Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

способ получения биоматериалов из костной ткани и полученный этим способом материал для остеопластики и тканевой инженерии

Классы МПК:A61L27/24 коллаген
A61L27/36 содержащие ингредиенты неопределенного строения или их реакционные продукты
A61K35/32 кости; сухожилия; зубы; хрящи
Автор(ы):
Патентообладатель(и):Саващук Дмитрий Алексеевич (RU),
Панасюк Андрей Федорович (RU)
Приоритеты:
подача заявки:
2005-10-27
публикация патента:

Изобретение относится к медицине. Описан способ получения биоматериалов, заключающийся в том, что после очистки кость природного происхождения распиливают на пластины толщиной от 0,2 до 2,0 см, отмывают нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером pH 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,1-0,4% папаина при 65°С в течение 24 часов, затем пластины промывают 5-ю объемами воды при 40-80°С, обрабатывают раствором 0,4 N щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 часов, отмывают проточной водой, обезжиривают в смесях этанол/хлороформ сначала в соотношении 1:2, а затем в соотношении 2:1, проводят декальцинацию в 0,4-1 N соляной кислоте, обрабатывают 1,5-3% перекисью водорода в течение 4 часов, отмывают водой очищенной, затем этанолом, высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют. Материал для остеопластики и тканевой инженерии представляет собой соединение, в котором сохранена нативная пространственная организация коллагенового матрикса и минеральная составляющая костной ткани природного происхождения, содержащее 25% коллагена и 75% минерального вещества. По данным анализа сухого материала он содержит менее 1% неколлагеновых белков. 2 н.п. и 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к биохимии и технологии выделения биологических веществ, а также для изготовления биоматериалов, которые применяются в качестве пластического материала при оперативном замещении костных дефектов при деструкции костной ткани, удалении кист, опухолей, а также в качестве носителя активных веществ и лекарственных средств, в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани.

Кость является живой тканью, в которой происходит постоянный процесс реорганизации, включающий одновременное разрушение и восстановление костного материала. В ходе нормального процесса, а также при имплантации постороннего материала ремодулируется старая ткань, на ее месте образуется новая ткань. Между количеством перестраиваемой кости и вновь образованной кости постоянно поддерживается равновесие. Этот процесс будет идти легче, если имплантированный материал по своей структуре более близок к обычной кости.

По этой причине в настоящее время предпочитают готовить материал заменителя из тканей естественной кости, которая по этическим и практическим причинам должна быть животного происхождения.

Хорошо известно, что вживлению костного трансплантанта способствует частичная деминерализация. Вслед за этим следуют различные дополнительные шаги, которые предназначены или для полной депротеинизации кости, или для воздействия на природу протеинов, которые остаются связанными в костной основе, или для увеличения этой доли протеинов.

Что касается методов, применяемых до сих пор, то можно указать, в частности, на патент US № 4394370, в котором предлагается с помощью глутаральдегидного связывания, обеспечивающего поперечную связь, образовывать губчатую массу плавлением смеси, состоящей из порошка деминерализованной кости человеческого происхождения и разбавленного порошка коллагена.

В патенте US № 4743259 сочетается деминерализация соляной кислотой с обогащением протеинами, осуществляемым на первой части деминерализованной кости с помощью протеинов, экстрагированных из второй части с помощью гуанидина.

Более того, в заявке на получение патента FR №2582517 предлагается подвергать обработке обломки кости, взятые у животных, точнее у домашнего скота, путем частичной деминерализации и дубления с помощью глутаральдегида. Элементы кости, которые должен имплантировать хирург, вырезают с приданием нужной формы из костей крупного рогатого скота, предварительно подвергнутых обработке, включающей операцию делипидации или обезжиривания с помощью органического растворителя, такого как этанол, операции деминерализации с помощью средства экстрагирования кальция, такого как соляная кислота, и операции, предусматривающей дубление глутаральдегидом, а также различных операций по промывке.

Из описания патентов, указанных выше, очевидно, что упоминаемый процесс дубления оказывает благоприятное воздействие на свойства обработанной кости постольку, поскольку он облегчает поперечную связь макромолекулярных цепей. Однако в последнее время обнаружено, что в отличие от высказывавшихся ранее предположений обработка глутаральдегидов не ведет к значительному снижению иммуногенных свойств и, кроме того, приживление имплантированной кости не происходит в той степени, которая была бы желательна. Кроме того, химические соединения типа глутаральдегида имеют тот недостаток, что являются биологически токсичными.

Известен способ получения материала для остеопластики из костной ткани природного происхождения, включающий последовательное удаление липидов из природной костной ткани с помощью органического раствора, селективную экстракцию с последующей промывкой и лиофилизацией конечного продукта, отличающийся тем, что селективную экстракцию выполняют с помощью раствора мочевины для денатурирования и удаления антигенных протеинов с сохранением неденатурированного коллагена типа I в природной форме, находящейся в исходной минеральной костной структуре, и полученную структуру направляют на промывку и лиофилизацию (RU №2104703, А61К 35/32, опубл. 20.02.1998).

При этом удаление липидов проводят органическим раствором, содержащим на 1 ч. кости 10 объемов смеси хлороформ/метанол или этанол/дихлорметан при соотношении соответственно 2:3-1:3. Этап деминерализации костной ткани проводят раствором соляной кислоты с молярностью 0,1-1,0 М после обработки удаления липидов. Перед селективной экстракцией осуществляют экстракцию ионным растворителем, в частности, с помощью хлорида натрия.

Селективную экстракцию проводят 2 - 10 М раствором мочевины, предпочтительно 5 - 8 М раствором или водным раствором мочевины, содержащим 0,1-0,5 об.% меркаптоэтанола. Промывку проводят с помощью дистиллированной воды при 30-60°С, предпочтительно 45-55°С. Или селективную экстракцию осуществляют сначала с помощью раствора мочевины, имеющего концентрацию между 2 и 10 М, преимущественно между 5 и 8 М, затем, после промывки, с помощью водного раствора мочевины, содержащего меркаптоэтанол в количестве между 0,1 и 0,5 об.% в растворе.

Полученный таким способом материал для остеопластики представляет собой соединение, в котором сохранена костная структура природного происхождения, содержащая неденатурированный коллаген типа 1 20-40%, а именно порядка 25-35%. По данным анализа сухого материала он содержит липиды в количестве менее 15%, протеины в количестве между 25 и 45%, кальций в количестве 10-30%, фосфор в количестве 5-20%, содержащие воды в нем ниже 10%, соотношение Са/Р преимущественно находится между 1 и 2,2.

Материал находится в форме параллелепипедных блоков, усеченных пирамид, пластинок, дисков, или порошка, или порошка, амальгамированного с помощью связующего, которое может быть преимущественно биологического происхождения, такого как фибрин, или синтетического происхождения, такого как, например, синтетический биоразлагаемый полимер.

Данное изобретение выбрано в качестве прототипа как для способа, так и для материала, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.

Недостатками указанного способа является то, что такая обработка хотя и сохраняет костный коллаген 1 типа в природной форме, но не обеспечивает полного освобождения данной ткани от антигенов - неколлагеновых белков, липидов, липопротеидов и других веществ, которые снижают биосовместимость получаемого материала.

Задачей изобретения является повышение качества получаемого из костной ткани биоматериала, содержащего гидроксиапатит и/или костный коллаген, и получение на его основе материалов для использования в стоматологии, травматологии и ортопедии путем сохранения нативной структуры костного коллагена и пространственной организации костной ткани, необходимой для ее последующей клеточной колонизации, повышения приживляемости таких биоматериалов за счет снижения их антигенных характеристик, повышения биосовместимости и биоинтеграции.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение сохранного по архитектонике костного биоматериала и чистого костного коллагена, являющихся низкоантигенными материалами, которые могут широко использоваться для получения изделий медицинского назначения, таких как материалы для замещения костных дефектов, а также в качестве носителя биологически активных веществ и клеток, и являться основой для других изделий медицинского назначения.

Указанный технический результат в части способа достигается тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,2 до 2,0 см, отмывают нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,1-0,4% папаина при 65°С в течение 24 часов, затем пластины промывают 5-ю объемами воды при 40-80°С (предпочтительно 50-60°С), обрабатывают раствором 0,4 N щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 часов, отмывают проточной водой, обезжиривают в смесях этанол/хлороформ в соотношении 1:2 и 2:1, проводят декальцинацию в 0,4-1 N соляной кислоте, обрабатывают 1,5-3% перекисью водорода в течение 4 часов, отмывают водой очищенной, затем этанолом, высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют.

В части материала указанный технический результат достигается тем, что в материал для остеопластики и тканевой инженерии, полученный по этому способу, представляет собой соединение, в котором сохранена нативная пространственная организация коллагенового матрикса и минеральная составляющая костной ткани природного происхождения, содержащее 25% коллагена и 75% минерального вещества. По данным анализа сухого этот материала содержит менее 1% неколлагенновых белков.

Материалом для получения костного коллагена и изделий на его основе может являться губчатая или кортикальная кость человека или позвоночных животных, например свиней, баранов, кур, гусей и т.д. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью, а также высокой устойчивостью к действию коллагеназы. Этот тип коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани организма.

Указанные признаки как для способа, так и для материала существенные и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Ниже рассматривается техническое существо способа согласно настоящему изобретению и характеристики полученного этим способом материала для остеопластики и тканевой инженерии.

Технология приготовления заявляемых согласно настоящему способу биоимплантатов требует начальной механической обработки ткани, когда кость очищается от остатков мягких тканей и крови.

Существенным признаком изобретения является порядок обработки кости. После механической обработки ткань распиливают на пластины толщиной не менее 0,2 см и не более 2,0 см, поскольку эти размеры являются наиболее оптимальными при обработке данной ткани растворами. Минимальный размер пластин толщиной от 0,2 см и максимальный 2,0 см определены нами опытным путем. Так, при увеличении толщины пластины возникают трудности с доступностью фермента и других растворов к активным местам субстрата, а также при отмывке таких пластин от применяемых по технологии растворов. При уменьшении толщины пластин возникают серьезные проблемы с сохранением целостности костного коллагена и пространственной структуры костной ткани в процессе обработки материала.

После нарезки ткань промывают 2-кратным объемом нагретого до 65°С 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8 до 6,0. Именно отмывка в нагретом до 65°С буфере предшествует перевариванию ферментом и создает оптимальные условия для последующего действия фермента папаина, существенно сокращая время инкубации с ферментом при данных значениях рН.

При данных условиях фермент способен эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопротеины костной ткани, тогда как волокна костного коллагена полностью экранированы слоем гидроксиапатита, и поэтому при переваривании в условиях повышения температуры до 65°С костные коллагеновые волокна не подвергаются денатурации и деструкции, сохраняя свою нативную структуру. Это отчетливо видно по выходу в перевар сульфатированных гликозаминогликанов и аминокислот.

В зависимости от структуры костной ткани и ее толщины берется различная концентрация фермента. Так, при толщине губчатой кости в 0,2 см для переваривания достаточна концентрации 0,1% активированного папаина, а при толщине губчатой кости 2,0 см или в случае обработки кортикальной кости концентрация папаина увеличивается до 0,4%.

Оптимальное действие папаина на костную ткань при переваривании белков и протеогликанов составляет 24 часа при 65°С. При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг костей в перевар выделяется около 2 г гликозаминогликанов, что практически равно теоретически рассчитанному количеству сГАГ для данного типа ткани (Chvapil М., Physiology of connective tissue., Butterworths, London, 1967, p.67-70).

Отмывку костных пластин после переваривания их ферментом проводят 5-ю объемами проточной воды, нагретой до 40-80°С (предпочтительно 50-60°С). Эта операция позволяет удалить все продукты реакции субстрата с ферментом, сам фермент и основную часть жиров (более 90%).

Эффективное разрушение жиров и возможно оставшихся неколлагеновых белков достигается воздействием щелочи на недекальцинированную костную ткань. Обработку костной ткани 0,4 Н NaOH (гидроксидом натрия) проводят в течение от 10 до 24 часов при комнатной температуре. Известно, что щелочь является очень эффективным агентом, разрушающим белковые соединения, а также бактериальные и вирусные частицы, которыми может быть заражена костная ткань. Эта стадия должна проводиться при комнатной температуре (18-20°С), т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры может разрушаться структура как самой коллагеновой молекулы, так и коллагенового матрикса. Как и в случае с ферментом, исходная минеральная костная структура, которая покрывает коллагеновый матрикс кости, не позволяет раствору 0,4 Н щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24-часового воздействия.

Губчатую кость с размером пластин 0,2-0,5 см обрабатывают в течение 10 часов, так как за это время белковые молекулы, находящиеся на поверхности коллагеновых волокон, полностью разрушаются. Более толстые пластины губчатой кости и фрагменты кортикальной кости требуют 24-часового воздействия щелочи. После этого времени в смывах с ткани белок не обнаруживается.

После обработки щелочью кость отмывают в 5-ти сменах проточной воды и пластины высушивают при комнатной температуре.

В отличие от всех известных способов получения биоматериалов из кости, в настоящем способе начальную обработку - отмывку и ферментативное воздействие - ведут при высоких температурах (65°С), но при этом не происходит нарушения коллагеновой молекулы и коллагенового матрикса в целом. Кроме того, к обезжириванию и декальцинации кости по данному способу приступают только после ее обработки ферментом и щелочью постольку, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген благодаря покрывающему костное волокно защитному слою гидроксиапатита остается практически неизмененным.

В костной ткани содержится значительное количество жиров и их соединений с белками и углеводами. В обработанных ферментом костных пластинах липиды находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления всех оставшихся липидов в способ введена обработка костных пластин в смесях хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1 и 1:2 на стадии, когда основная костная строма уже очищена от других ее составляющих. Обработку в смеси проводят по 2 раза по 24 часа в каждой смеси до полного удаления липидов, что оценивается по содержанию жиров в 1 г сухой ткани. Данный этап позволяет обеспечить высвобождение липидов даже из плотной костной ткани (кортикальная кость). После такой обработки их выход из ткани полностью прекращается и содержание в материале не превышает 1%. После обезжиривания костные пластины высушивают и проводят декальцинацию в растворах минеральных кислот. Как правило, тонкие пластины губчатой кости обрабатывают раствором 0,4 Н соляной кислоты (HCl), а более толстые, начиная с 1 см, в 1Н HCl, и процесс продолжается до полного исчезновения в декальцинирующем растворе ионов Са++. Процесс декальцинации костного материала может либо совсем не проводиться, либо степень деминерализации материала может быть строго программирована. Аналитическое исследование способа получения материала без проведения деминерализации показало, что получаемый материал имеет классические показатели костной ткани: 25% коллагена и 75% минерального вещества. При этом не только структурный коллаген не подвергается воздействию, но остается полностью сохраненной пространственная организация коллагенового матрикса и минеральной составляющей костной ткани. Полученный материал отличается от всех материалов, применяемых в настоящее время для остеопластики, как своим составом и эксплуатационными характеристиками, так и полным отсутствием неколлагеновых составляющих и антигенных свойств. Данный материал имеет практически полную сохранность нативной пространственной структуры костной ткани, что в особенности необходимо для хорошей интеграции, биосовместимости и клеточной колонизации. Далее костный материал подвергается обработке 1,5-3% перекисью водорода в течение 4-х часов. Этот этап, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белковых молекул и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, оставшиеся липиды, труднорастворимые соли и т.д. 3% перекисью водорода, как правило, обрабатывают пластины с размером толщины более 1,0 см. После этого полученный костный коллаген отмывают в 5 сменах воды очищенной. затем отмывают этанолом, высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют.

Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики, принятые для данного типа материалов.

Отсутствие протеогликанов определяли по изменению окрашивания субстрата и в растворах спектрофотометрически в присутствии 1,9-диметиленового синего при длине волны 535 нм по методу Farndel.

Выход белка определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах методом определения оксипролина по Кьельдалю.

Наличие ионов кальция в декальцинирующих растворах определяли с помощью качественной реакции на Са2+. Контроль на липиды делали по окраске материала суданом. Сохранность структуры костного коллагена определяли путем исследования гистологических срезов, электронно-микроскопически и методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костного коллагена имеет типичный вид без каких-либо изменений и нарушений. После высушивания и стерилизации ставили контрольные измерения на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом. Так, на сухой вес материала, полученного по описанному в прототипе способу, определяется 4-5% белка, а по предлагаемому нами способу менее 1%. Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно снизить антигенность материала за счет более полного удаления липидов и неколлагеновых белков по сравнению с прототипом. Следовательно, предлагаемый способ обработки ткани позволяет сохранить нативную структуру материала, повысить его качественные характеристики, снизить антигенность материала и тем самым обеспечить хорошие пластические свойства, биоинтеграцию и биосовместимость.

Краткая технология получения материала

Прошедшую ветеринарный контроль кость свиньи очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см и помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 при 65°С на 2 часа, буфер сливают, материал снова промывают нагретым буфером и переносят в раствор активированного 0,4% папаина. Инкубацию ведут в течение 24 часов в термостате при 65°С. Затем перевар сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды, нагретой до 70°С, охлаждают до комнатной температуры и помещают на 24 часа в 0,4 Н раствор щелочи. Материал отмывают от щелочи, высушивают и дважды обрабатывают сначала в течение 48 часов смесью этанол/хлороформ в соотношении 1:2, а затем в течение последующих 48 часов смесью этанол/хлороформ в соотношении 2:1. Костные пластины снова высушивают и помещают в 1 N соляную кислоту. Смену кислоты ведут до полного исчезновения в декальцинирующем растворе ионов кальция. Кислоту отмывают водой и пластины помещают в 3% перекись водорода на 4 часа. Затем пластины отмывают водой очищенной и этанолом, материал высушивают, упаковывают и стерилизуют.

Приведенные выше действия приводят к снижению ангиогенности и сохранности структуры коллагена и костного коллагенового матрикса.

После обработки костный коллаген проходит количественный и качественный анализ, как описано выше.

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1. Донорскую кость человека, прошедшую необходимые анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,2-0,6 см, дважды по 30 минут помещают в раствор нагретого до 65°С 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,15% папаина при 65°С в термостат на 24 часа. Затем надосадок сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды при 60°С и помещают на 24 часа в 0,4 N раствор щелочи при комнатной температуре. Материал отмывают от щелочи и высушивают. Пластины помещают сначала дважды по 4 часа в смесь этанол/хлороформ (соотношение 1:2), а затем дважды в такую же смесь, но при соотношении 2:1 на 24 часа. Материал высушивают и обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 4 часов. Затем костные пластины отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом.

В случае получения костного коллагена материал после обезжиривания в органических растворителях высушивают и проводят его декальцинацию в 0,5 N соляной кислоте. Кислоту отмывают и костные пластины обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 4 часов. Материал снова отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной до 0,8 см. В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов. Полученные материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В клинических, экспериментальных и научных целях недекальцинированный костный материал и костный коллаген могут быть насыщены биологически активными веществами (сульфатированные гликозаминогликаны, факторы роста - PDGF, IGF, FGF и т.д., а также могут быть использованы в качестве носителей для разных типов клеток - стволовых, эмбриональных, клеток крови и т.д.

Пример 2. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0-2,0 см, помещают дважды по 1 часу в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 при 65°С, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,3% папаина при 65°С в термостат на 24 часа.

Перевар сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды при 70°С, охлаждают и помещают на 24 часа в 0,4 N раствор щелочи при комнатной температуре. Материал отмывают от щелочи и высушивают. Пластины помещают сначала на 4 и 24 часа в смесь этанол/хлороформ (соотношение 1: 2), а затем на следующие 4 и 24 часа в такую же смесь, но при соотношении 2:1. После обезжиривания материал высушивают и либо сразу обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 4 часов, либо проводят его декальцинацию в 1 N соляной кислоте и затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 4 часов с последующей отмывкой от кислоты. Оба вида материала отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Полученный таким образом костный матрикс и костный коллаген разрезают на фрагменты различной формы и размера: кубы, параллепипеды, шайбы, блоки и т.д., высушивают при комнатной температуре или лиофильным способом, упаковывают и стерилизуют радиационным облучением. Аналогично обрабатываются и кости различных животных и человека, когда фрагменты костей имеют толщину свыше 1 см.

В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов. Полученные материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В клинических, экспериментальных и научных целях костный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами (сульфатированные гликозаминогликаны, факторы роста - PDGF, IGF, FGF и т.д.), а также может быть использован в качестве носителя разных типов клеток - стволовых, эмбриональных и т.д.

Пример 3. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,5-2,0 см, помещают дважды по 1 часу в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 при 65°С, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,4% папаина при 65°С в термостат на 24 часа. Перевар сливают, пластины промывают 5-ю объемами воды при 80°С, охлаждают и помещают на 24 часа в 0,4 N раствор щелочи при комнатной температуре. Материал отмывают от щелочи и высушивают. Пластины помещают дважды сначала на 4 и 24 часа в смесь этанол/хлороформ (соотношение 1:2), а затем дважды на следующие 4 и 24 часа в такую же смесь, но при соотношении 2:1. Как и в предыдущем примере, материал высушивают и либо сразу обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 24 часов - остеоматрикс, либо проводят его декальцинацию в 1 N серной кислоте и только затем обрабатывают 3% перекисью водорода в течение 24 часов после отмывки от кислоты - костный коллаген. Оба вида материала отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Полученные таким образом биоматериалы разрезают на фрагменты различной формы и размера: кубы, параллепипеды, шайбы, блоки и т.д., высушивают при комнатной температуре, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Аналогично обрабатываются и кости различных животных и человека, когда фрагменты костей имеют толщину свыше 1 см. В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов. Полученные материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии.

Пример 4. Донорскую кость человека, прошедшую необходимые анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,5-0,8 см и обрабатывают, как в примере 1 до этапа декальцинации. Затем обезжиренные костные пластины высушивают и обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 6 часов. Пластины отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом. Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной 0,5-1,0 см.

В конце каждого технологического цикла проводят аналитические исследования на наличие в материале белка, протеогликанов и липидов.

Пример 5. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую или кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0-2,0 см и затем подвергают обработке, как описано в примере 2 вплоть до этапа декальцинирования. Затем обезжиренные костные пластины высушивают и обрабатывают 1,5% перекисью водорода в течение 6 часов. Пластины отмывают сначала водой очищенной, потом этанолом. Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют спиртом. Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной 0,5-1,0 см.

Настоящее изобретение промышленно применимо, освоено в лабораторных условиях, результаты которых показывают практическую ценность полученного биоматериала для остеопластики и тканевой инженерии.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения биоматериалов из костной ткани путем очистки кости природного происхождения, распиливания ее на фрагменты заданной толщины, удаления липидов из природной костной ткани, экстракции с последующей промывкой и лиофилизацией конечного продукта, отличающийся тем, что после очистки кость природного происхождения распиливают на пластины толщиной от 0,2 до 2,0 см, двухкратно отмывают нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером с pH 5,8-6,0 из расчета на одну часть кости два объема буферного раствора, переваривают в растворе активированного 0,1-0,4%-ного папаина при 65°С в течение 24 ч, затем пластины промывают 5-ю объемами воды при 40-80°С, обрабатывают раствором 0,4 N щелочи при комнатной температуре в течение 10-24 ч, отмывают проточной водой, высушивают, обезжиривают в смесях этанол/хлороформ сначала в соотношении 1:2, а затем в соотношении 2:1 из расчета два объема смеси на одну часть кости и каждый раз, меняя растворы не менее 2 раз, проводят частичную или полную декальцинацию в кислотной среде, обрабатывают перекисью водорода в течение 4 ч, отмывают при комнатной температуре от перекиси водой очищенной, затем отмывают этанолом, высушивают, упаковывают и стерилизуют.

2. Материал для остеопластики и тканевой инженерии, содержащий коллаген, отличающийся тем, что он получен по способу согласно п.1 и представляет собой соединение, в котором сохранена нативная пространственная организация коллагенового матрикса и минеральная составляющая костной ткани природного происхождения, содержащее 25% коллагена и 75% минерального вещества.

3. Материал по п.2, отличающийся тем, что он содержит по данным анализа сухого материала менее 1% неколагеновых белков.


Скачать патент РФ Официальная публикация
патента РФ № 2342162

patent-2342162.pdf
Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс A61L27/24 коллаген

Патенты РФ в классе A61L27/24:
комбинированный костный аллотрансплантат и способ его получения -  патент 2524618 (27.07.2014)
биокомпозиты и способы их получения -  патент 2500432 (10.12.2013)
искусственная твердая мозговая оболочка и способ ее производства -  патент 2491961 (10.09.2013)
способ получения пористого костного биокомпозита -  патент 2482880 (27.05.2013)
биоинженерный коллагеновый конструкт, модифицированный кишечный коллагеновый слой, переработанный тканевый матрикс и способ восстановления или замещения поврежденной ткани -  патент 2481114 (10.05.2013)
система in-situ для внутриартикулярной регенерации хрящевой и костной тканей -  патент 2451527 (27.05.2012)
тонкопленочная многоячеистая структура, изготовленная из коллагена, элемент для регенерации ткани, содержащий ее, и способ ее получения -  патент 2404819 (27.11.2010)
мембрана для использования при направленной регенерации тканей -  патент 2367475 (20.09.2009)
способ получения коллагеновых имплантатов -  патент 2360690 (10.07.2009)
биорассасываемая коллагеновая матрица, способ ее получения и применение -  патент 2353397 (27.04.2009)

Класс A61L27/36 содержащие ингредиенты неопределенного строения или их реакционные продукты

Патенты РФ в классе A61L27/36:
способ изготовления дермального матрикса -  патент 2524619 (27.07.2014)
бесклеточная органическая ткань, подготовленная для восстановления жизнеспособности и способы ее получения -  патент 2523388 (20.07.2014)
биологический перикардиальный протез клапана сердца с хитозановым покрытием и способ его получения -  патент 2519219 (10.06.2014)
способ изготовления биотрансплантатов твердой мозговой оболочки для эндоскопических вмешательств в реконструктивной хирургии -  патент 2506955 (20.02.2014)
способ повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов -  патент 2499611 (27.11.2013)
биоинженерный коллагеновый конструкт, модифицированный кишечный коллагеновый слой, переработанный тканевый матрикс и способ восстановления или замещения поврежденной ткани -  патент 2481114 (10.05.2013)
стерильный аутологичный, аллогенный или ксеногенный имплантат и способ его изготовления -  патент 2478403 (10.04.2013)
способ обработки биологической ткани животного или человеческого происхождения, как, например, свиного или бычьего перикарда или сердечных клапанов трупа человека, и соответствующим образом обработанная биологическая ткань -  патент 2456023 (20.07.2012)
способ приготовления бесклеточной органической ткани для реимплантации живых клеток и бесклеточная органическая ткань, полученная таким способом -  патент 2430745 (10.10.2011)
бесклеточный трансплантат -  патент 2404820 (27.11.2010)

Класс A61K35/32 кости; сухожилия; зубы; хрящи

Патенты РФ в классе A61K35/32:
комбинированный костный аллотрансплантат и способ его получения -  патент 2524618 (27.07.2014)
способ восстановления утраченного зуба и способ изготовления восстановительного материала -  патент 2521195 (27.06.2014)
антипролиферативное средство -  патент 2519727 (20.06.2014)
биологически активная композиция для улучшения половой функции мужчин (варианты) -  патент 2519221 (10.06.2014)
способ профилактики кариеса зубов -  патент 2518715 (10.06.2014)
способ получения костного минерального компонента и костный минеральный компонент для замещения и восстановления дефектов костной ткани -  патент 2517037 (27.05.2014)
композиция для костной пластики (варианты) -  патент 2516921 (20.05.2014)
способ получения адаптогенного препарата дорогова фракции 4 (апд-f4) и фракции 5 (апд-f5) -  патент 2509565 (20.03.2014)
способ культивирования клеток зубной пульпы и способ переноса экстрагированного зуба на хранение -  патент 2499609 (27.11.2013)
способ получения биологического гидроксиапатита -  патент 2494751 (10.10.2013)

Наверх