способ получения сибиреязвенного протективного антигена

Формула изобретения

Способ получения сибиреязвенного протективного антигена, включающий культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия, отличающийся тем, что бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма, а после окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к технологии получения сибиреязвенного протективного антигена (ПА), в частности к сибиреязвенным вакцинам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для специфической профилактики сибирской язвы.

Изобретение позволяет воспроизводимо получать нативный ПА с активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле более 100 ЕА·мл^-1, сократить время и количество технологических стадий получения стерильного концентрированного ПА.

Сибиреязвенный ПА используется для получения двух видов вакцин: сибиреязвенной очищенной адсорбированной химической и комбинированной жидкой и сухой (одним из компонентов которых он является), по иммунологическим и физико-химическим показателям, удовлетворяющим требования, предъявляемые национальным органом контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) к этим вакцинам.

Известен способ получения сибиреязвенного ПА при глубинном анаэробном культивировании штамма B.antracis на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия при аэрировании культуральной жидкости инертным газом(патент RU 2223114 C2, 10.02.2004). Данный способ используется при приготовлении вакцины сибиреязвенной очищенной адсорбированной химической жидкой, включающем в себя следующие стадии:

приготовление маточной посевной культуры производственного штамма СТИ-1;

приготовление производственной питательной среды;

получение нативной культуры штамма СТИ-1;

получение нативного ПА;

получение стерильного ПА, включающее сепарирование нативного ПА на сепараторе SA-1-02-575, концентрирование на установке УФУ-4,0, грубую, тонкую и стерилизующую фильтрацию через бумажный фильтр «синяя лента», фильтрующие мембраны МФА №2 и МФА №1;

сорбцию стерильного концентрированного ПА на геле гидроокиси алюминия;

стабилизацию раствором формалина и отмывку сорбированного ПА;

разведение сорбированного концентрированного ПА, розлив;

контроль качества полученного сорбированного концентрированного ПА.

Недостатком вышеуказанного способа является низкая воспроизводимость при получении нативного ПА в ферментерах с требуемой активностью ПА в реакции диффузионной преципитации 100 ЕА·мл^-1 и более. Кроме того, при выделении ПА из культуральной жидкости используется метод сепарирования, который по времени более длителен и имеет следующие недостатки (Отчет о НИР. Совершенствование технологии производства химической сибиреязвенной вакцины - Арх. Вч 23527 - инв. №30353, 1997. - С.28):

сложность эксплуатации (вибрация, шум, необходимость разборки и мойки) аппарата;

воздействие на микробную культуру центробежной силы, перепада давления и гидродинамического удара;

отсутствие герметизации и обеспечения асептических условий ведения процесса.

Кроме того, известно, что при выращивании микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в присутствии бикарбонат-иона, добавляемого в момент начала культивирования, нарастает доля клеток со структурными поломками гена pag в условиях несбалансированного роста (Sirard J.C., Mocr М., Fonet A. Tne three Bacillus anthracis taxin genesare coordinately regulated by bicarbonate and temperature. / J. Bacterid / - 1962/ - vol.52, p.632-645), что отрицательно сказывается на продукции антигена.

Задачей изобретения является стабильное получение нативного сибиреязвенного ПА с высокой активностью, сокращением времени получения стерильного концентрированного ПА с высокой активностью.

Поставленная задача решается изменением момента введения раствора бикарбоната натрия в процессе культивирования и получением стерильного концентрированного ПА методом ультра- и микрофильтрации.

Возможность практического использования заявляемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Изменение времени введения индуктора синтеза ПА-раствора бикарбоната натрия (NaHCO ₃).

Известно, что при выращивании микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в присутствии бикарбонат-иона, добавляемого в момент начала культивирования, нарастает доля клеток со структурными поломками гена pag в условиях несбалансированного роста (Sirard J.C., Mocr M., Fonet A. Tne three Bacillus anthracis taxin genesare coordinately regulated by bicarbonate and temperature. / J. Bacterid / - 1962 / - vol.52, p.632-645).

Для уменьшения отрицательного влияния на развитие микробной культуры в начальной фазе роста, вызываемого присутствием в ПС бикарбоната натрия, целесообразно введение индуктора (NaHCO₃ ) синтеза ПА в динамике культивирования на 6...8 час роста, что контролируется содержанием глюкозы в среде и значением рН культуральной жидкости. Бикарбонат натрия активирует экспрессию гена рад, детерминирующего синтез ПА, на поздней лаг-фазе и протяжении экспоненциальной фазы роста.

Динамика развития микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма и накопления ПА по существующему способу (на основании пяти циклов ферментации) технологии представлены в таблице 1, по заявляемому способу в таблице 2 (на основании 10 циклов ферментации).

Как видно из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, введение бикарбоната натрия на 6 часов культивирования по заявляемому способу технологии в отличие от существующего способа благоприятно сказывается на продукции ПА, антигенная активность которого к 12 часам культивирования выходит на регламентируемый показатель 100 ЕА·мл^-1, а к 19 часам роста антигенная активность возрастает до 200 ЕА·мл ^-1 и сохраняется на этом уровне до окончания процесса культивирования.

Пример 2. Выбор эффективного оборудования в процессе получения стерильного концентрированного ПА.

Использование ультра- и микрофильтрационной установки «Сартокон» в технологическом процессе выделения, стерилизации и концентрирования ПА дает возможность:

проводить технологический процесс в асептических условиях;

осуществлять стерилизацию оборудования химическим и термическим способами и их сочетанием, что соответствует требованиям GMP;

быстро заменять фильтрующие элементы в случае их выхода из строя во время проведения технологического процесса благодаря модульной системе фильтров установки «Сартокон».

Заявляемый способ получения стерильного концентрированного ПА с использованием установки «Сартокон» при проведении процесса микро- и ультрафильтрации уменьшает количество стадий с 6 до 2, сокращает время выделения ПА из культуральной жидкости и всего цикла в целом по сравнению с существующим способом и включает в себя:

выделение ПА из культуральной жидкости и одновременную его стерилизацию;

концентрирование стерильного ПА.

Технологические характеристики проведения процесса концентрирования ПА по существующему и заявленному способам технологии представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, применение микро- и ультрафильтрационной установки «Сартокон» по заявленному способу в значительной степени уменьшает время выделения ПА из культуральной жидкости и всего технологического процесса в целом по сравнению с существующим способом технологии.

Таблица 1
Динамика развития микробной культуры по существующему способу, n=5
Определяемый показатель	Время выращивания, ч
	0	9	12	15	18	20
рН, ед. рН	8,4	8,1	7,7	7,6	7,4	7,0
Биомасса, ед. экс.	60	250	280	350	560	1300
Утилизация глюкозы, %	0	5	18	28	43	68
Антигенная активность в РДП, ЕА. мл -1	0	25	25	25...50	25...50	25...100

Таблица 2
Динамика развития микробной культуры по заявляемому способу, п=10
Определяемый показатель	Время выращивания, ч
	0	6	12	19
рН, ед. рН	7,7	7,2/7,9*	7,6	7,4
Биомасса, ед. экс.	75	650	1480	1860
Утилизация глюкозы, %	0	16	79	100
Антигенная активность в РДП, ЕА. мл-1	0	0	50...100	100...200
Примечание: * - значение рН культуры до и после внесения бикарбоната натрия.

Таблица 3
Временные характеристики технологического процесса по существующему и заявляемому способу, n=3
Стадии технологического процесса по существующему способу	Время проведения процесса по существующему способу, мин	Стадии технологического процесса по заявляемому способу	Время проведения процесса по заявляемому способу, мин
Выделение ПА из культуральной жидкости методом сепарирования на «Westfalia» SA-02-575	90±10	Выделение ПА из нативной культуры и одновременная его стерилизация методом микрофильтрации на установке «Сартакон-2»	40±10
Концентрирование нативного ПА на установке УФС -0,4	90±20	Концентрирование стерильного ПА методом ультрафильтрации на установке «Сартакон-2».	40±10
Грубая фильтрация (колба Бунзена)	120±10	отсутствует	отсутствует
Тонкая фильтрация, фильтр МФА-А №2	60±10	отсутствует	отсутствует
Стерилизующая фильтрация, фильтр МФА-А №1	60±10	отсутствует	отсутствует
Общее время проведения по существующему способу составляет 420±20 минут		Общее время проведения заявляемого способа составляет 80±10 минут