DTT в течение 1 ч при +4°С, лизированную смесь центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин, отбирают супернатант и определяют количество суммарного белка методом Бредфорда, затем определяют активность каспазы-3 колориметрическим методом путем определения одного из продуктов реакции между каспазой-3 и пептидом ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп п-нитроанилин (Ac-DEVD-pNA)-п-нитроанилина, для чего в лунку 96-луночного планшета вносят 85 мкл Assay buffer: 20 мМ HEPES, рН 7,4; 2 мМ EDTA, 0,1% CHAPS, 5 мМ DTT и 5 мкл клеточного лизата, добавляют 10 мкл субстрата каспазы-3: 20 мМ Ac-DEVD-pNa в ДМСО в каждую лунку и инкубируют смесь 90 мин при 37°С, затем измеряют оптическую плотность (OD) при 405 нм в каждой из лунок на ELISA ридере, после чего рассчитывают активность каспазы-3 по формуле: активность, мкМ pNA/мин/мл=(OD·d)/(t·v· ), на мкг суммарного белка, где OD - оптическая плотность, d - фактор разбавления, t - время реакции в мин, v - объем пробы в мл, -10,5 мМ, при этом одна единица активности фермента равна расщеплению 1 мкмоль субстрата Ас-DEVD-pNA за 1 мин при рН 7,4 и 25°С, по значению полученной величины оценивают состояние апоптической системы в участках пораженной кожи больных псориазом, причем при нормальном значении этого показателя - 0,5-0,6 ед./мкг белка состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при повышении его более чем на 30-40% по сравнению с нормальным значением этого показателя у здоровых людей - как активированное.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для изучения патогенетических механизмов развития псориаза с целью разработки алгоритма диагностики и лечения заболевания, а также в молекулярной биологии и биохимии.

Псориаз является заболеванием с недостаточно изученной этиологией и патогенезом, что обуславливает поиск ключевых механизмов, характеризующих патологические процессы, происходящие в коже при этом заболевании, для подбора адекватных методов лечения.

В последние годы установлено, что нарушение состояния апоптической системы, сопровождающее различные патологические процессы, происходит также при псориазе, в связи с чем стал активно обсуждаться вопрос о нарушении процесса апоптоза в коже при псориазе, одним из ведущих механизмов которого является нарушение активности белков каспаза-14 и каспаза-3. Энзим каспаза-3 является основным медиатором активации процесса апоптоза в коже и считается основным звеном патогенеза псориаза (Porter A.G. and Janicke, R.U. Emerging role of caspase-3 in apoptosis (review). // Cell Death Differ., 6, 99-104 (1999).

В связи с этим задача разработки адекватного, доступного и информативного способа оценки активности апоптических реакций в коже при псориазе по уровню энзима каспаза-3 в коже больных с целью выбора патогенетически обоснованной тактики диагностики и лечения является актуальной.

Известен способ оценки апоптической системы путем определения уровня белка каспаза-3 в культуре клеток млекопитающих (Nicholson D.W., et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis // Nature, 376, 37-43 (1995), включающий определение содержания белка каспаза-3 по ее субстратной активности колориметрическим методом. Сущность метода заключается в колориметрическом определении продуктов гидролиза субстрата ферментом.

Однако указанный способ апробирован и применен только на культуре клеток HeLa млекопитающих, что не позволяет считать полученные данные диагностически точными и достоверными, так как культура клеток млекопитающих по своим характеристикам значительно отличается от ткани человека.

Известен способ оценки состояния апоптической системы по содержанию белка каспаза-3 в участках нормальной кожи здоровых людей (Jian-Zhong Qin, Vijaya Chaturvedi, Mitchell F Denning, Patricia Bacon, Jeffry Panella, Divaker Choubey, Brian J Nickoloff. Pegulation of apoptosis by p 53 in UV-irradiated human epidermis, psoriatic plaques and senescent keratinocytes. Oncogene (2002) 21, 2991-3002). Способ заключается в выявлении активированных форм каспазы-3 в кератиноцитах по их цитоплазматическому окрашиванию, с использованием иммунологического окрашивания и последующей рутинной световой микроскопией образцов. На образцах биопсии нормальной кожи проводят постановку иммунохимической реакции и последующую флуоресцентную микроскопию препаратов. Полученные образцы заливают в парафин. Серийные образцы наклеивают на предметные стекла, удаляют парафин и производят дегидратацию ксололом. После инактивации 0,3% гидрогенной пероксидазой в кислом растворе буферного фосфата предметные стекла проинкубируют с 1% бычьим сывороточным альбумином и затем инкубируют с моноклональными античеловеческими каспаза-3 антителами, разбавляя 1:200 при 4°С в течение ночи. Реакцию производят стандартным методом, используя 1:350 раствор козьего антимышиного IgG. Визуализацию реакции с диаминабензидином проводят при помощи контрастирующего окрашивания метиленовым зеленым. При этом устанавливают распределение каспазы-3 в коже, по которому судят об активности процесса апоптоза. Повышенная экспрессия протеина каспазы-3 свидетельствует об активации процесса апоптоза в коже.

Известный способ используют для изучения роли апоптической системы в патогенезе заболеваний кожи, в частности в патогенезе опухолевых.

Недостатком способа является его недостаточная точность, так как определение каспазы-3 проводится в участках здоровой кожи. Отсутствие количественных критериев также не отражает состояние апоптической системы в коже, что не позволяет определить степень выраженности апоптического процесса и выработать адекватную тактику лечения. Кроме того, способ является сложным и трудоемким, требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов.

В качестве ближайшего аналога принят способ оценки состояния апоптической системы в коже больных псориазом (Walsh DS, Borke JL, Singh BB, Do NN, Hsu SD, Balagon MV, Abalos RM. Psoriasis is characterized by altered epidermal expression of caspase 14, a novel regulator of keratinocyte terminal differentiation and barrier formation // J Dermatol Sci. 2005 Jan; 37 (1): 61-63), включающий определение содержания белка каспаза-14 в коже больных псориазом с помощью вестерн-блот гибридизации.

Суть метода состоит в первоначальной экспрессии белков из биоптатов кожи с помощью лизирующего буфера с последующим проведением электрофореза в акриламидном геле, переносом на нитроцеллюлозную мембрану и окрашиванием мембраны специфическими антителами.

Известный способ используют для изучения фундаментальных вопросов патофизиологических механизмов развития заболевания кожи. Его недостатком является то, что он не отражает состояние апоптической системы кожи, так как каспаза-14 не является ключевым ферментом, участвующим в процессе апоптоза в коже. Кроме того, не проводят количественное определение уровня каспазы-14. Метод является достаточно дорогим, трудоемким и длительным в исполнении.

Задачей изобретения является создание эффективного, простого и точного способа определения состояния апоптической системы в коже больных псориазом.

Сущность изобретения состоит в том, что способ оценки состояния апоптической системы в коже у больных псориазом характеризуется тем, что в течение времени, не превышающем 15 секунд, производят забор образцов из пораженного участка кожи и без предварительной обработки замораживают в жидком азоте, после этого образцы измельчают, не допуская размораживания, из проб выделяют суммарные клеточные водорастворимые белки с использованием лизирующего буфера, содержащего 50 mM HEPES, рН 7.4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT в течение 1 часа при +4°С, лизированную смесь центрифугируют при 10000 g в течение 10 минут, отбирают супернатант и определяют количество суммарного белка методом Бредфорда, затем определяют активность каспазы-3 колориметрическим методом путем определения одного из продуктов реакции между каспазой-3 и пептидом ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп п-нитроанилин (Ac-DEVD-pNA) - п-нитроанилина, для чего в лунку 96-луночного планшета вносят 85 мкл Assay buffer: 20 mM HEPES, рН 7.4, 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, 5 mM DTT и 5 мкл клеточного лизата, добавляют 10 мкл субстрата каспазы-3: 20 mM Ac-DEVD-pNa в ДМСО в каждую лунку и инкубируют смесь 90 мин при 37°С, затем измеряют оптическую плотность (OD) при 405 нм в каждой из лунок на ELISA ридере, после чего рассчитывают активность каспазы-3 по формуле:

активность, мкМ pNA/мин/мл=(OD*d)/(t*v* ), на мкг суммарного белка, где:

OD - оптическая плотность,

d - фактор разбавления,

t - время реакции в мин,

v - объем пробы в мл,

- 10,5 мМ,

при этом одна единица активности фермента равна расщеплению 1 мкмол субстрата Ac-DEVD-pNA за 1 минуту при рН 7.4 и 25°С;

по значению полученной величины оценивают состояние апоптической системы в участках пораженной кожи больных псориазом, причем при нормальном значении этого показателя - 0,5-0,6 ед/мкг белка состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при повышении его более чем на 30-40% по сравнению с нормальным значением этого показателя у здоровых людей - как активированное.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Способ позволяет объективно и точно определить уровень главного апоптического белка - каспазы-3 в поврежденной коже в очагах псориаза по ее субстратной активности, оценить по этим показателям степень выраженности патологического процесса, чувствительности кожи непосредственно в очагах псориаза к действию экзогенных повреждающих факторов и подобрать индивидуальную, адекватную данному состоянию кожи терапию, направленную на снижение скорости апоптических реакций и соответственно активности патологического процесса.

Весь процесс диагностики, включая забор ткани, занимает несколько часов. Способ прост в исполнении, очень чувствителен и информативен. Он не требует дорогостоящего оборудования.

Способ может быть эффективно использован не только в биохимической, но и в любой клинической лаборатории, позволяя решить вопрос об адекватной оценке состояния апоптической системы в образцах кожи при псориазе, что позволяет наиболее объективно выбрать способ лечения и методику его проведения в каждом конкретном случае.

Технический результат достигается за счет того, что авторы впервые определяют состояние апоптической системы у больных псориазом по уровню каспазы-3 непосредственно в поврежденной коже в очагах псориаза, что позволяет получать точные, высокоинформативные, объективные показатели активности апоптической системы, выраженные в количественных критериях, по их значению оценить степень активности патологического процесса и на основании этого выбрать оптимальную тактику лечения, включающую патогенетически обоснованную антиапоптическую терапию.

Для реализации способа впервые использован метод колориметрического анализа для определения энзима каспаза-3 в коже при псориазе. Именно в пораженных участках кожи уровень каспазы-3 максимально точно отражает состояние апоптической системы кожи человека.

Новым является также режим замораживания и измельчения образцов кожи, отработанный авторами на лабораторных животных (мышах) с целью получения максимально возможного выхода белка каспазы-3, который позволяет проводить статистически достоверный и воспроизводимый эксперимент.

Таким образом, впервые предложен точный и информативный, адекватный состоянию патологически измененной ткани способ оценки состояния системы апоптоза в коже у больных псориазом, который основан на определении уровня каспазы-3 по субстратной активности в пораженной коже в очагах псориаза.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят забор образцов - биоптатов кожи больного псориазом из пораженного участка (Sambrook J. And D.W. Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (2001) 3 ^rd edition). Под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника препарируют образцы пораженной кожи и быстро их замораживают в жидком азоте вплоть до определения биохимических параметров. Время от начала процедуры забора образцов до замораживания не должно превышать 15 секунд. Взятые пробы взвешивают и измельчают в ступке, не допуская размораживания образца.

Из полученных проб выделяют белок каспаза-3 с использованием 100 мкл лизирующего буфера (50 mM HEPES, рН 7.4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT), в течение 1 часа при +4°С. После лизирования смесь центрифугируют при 10000 g в течение 10 минут. Отбирают супернатант и определяют количество суммарного белка методом Бредфорда. (Bradford М.М. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. - Volume 72, Pages 248-254).

Затем определяют активность каспазы-3 колориметрическим методом.

Метод базируется на субстратной специфичности каспазы-3 к пептиду ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп п-нитроанилин (Ac-DEVD-pNA) и колориметрическом определении одного из продуктов реакции (п-нитроанилин, p-NA) при длине волны, равной 405 нм.

где: Ac-DEVD-pNA - пептид ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп п-нитроанилин,

Ac-DEVD-pNA - ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп,

p-NA-п-нитроанилин.

Для этого в лунку 96-луночного планшета вносят 85 мкл Assay buffer (20 mM HEPES, рН 7.4, 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, 5 mM DTT) и 5 мкл клеточного лизата. В качестве отрицательного контроля используют 5 мкл лизирующего буфера.

Реакцию запускают добавлением 10 мкл субстрата каспазы-3 (20 mM Ac-DEVD-pNa в ДМСО) в каждую лунку. Смесь инкубируют 90 мин при 37°С.

Далее измеряют оптическую плотность (OD) при 405 нм в каждой из лунок на ELISA ридере.

Активность каспазы-3 рассчитывают по формуле:

Активность, мкМ pNA/мин/мл=(OD*d)/(t*v* ) на мкг суммарного белка, где:

OD - оптическая плотность,

d - фактор разбавления,

t - время реакции в мин,

v - объем пробы в мл,

- 10,5 мМ,

при этом одна единица активности фермента равна расщеплению 1 мкмол субстрата Ac-DEVD-pNA за 1 минуту при рН 7,4 и 25°С.

Указанная формула является универсальной и используется для определения активности белков.

По значению полученной величины оценивают состояние апоптической системы в участках пораженной кожи больных псориазом.

При нормальном значении этого показателя - 0,5-0,6 ед/мкг белка состояние апоптической системы оценивают как стабильное, а при увеличении его более чем на 30-40% по сравнению с нормальным значением этого показателя (контрольным) у здоровых людей состояние апоптической системы оценивают как активированное.

Полученные диагностические критерии позволяют выбрать патогенетически обоснованную терапию, включающую антиапоптические препараты. Дозы и схему назначения антиапоптических препаратов подбирают индивидуально, в зависимости от степени активности каспазы-3 в участках пораженной кожи при псориазе.

Способ испытан на базе Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН на 17 больных псориазом, из них 10 мужчин и 7 женщин в возрасте от 16 до 53 лет и давностью заболевания от 1 до 12 лет. У всех больных выявлена повышенная активность каспазы-3 в очагах псориаза, что позволяет предположить его ведущую роль в развитии этого дерматоза.

Пример 1. Больная А., 41 года, страдает распространенным псориазом в течение последних 3 лет. Под местной анестезией у больной из лопаточной области взяли биоптаты пораженного участка кожи. Образцы пораженной кожи немедленно заморозили в жидком азоте. Взятые образцы измельчили, не допуская размораживания образца. Затем выделили белки из пробы, добавив в пробирку с пробой 100 мкл лизирующего буфера, содержащего 50 mM HEPES, рН 7.4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT в течение 1 часа при +4°С, лизированную смесь центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут, после чего отобрали супернатант и определили количество суммарного белка методом Бредфорда. Затем в лунку 96-луночного планшета внесли 85 мкл Assay buffer buffer (20 mM HEPES, рН 7.4, 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, 5 mM DTT) и 5 мкл клеточного лизата, добавили 10 мкл субстрата каспазы-3 (20 mM Ac-DEVD-pNa в ДМСО) в каждую лунку и инкубировали смесь 90 мин при 37°С. Далее измерили OD при 405 нм в каждой из лунок на ELISA ридере. Значение OD до лечения составило 14.2 (опт.ед.).

Активность каспазы-3 рассчитали по формуле:

Активность, мкМ pNA/мин/мл=(OD*d)/(t*v* ), на мкг суммарного белка и составила 1,057 ед/мкг белка.

В результате проведенных реакций и расчетов определили, что у данной пациентки в участке поврежденной кожи активность каспазы-3 повышена по сравнению с референтными значениями. Эти данные свидетельствуют об активации процесса апоптоза в поврежденной коже в очаге псориаза, для коррекции которого рекомендовано назначение препаратов, обладающих антиапоптиеским эффектом.

После проведения курса терапии, по достижении клинической ремиссии псориатического процесса, уровень активности каспазы-3 понизился до 0,654 ед/мкг белка, что приблизилось к нормальным значениям этого показателя. Таким образом, указанный клинический пример демонстрирует диагностическую эффективность и точность способа, значимость определения активности каспазы-3 в участках поврежденной кожи больных псориазом с целью определения активности апоптической системы.