сор1 для лечения воспалительных заболеваний кишечника

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для подавления потери массы, индуцирования восстановления массы или уменьшения макроскопического повреждения толстой кишки у субъекта с воспалительным заболеванием кишечника, содержащая активный агент, выбранный из группы, состоящей из сополимера 1, сополимер 1-родственного полипептида и сополимер 1-родственного пептида, и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция для уменьшения макроскопического повреждения толстой кишки у субъекта с воспалительным заболеванием кишечника, содержащая активный агент, выбранный из группы, состоящей из сополимера 1, сополимер 1-родственного полипептида и сополимер 1-родственного пептида, и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Фармацевтическая композиция по п.1 для подавления потери массы, индуцирования восстановления массы и уменьшения макроскопического повреждения толстой кишки у субъекта с воспалительным заболеванием кишечника.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где макроскопическое повреждение толстой кишки определяется как макроскопический параметр, выбранный из группы, состоящей из степени изъязвления толстой кишки, степени выраженности кишечных и брюшинных спаек, степени выраженности диареи и степени утолщения стенки кишечника.

5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, для уменьшения степени изъязвления толстой кишки, степени выраженности кишечных и брюшинных спаек, выраженности диареи и степени утолщения стенки кишечника у субъекта с воспалительным заболеванием кишечника.

6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где указанным воспалительным заболеванием кишечника является болезнь Крона.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где указанным воспалительным заболеванием кишечника является язвенный колит.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где указанным активным агентом является сополимер 1.

9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где указанным активным агентом является сополимер 1-родственный пептид или сополимер 1-родственный полипептид.

10. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3 для орального введения.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3 для введения внутримышечно, подкожно, интрадермально или путем ингаляции.

12. Применение активного агента, выбранного из группы, состоящей из сополимера 1, сополимер 1-родственного полипептида и сополимер 1-родственного пептида, для подавления потери массы, индуцирования восстановления массы или уменьшения макроскопического повреждения толстой кишки у субъекта с воспалительным заболеванием кишечника.

13. Применение по п.12, где указанным воспалительным заболеванием кишечника является болезнь Крона.

14. Применение по п.12, в котором указанным воспалительным заболеванием кишечника является язвенный колит.

15. Применение по любому из пп.12-14, в котором указанным активным агентом является сополимер 1.

16. Применение по любому из пп.12-14, в котором указанным активным агентом является сополимер 1-родственный пептид или сополимер 1-родственный полипептид.

17. Применение по любому из пп.12-14 путем орального введения.

18. Применение по любому из пп.12-14 путем инъекционного введения.

19. Применение по любому из пп.12-14 путем введения внутримышечно, подкожно, интрадермально или путем ингаляции.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям и способам лечения воспалительных заболеваний кишечника (IBD), в частности болезни Крона и язвенного колита.

Уровень техники

Название "воспалительные заболевания кишечника (IBD)" дано группе родственных заболеваний, поражающих желудочно-кишечный тракт, главным образом, болезни Крона и язвенному колиту, двум тяжелым желудочно-кишечным расстройствам, встречающимся с высокой частотой (более одного из 500 американцев имеют какой-либо тип воспалительного заболевания кишечника), делающим неработоспособными многих пациентов и создающим значительное бремя для системы здравоохранения. У пациентов может быть диарея, тошнота, рвота, спастические боли в животе и боль, которую может быть трудно контролировать. IBD характеризуются хронической чрезмерной деструкцией ободочной кишки (при язвенном колите) или тонкого и толстого кишечника (при болезни Крона) вследствие воспаления стенки кишечника в результате воспалительного инфильтрата.

В патогенез IBD вовлечены взаимодействия микроорганизмов локального окружения, генетическая предрасположенность и иммунная система. Несколько микроорганизмов, бактерий и вирусов рассматривали в качестве этиологических агентов IBD, однако не было получено доказательства определенной роли ни для одного инфекционного агента. Новые данные свидетельствуют о существовании некоторых генов предрасположенности, и все же еще требуются обширные исследования для того, чтобы идентифицировать конкретные гены, ответственные за экспрессию таких заболеваний. Хотя природа как возможных инфекционных агентов, так и генетического изменения остается неясной, большой прогресс достигнут в понимании иммунных механизмов, ответственных за патогенез IBD, особенно болезни Крона.

Th1-клетки CD4 ⁺ были идентифицированы как главные медиаторы в патогенезе болезни Крона, проявляющие ограниченный, но варьируемый репертуар TCR. IFN- , высвобождаемый указанными Th1-клетками, активирует местные макрофаги к продукции провоспалительных цитокинов и токсичных метаболитов, в частности TNF- и оксида азота (NO), которые вызывают повреждение кишечного эпителия и поддерживают трансмуральное воспаление. Указанный хронический аномальный Th1-ответ поддерживается отменой толерантности к компонентам кишечной флоры или ее продуктам, приводя к процессу, подобному аутоиммунному. Так как конкретный аутоантиген хозяина не идентифицирован, IBD не являются истинными аутоиммунными заболеваниями. Однако вследствие своей иммунной природы IBD могут рассматриваться как таковые.

Сополимер 1 (Сор1, ацетат глатирамера или GA), непатогенный синтетический случайный сополимер, состоящий из четырех аминокислот: L-Glu, L-Lys, L-Ala и L-Tyr (в дальнейшем «Сор1» или «GA»), является недавно одобренным лекарственным средством для лечения множественного склероза под названием копаксон (Sela and Teitelbaum, 2001). Он является очень хорошо переносимым агентом только с небольшими побочными действиями и высоко безопасным профилем. Лечение с использованием Сор1 путем приема внутрь или ингаляции раскрыто в патенте США 6214791.

Недавно обнаружено, что на моделях животных Сор1 оказывает целебное действие в случае нескольких дополнительных расстройств. Сор1 соответственно подавляет иммунное отторжение, проявляющееся при заболевании «трансплантат против хозяина» (GVHD) в случае трансплантации костного мозга (Schlegel et al., 1996; US 5858964), а также отторжение трансплантата в случае трансплантации солидных органов (Aharoni et al., 2001).

В WO 01/52878 и WO 01/93893 заявлено, что Сор1, Сор1-родственные пептиды и полипептиды и активированные ими T-клетки защищают клетки ЦНС от токсичности глутамата и предотвращают или ингибируют дегенерацию нейронов или стимулируют регенерацию нервов в центральной нервной системе и периферической нервной системе. Соответственно, например, Сор1 проходит апробацию в качестве терапевтической вакцины против нейродегенеративных заболеваний, таких как оптические невропатии и глаукома (Kipnis and Schwartz, 2002).

Сор1 и родственные сополимеры и пептиды для лечения аутоиммунных заболеваний описаны в WO 00/05250 (Aharoni et al., 2000), включенной в данное описание в виде ссылки в полном объеме, как в случае полного раскрытия в данном описании. Хотя колит упоминается среди аутоиммунных заболеваний, в указанной заявке нет описания ни примера, ни протокола исследования колита.

Имеющиеся способы лечения IBD довольно неудовлетворительны. Причиняющий вред иммунный ответ по отношению к местным микроорганизмам, вовлекающий главным образом Th1-клетки CD4+, и дисбаланс между провоспалительной и противовоспалительной реактивностью играет роль в патогенезе IBD, в частности болезни Крона (CD) (MacDonald et al., 2000; Shanahan, 2001). Современные способы лечения IBD основаны на применении неспецифических противовоспалительных лекарственных средств, таких как кортикостероиды, а также иммуносупрессорных лекарственных средств (Shanahan, 2001). Однако указанные способы лечения не модифицируют течение заболевания, а только ослабляют симптомы, при этом индуцируя тяжелые побочные эффекты, которые ограничивают их применение. Кроме того, значительная доля пациентов является нечувствительной к стероидам. Потому существует реальная необходимость в новых, хорошо переносимых способах лечения, которые эффективно вызывают ремиссию и изменяют естественное течение заболевания. Основываясь на иммунопатологической природе CD, новые иммуномодулирующие способы пытаются сменить направление патогенных T-клеток CD4+ от Th1-воспалительного к Th2-противовоспалительному фенотипу (Shanahan, 2001; Sandborn and Targan, 2002; Van Deventer, 2000).

Сущность изобретения

В настоящее время обнаружено в соответствии с настоящим изобретением, что лечение мышей в случае индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS) колита с помощью Сор1 может защищать мышей от заболевания.

Таким образом, настоящее изобретение в одном аспекте относится к способу лечения пациента, страдающего воспалительным заболеванием кишечника (IBD), который заключается во введении указанному пациенту эффективного количества активного агента, выбранного из группы, состоящей из Сор1, Сор1-родственного полипептида и Сор1-родственного пептида. К эффектам, полученным при таком лечении, относятся, например, снижение прогрессирования болезни, ослабление симптомов болезни, подавление воспалительного процесса и/или предотвращение дальнейшего обострения болезни.

Воспалительным заболеванием кишечника (IBD), подвергаемым лечению, согласно изобретению является любое заболевание, при котором причиняющая вред иммунная реактивность проявляется в пищеварительном канале (кишечнике), в частности болезнь Крона и язвенный колит.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD), в частности болезни Крона и язвенного колита, содержащей активный агент, выбранный из группы, состоящей из Сор1, Сор1-родственного полипептида и Сор1-родственного пептида, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению активного агента, выбранного из группы, состоящей из Сор1, Сор1-родственного полипептида и Сор1-родственного пептида, для производства фармацевтической композиции для лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD), в частности болезни Крона и язвенного колита.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к изделию, содержащему упаковочный материал и фармацевтическую композицию, находящуюся в упаковочном материале, при этом указанная фармацевтическая композиция содержит агент, выбранный из группы, состоящей из сополимера 1, сополимера 1-родственного пептида и сополимера 1-родственного полипептида; и указанный упаковочный материал содержит этикетку, на которой указано, что данный агент является терапевтически эффективным для лечения воспалительного заболевания кишечника.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1A-1C показано действие перорального лечения Сор1 (ацетатом глатирамера, GA) на TNBS-индуцированный колит у мышей BALB/c. Фиг.1A представляет собой фотографию, показывающую макроскопические проявления: макроскопическую картину ободочной кишки в типичных случаях через 7 дней после инокуляции TNBS, при этом показаны нормальная ободочная кишка, ободочная кишка в случае TNBS-индуцированного колита не подвергаемой обработке мыши (с язвами в двух местах, крупными спайками, диареей и утолщением кишечника, оценка в баллах 8); ободочные кишки от двух мышей, обработанных перорально Сор1 (0,25 мг/мышь, 8 кормлений) только с очаговой гиперемией (оценка в баллах 1). Фиг.1B является графиком, показывающим изменения массы, а Фиг.1C является графиком, показывающим выживаемость мышей BALB/c с TNBS-индуцированным колитом и перорально обработанных GA по сравнению с необработанными мышами, имеющими колит, и с нормальными мышами или мышами, которым вводили только один 50% этанол. Массы GA-обработанных мышей были значимо выше, чем массы необработанных мышей (p<0,05). Мышей, которые погибли в течение первых 2 дней, считали случайно погибшими при обработке и не принимали во внимание. Каждая группа состояла из 5-7 мышей, которые выживали после 2 дней. Результаты представляют один из трех сходных экспериментов.

Фиг.2A-2F являются фотографиями гистологических образцов, показывающими действие лечения GA на микроскопические проявления TNBS-индуцированного колита. Показаны гистологические признаки типичных срезов ободочной кишки от мышей BALB/c через 7 дней после введения TNBS. Нормальная ободочная кишка, 2A (исходное увеличение ×40) и 2B (×100); TNBS-индуцированная контрольная ободочная кишка, на которой видно полное изъязвление слизистой оболочки, интенсивное трансмуральное воспаление, обширное изъязвление и разрушение нормальной структуры кишечника, 2C (×40) и 2D (×100); ободочная кишка TNBS-индуцированной мыши, обработанной перорально GA, в случае которой видны почти нормальные срезы, сохраненная слизистая оболочка, нормальная железистая структура, только с инфильтрацией мононуклеарными клетками в подслизистой оболочке и криптах, 2E (×40) и 2F (×100).

На Фиг.3A-3F показано действие различных обработок GA на TNBS-индуцированный колит у мышей разных линий. Изменения массы (Фиг.3A, 3B); выживаемость (Фиг.3C, 3D); гистологические оценки (Фиг.3E, 3F). Заболевание индуцировали ректальной инстилляцией TNBS в 50% спирте у мышей (SJL/J×BALB/c)F1 (Фиг.3A, 3C, 3E) или мышей SJL/J (Фиг.3B, 3D, 3F). Не подвергнутых лечению мышей с колитом сравнивают с мышами после лечения GA либо в случае перорального лечения (250 мкг/кормление, через день, начиная за 7 дней до индукции заболевания), либо в случае ежедневных инъекций (2,5 мг/мышь подкожно (п/к) в PBS, начиная либо за 7, либо за 14 дней до индукции). Массы мышей обеих линий, которым инъецировали GA, были значимо выше, чем массы мышей, не подвергнутых лечению (p<0,05). * указывает статистическую значимость гистологических проявлений (p<0,05). Каждая группа состояла из 7-11 мышей, которые выживали через 2 дня после индукции заболевания.

На Фиг.4A-4F показало влияние GA на пролиферацию лимфоцитов у разных линий мышей. Ответы нормальных мышей, мышей с индуцированным колитом и мышей с индуцированным колитом, которых ежедневно лечили GA перорально или парентерально, сравнивают в линиях BALB/c (Фиг.4A, 4B), F1 (SJL/J×BALB/c) (Фиг.4C, 4D) и SJL/J (Фиг.4E, 4F). Клетки из селезенок (Фиг.4A, 4C, 4E) и мезентериальных лимфатических узлов (MLN) (Фиг.4B, 4D, 4F) культивировали через 7 дней после индукции заболевания без антигена, с экстрактом ободочной кишки (CE, 200 мкг/мл) или GA (50 мкг/мл). Результаты включения тимидина выражены в виде средней пролиферации имп/мин±1SD для шести лунок с культурой и представляют один из двух сходных экспериментов с использованием объединенных клеток от 3-5 мышей в каждой группе. # указывает значимое увеличение ответа на CE у мышей с колитом. * указывает значимое уменьшение ответа на CE, индуцированное обработкой GA.

На Фиг.5A-5C показано влияние GA на секрецию TNF- у мышей разных линий. Ответы нормальных мышей, мышей с индуцированным колитом и мышей с индуцированным колитом, которых ежедневно лечили GA перорально или парентерально, сравнивают в линиях BALB/c (Фиг.5A), F1 (SJL/J×BALB/c) (Фиг.5B) и SJL/J (Фиг.5C). Клетки из селезенок и мезентериальных лимфатических узлов (MLN) культивировали через 7 дней после индукции заболевания с иммобилизованным анти-CD3 (5 мкг/мл). Через 24 часа надосадки из шести лунок с культурой объединяли и измеряли TNF- с помощью ELISA в двух повторах. Результаты выражены в виде концентрации TNF- (пг/мл±1SD) и представляют один из двух сходных экспериментов с использованием объединенных клеток от 3-5 мышей в каждой группе. # указывает значимое увеличение TNF- у мышей с колитом по сравнению с нормальными мышами. * указывает значимое уменьшение TNF- , индуцированное обработкой GA, по сравнению с необработанными мышами с индуцированным колитом.

На Фиг.6A-6B показано влияние лечения с использованием GA на секрецию TGF- лимфоцитами у TNBS-индуцированных мышей BALB/c. Клетки из селезенки и мезентериальных лимфатических узлов (MLN) нормальных мышей, мышей с индуцированным колитом и мышей с индуцированным колитом, которых лечили GA, культивировали либо с GA (50 мкг/мл) (Фиг.6A), либо с иммобилизованным анти-CD3 (5 мкг/мл) (Фиг.6B). Через 72 часа надосадки из шести лунок с культурой объединяли и измеряли TGF- с помощью ELISA в двух повторах. Результаты выражены в виде концентрации TGF- (пг/мл±1SD) и представляют один из двух сходных экспериментов с использованием объединенных клеток от 3-5 мышей в каждой группе. # указывает значимое уменьшение TGF- у мышей с колитом по сравнению с нормальными мышами. * указывает значимое увеличение TGF- , индуцированное обработкой GA, по сравнению с необработанными мышами с индуцированным колитом.

На Фиг.7 показано влияние обработки GA на изменение массы в случае индуцированного натриевой солью сульфата декстрана (DSS) колита у мышей C57BL/6. GA вводили подкожно с помощью ежедневных инъекций 2,5 мг/день, в PBS, начиная либо за 7 дней до кормления DSS, либо в тот же самый день.

Подробное описание изобретения

В последние годы сообщалось о нескольких исследованиях, описывающих выяснение механизма, посредством которого сополимер 1 проявляет свое целебное действие. Так показано, что сополимер 1 связывается случайно и с высокой аффинностью с различными молекулами MHC класса II мышиного и человеческого происхождения и даже может вытеснять антигены из антигенсвязывающей бороздки MHC [Fridkis-Hareli et al., 1994). Таким образом презентация других антигенов и следовательно сохранение воспалительного процесса подвергаются понижающей регуляции. Кроме того, было показано, что сополимер 1 является мощным индуктором регуляторных T-клеток типа Th2 (Aharoni et al., 1997). Кроме того, он приводит к отклонению иммунной реактивности от Th1- к Th2-профилю у животных, а также у человека (Aharoni et al., 1998; Neuhaus et al., 2000). Принимая во внимание указанные иммуномодулирующие активности сополимера 1 и связанную с Th1 иммунопатологическую природу болезни Крона, было интересно проверить, может ли сополимер 1 быть так же эффективным в подавлении воспалительных заболеваний кишечника. С этой целью авторы тестировали влияние Сор1 на экспериментальной модели на животных, а именно на модели TNBS-индуцированного колита мышей, который похож на болезнь Крона у человека по своим гистопатологическим характеристикам и цитокинной реактивности (Wirtz and Neurath, 2000).

В данном описании показано согласно данному изобретению, что действительно Сор1, введенный либо перорально, либо парентерально в виде ежедневных инъекций, значимо ослабляет различные патологические проявления TNBS-индуцированного колита в трех линиях мышей, свидетельствуя о том, что Сор1 может быть применим при лечении воспалительных заболеваний кишечника.

В используемом в данном описании смысле термины «сополимер 1», «Сор1», «Cop-1», «ацетат глатирамера» и «GA» используют взаимозаменяемо.

В целях данного изобретения подразумевается, что «Сор1 или Сор1-родственный пептид или полипептид» включает в себя любой пептид или полипептид, включая случайный сополимер, который функционально перекрестно реагирует с основным белком миелина (MBP) и способен конкурировать с MBP на MHC класса II при презентации антигена.

Сополимер для применения в качестве активного агента согласно данному изобретению может быть случайным сополимером, содержащим подходящее количество положительно заряженной аминокислоты, такой как лизин (K) или аргинин (R), в комбинации с отрицательно заряженной аминокислотой (предпочтительно в меньшем количестве), такой как глутаминовая кислота (E) или аспарагиновая кислота (D), необязательно в комбинации с незаряженной нейтральной аминокислотой, такой как аланин (A) или глицин (G), служащей в качестве наполнителя, и необязательно с аминокислотой, подходящей для придания сополимеру иммуногенных свойств, такой как ароматическая аминокислота, подобная тирозину (Y) или триптофану (W).

Сополимеры для применения согласно данному изобретению могут состоять из L- или D-аминокислот или их смесей. Как известно специалистам в данной области, L-аминокислоты встречаются в большинстве природных белков. Однако D-аминокислоты коммерчески доступны и могут заменять некоторые или все аминокислоты, используемые для получения сополимеров, применяемых согласно данному изобретению. В данном изобретении рассматривается применение сополимеров, содержащих как D-, так и L-аминокислоты, а также сополимеров, состоящих по существу либо из L-, либо из D-аминокислот.

В одном варианте активный агент для применения согласно данному изобретению содержит по меньшей мере один случайный сополимер из трех или четырех аминокислот, содержащий одну аминокислоту, выбранную из каждой из четырех следующих групп: (a) лизин (K) и аргинин (R); (b) глутаминовая кислота (E) и аспарагиновая кислота (D); (c) аланин (A) и глицин (G) и (d) тирозин (Y) и триптофан (W).

В одном предпочтительном варианте сополимер содержит комбинацию аминокислот: тирозин, глутаминовая кислота, аланин и лизин, называемую в данном описании поли-YEAK, с общим положительным зарядом, и наиболее предпочтительно является сополимером 1 со следующим молярным соотношением аминокислот: примерно 0,14 глутаминовой кислоты, примерно 0,43 аланина, примерно 0,10 тирозина и примерно 0,34 лизина. Он может быть сополимером низкой молекулярной массы или высокой молекулярной массы, представляя собой полипептид примерно длиной 15-100, предпочтительно примерно 40-80 аминокислот. Сополимер имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000-40000 Да, предпочтительно примерно 2000-13000 Да, более предпочтительно примерно 4700-13000 Да, наиболее предпочтительно примерно 5000-9000 Да и обычно примерно 6000-8000 Да. Указанный предпочтительный сополимер, Сор1, наиболее предпочтительно находится в форме своей ацетатной соли, известной под названием ацетат глатирамера или GA. Предпочтительные пределы молекулярной массы и способы получения предпочтительной формы Сор1 описаны в патенте США №5800808, полное содержание которого включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме, как в случае, если бы оно было полностью раскрыто в данном описании.

Очевидно, что сополимер приведен только в качестве примера и что активный агент может варьировать как в отношении компонентов, так и в отношении соответствующих свойств компонентов, таким образом получая при этом сополимеры поли-YEAK, отличные от Cop1.

В другом варианте активным агентом согласно данному изобретению является Сор1-родственный полипептид, который является случайным сополимером, содержащим четыре разные аминокислоты, каждая из одной из разных групп (a)-(d), но за исключением Сор1. Предполагается, что активность, проявляемая сополимером 1, сохраняется, если осуществляют одну или несколько из следующих замен в аминокислотном составе сополимера: глутаминовая кислота (E) на аспарагиновую кислоту (D), аланин (A) на глицин (G), лизин (K) на аргинин (R) и тирозин (Y) на триптофан (W).

Таким образом, в другом варианте Сор1-родственный полипептид согласно изобретению может включать любой из сополимеров, описанных в WO 00/05250, полное содержание которой включено в данное описание в виде ссылки, как в случае, если бы оно было полностью раскрыто в данном описании, и другие синтетические сополимеры аминокислот, такие как случайные сополимеры четырех аминокислот, описанные Fridkis-Hareli et al. (2002) в качестве кандидатов для лечения множественного склероза, а именно сополимеры (14-, 35- и 50-меры), содержащие аминокислоты фенилаланин, глутаминовую кислоту, аланин и лизин (поли-FEAK) или тирозин, фенилаланин, аланин и лизин (поли-YFAK), и любой другой сходный сополимер, который будет обнаружен, который может считаться универсальным антигеном, сходным с Сор1.

В другом варианте Сор1-родственным полипептидом согласно изобретению является сополимер, содержащий комбинацию трех разных аминокислот, каждая из одной из трех разных групп из групп (a)-(d). Указанные сополимеры в данном описании названы терполимерами. В более предпочтительном варианте мольная доля аминокислот терполимеров является примерно такой, которая предпочтительна для сополимера 1.

В одном варианте терполимеры для применения согласно настоящему изобретению содержат тирозин (Y), аланин (A) и лизин (K), в дальнейшем называемые поли-YAK. Средняя молярная доля аминокислот в указанных терполимерах может варьировать. Например, тирозин может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,250; аланин может присутствовать в мольной доле примерно 0,3-0,6 и лизин может присутствовать в мольной доле примерно 0,1-0,5, но предпочтительно молярное соотношение тирозина, аланина и лизина составляет примерно 0,10 примерно к 0,54 примерно к 0,35. Средняя молекулярная масса поли-YAK составляет примерно 2000-40000 Да, предпочтительно примерно 3000-35000 Да, более предпочтительно примерно 5000-25000 Да. Возможна замена лизина (K) на аргинин (R), аланина (A) на глицин (G) и/или тирозина (Y) на триптофан (W).

В другом варианте терполимеры для применения согласно настоящему изобретению содержат тирозин (Y), глутаминовую кислоту (E) и лизин (K), в дальнейшем называемые поли-YEK. Средняя мольная доля аминокислот в указанных терполимерах может варьировать: глутаминовая кислота может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,300, тирозин может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,250 и лизин может присутствовать в мольной доле примерно 0,3-0,7, но предпочтительно молярное соотношение глутаминовой кислоты, тирозина и лизина составляет примерно 0,26 примерно к 0,16 примерно к 0,58. Средняя молекулярная масса поли-YEK составляет примерно 2000-40000 Да, предпочтительно примерно 3000-35000 Да, более предпочтительно примерно 5000-25000 Да. Возможна замена лизина (K) на аргинин (R), глутаминовой кислоты (E) на аспарагиновую кислоту (D) и/или тирозина (Y) на триптофан (W).

В следующем варианте терполимеры для применения согласно настоящему изобретению содержат лизин (K), глутаминовую кислоту (E) и аланин (A), в дальнейшем называемые поли-KEA. Средняя молярная доля аминокислот в указанных терполимерах также может варьировать. Например, глутаминовая кислота может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,300, аланин в мольной доле примерно 0,005-0,600 и лизин может присутствовать в мольной доле примерно 0,2-0,7, но предпочтительно молярное соотношение глутаминовой кислоты, аланина и лизина составляет примерно 0,15 примерно к 0,48 примерно к 0,36. Средняя молекулярная масса YEK составляет примерно 2000-40000 Да, предпочтительно примерно 3000-35000 Да, более предпочтительно примерно 5000-25000 Да. Возможна замена лизина (K) на аргинин (R), глутаминовой кислоты (E) на аспарагиновую кислоту (D) и/или аланина (A) на глицин (G).

В еще одном варианте терполимеры для применения согласно настоящему изобретению содержат тирозин (Y), глутаминовую кислоту (E) и аланин (A), в дальнейшем называемые поли-YEA. Средняя молярная доля аминокислот в указанных терполимерах может варьировать. Например, тирозин может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,250, глутаминовая кислота может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,300 и аланин может присутствовать в мольной доле примерно 0,005-0,800, но предпочтительно молярное соотношение глутаминовой кислоты, аланина и тирозина составляет примерно 0,21 примерно к 0,65 примерно к 0,14. Средняя молекулярная масса поли-YEA составляет примерно 2000-40000 Да, предпочтительно примерно 3000-35000 Да, более предпочтительно примерно 5000-25000 Да. Возможна замена тирозина (Y) на триптофан (W), глутаминовой кислоты (E) на аспарагиновую кислоту (D) и/или аланина (A) на глицин (G).

Терполимеры могут быть получены любым способом, доступным специалисту в данной области, например, как описано в упомянутых выше публикациях WO 01/52878 и WO 01/93893.

Так как известны связывающие мотивы Сор1 с сопутствующими MS молекулами HLA-DR, то полипептиды с определенной последовательностью могут быть легко получены и тестированы в отношении связывания со связывающей пептиды бороздкой молекул HLA-DR, как описано в Fridkis-Hareli et al. (1999). Примерами таких пептидов являются пептиды, описанные в WO 005249, полное содержание которой таким образом включено в виде ссылки, как в случае, если бы оно было полностью раскрыто в данном описании. Тридцать два пептида, конкретно описанные в указанной заявке, воспроизведены в таблице 1 ниже (SEQ ID NO:1-NO:32). Они являются 15-мерными пептидами, содержащими 4 аминокислоты: аланин, глутаминовую кислоту, лизин и тирозин (пептиды 2, 3, 5-32), или только 3 аминокислоты: аланин, лизин и тирозин (пептиды 1, 4). Предполагается, что такие пептиды и другие сходные пептиды обладают активностью, сходной с активностью Сор1, и входят в определение Сор1-родственных пептидов или полипептидов согласно изобретению.

Таблица 1
SEQ ID NO.	Последовательность пептида
1	AAAYAAAAAAKAAAA
2	AEKYAAAAAAKAAAA
3	AKEYAAAAAAKAAAA
4	AKKYAAAAAAKAAAA
5	AEAYAAAAAAKAAAA
6	KEAYAAAAAAKAAAA
7	AEEYAAAAAAKAAAA
8	AAEYAAAAAAKAAAA
9	EKAYAAAAAAKAAAA
10	AAKYEAAAAAKAAAA
11	AAKYAEAAAAKAAAA
12	EAAYAAAAAAKAAAA
13	EKKYAAAAAAKAAAA
14	EAKYAAAAAAKAAAA
15	AEKYAAAAAAAAAAA
16	AKEYAAAAAAAAAAA
17	AKKYEAAAAAAAAAA
18	AKKYAEAAAAAAAAA
19	AEAYKAAAAAAAAAA
20	KEAYAAAAAAAAAAA
21	AEEYKAAAAAAAAAA
22	AAEYKAAAAAAAAAA
23	EKAYAAAAAAAAAAA
24	AAKYEAAAAAAAAAA
25	AAKYAEAAAAAAAAA
26	EKKYAAAAAAAAAAA
27	EAKYAAAAAAAAAAA
28	AEYAKAAAAAAAAAA
29	AEKAYAAAAAAAAAA
30	EKYAAAAAAAAAAAA
31	AYKAEAAAAAAAAAA
32	AKYAEAAAAAAAAAA

Согласно настоящему изобретению предполагаемый активный агент тестируют на подходящей модели воспалительного заболевания кишечника на животных, такой как модель TNBS-индуцированного колита у мышей, которая очень полезна для исследования многих важных аспектов воспалительного заболевания кишечника. Так как данная модель сама по себе не представляет сложности заболеваний человека, в последние годы разработано более 20 новых моделей воспаления кишечника на животных (Bregenholt, 2000; MacDonald et al., 2000; Wirtz and Neurath, 2000). Их можно разделить на четыре категории: (i) спонтанные модели, такие как колит у мышей C3H/HeJBir, новой подлинии мышей C3H/HeJ с высокой частотой спонтанного колита; (ii) индуцируемые модели у мышей с нормальной иммунной системой, такие как колиты, индуцированные натриевой солью сульфата декстрана (DSS); (iii) адоптивные модели на основе переноса в хозяина с иммунной недостаточностью, такие как на основе переноса клеток CD45RB CD62L+ мышам SCID, и (iv) генно-инженерные модели, такие как мыши, нокаутированные по IL-10. Хотя большинство моделей имеют очень гетерогенное происхождение, большинство из них дают в результате общий фенотип: воспаление слизистой оболочки, опосредованное T-клетками Th1, которые активируются бактериальными антигенами в слизистой оболочке, симптом, который очень сходен с болезнью Крона у человека. Все указанные модели можно использовать согласно изобретению.

Согласно настоящему изобретению предпочтительным сополимером для применения в качестве активного агента согласно изобретению является Сор1, наиболее предпочтительно в форме его ацетатной соли, известной под общим названием ацетат глатирамера. Вводимую дозу Сор1 будет определять лечащий врач в соответствии с возрастом пациента и стадией болезни, и доза может быть выбрана в диапазоне от 0,1 до 1000 мг, хотя любая другая подходящая доза входит в объем изобретения. Введение можно осуществлять ежедневно в виде одной или нескольких доз, предпочтительно от одной до трех доз ежедневно, например, в общем от 0,1 до 1000 мг, или через день, три раза в неделю или один раз в неделю, но согласно изобретению предусмотрен любой другой подходящий интервал между введениями в соответствии с тяжестью заболевания и состоянием пациента.

Композицию согласно изобретению можно вводить любым подходящим способом введения, включая пероральный, путем ингаляции, внутримышечный, подкожный или интрадермальный.

Пероральное введение может быть предпочтительной формой введения, поскольку это предпочтительно для пациентов и поскольку при IBD данный путь имеет дополнительные преимущества специального введения в больной орган и, следовательно, активации местных целительных механизмов, таких как блокирование MHC, в дополнение к системной активности.

В предпочтительном варианте композицию вводят перорально. В данном случае Сор1 может быть смешан с другими пищевыми формами и может потребляться в твердой, полутвердой, суспензионной или эмульсионной форме и он может быть смешан с фармацевтически приемлемыми носителями, включая воду, суспендирующие агенты, эмульгаторы, интенсификаторами вкуса и аромата и тому подобным, или он может быть в жидкой форме, в форе аэрозоля, ингалируемого порошка или в твердой форме, предпочтительно в форме с кишечно-растворимым покрытием, все формы описаны в WO 98/30227 и соответствующем патенте US 6214791, включенных таким образом в виде ссылки в полном объеме, как в случае, если бы оно было полностью раскрыто в данном описании.

В другом предпочтительном варианте Сор1 вводят парентерально, предпочтительно подкожно.

Следующие примеры иллюстрируют некоторые характерные признаки настоящего изобретения, но не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Вещества и способы

Животные. Мышей BALB/c, SJL/J, (SJL/J×BALB/c)F1 и C57BL/6 приобретали из Harlan (Jerusalem, Israel). Во всех экспериментах использовали самок мышей 8-12-недельного возраста массой 18-21 г.

Вещества. Ацетат глатирамера (GA, копаксон, сополимер 1) из партии 242990599 со средней молекулярной массой 7300 кД получали из Teva Pharmaceutical Industries Ltd. (Petach Tikva, Israel). Использовали 2,4,6-тринитробензолсульфоновую кислоту (TNBS) производства Sigma. Иммобилизованное анти-CD3-антитело из Serotec.

Индукция колита у мышей. TNBS-колиты индуцировали ректальной инстилляцией 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты 5% (мас./об.), смешанной с равным объемом этанола, анестезированным мышам (100 мкл/мышь). Каждая группа обработки включала 6-12 мышей. Мышей, которые погибали до 4 дня, считали случайно погибшими при обработке и не принимали во внимание.

Оценка колита. Изменения массы и жизнеспособность контролировали ежедневно. На пятый-восьмой день после инстилляции TNBS мышей забивали и оценивали макроскопическое, а также микроскопическое повреждение ободочной кишки.

Макроскопическая оценка ободочной кишки. Крупное повреждение ободочной кишки классифицировали согласно Reuter et al. (1996), используя объединенные значения четырех стандартных макроскопических параметров: степень изъязвления ободочной кишки (шкала от 0 - полностью нормальная, до 10 - наиболее тяжелое повреждение); кишечные и брюшинные спайки (от 0 до 2); диарея (от 0 до 1) и утолщения (от 0 до 1). Общая оценка в баллах является арифметической суммой четырех оценок в баллах. Оценку осуществляли слепым способом.

Микроскопическая оценка. Проксимальную, среднюю и дистальную части ободочной кишки фиксировали в 10% формалине в фосфатном буфере. Залитые парафином срезы красили гематоксилином и эозином. Степень гистологического повреждения и воспаления классифицировали согласно Elson et al. (1996), используя объединенные значения четырех микроскопических параметров: протяженность (шкала от 0 - полностью нормальная, до 2 - затрагивающее более одного сегмента); воспаление (от 0 - нет воспаления до 3 - тяжелое); повреждение (от 0 до 3 - тяжелое трансмуральное) и регенерация (от 0 - полная реэпителизация, до 3 - отсутствует). Общая оценка в баллах является арифметической суммой четырех оценок в баллах. Оценку осуществляли слепым способом.

Гистологическое исследование. Ободочную кишку, извлеченную, как описано выше, фиксировали в формалине и гистологическую оценку осуществляли на фиксированных образцах ободочной кишки, окрашенных гематоксилином-эозином. Образцы исследовал патологоанатом и классифицировал от 0 до 6 по степени воспалительного инфильтрата, изъязвлению или некрозу, глубине и протяженности поверхности повреждения.

Лечение GA. GA вводили одним из следующих способов.

Пероральное лечение 250 мкг/сутки в PBS, кормление через желудочный зонд с помощью стальной иглы для кормления калибра 18. Если не оговорено особо кормления осуществляли на -7, -5, -3, -1, 0, 2, 4 и 6 день относительно для инстилляции TNBS.

Парентеральное лечение ежедневными инъекциями 2,5 мг/сутки, вводимые подкожно в PBS, начиная с 14 дня до индукции заболевания.

Однократная инъекция - депонируемая доза 10 мг/мышь, инъецированная подкожно в неполном адъюванте Фрейнда (ICFA) за 14 дней до индукции заболевания.

Экстракт ободочной кишки. Ободочные кишки сингенных нормальных мышей нарезали на небольшие полоски и гомогенизировали. Гомогенат разбавляли в PBS и пропускали через стекловолокно. Измеряли количество белка, используя набор для анализа белка (Bio-Rad, Richmond, CA).

Анализ реактивности. Клетки селезенок и мезентериальных лимфатических узлов (MLN) (0,5×10⁶ клеток/лунку) культивировали либо с GA (50 мкг/мл), экстрактом ободочной кишки (200 мкг/мл), иммобилизованным анти-CD3 (5 мкг/мл), либо с контрольным PBS в конечном объеме 250 мкл/лунку (6 лунок для каждого антигена). В случае анализа пролиферации клетки культивировали в RPMI 1640 с 10% FCS, импульсно метили 1 мккюри [ ³H]-тимидина после 48-часовой инкубации и собирали спустя 12 час. В случае анализа цитокина (TNF- и TGF- ) клетки культивировали в бессывороточной среде (DCCM-1), надосадки собирали через 72 час и тестировали в отношении цитокинов с помощью ELISA, используя пары мАт (R&D Systems, Minneapolis, MN) согласно инструкции производителя.

Статистический анализ. Макроскопическую и микроскопическую оценки, а также различия в массе между GA-обработанными и необработанными группами анализировали, используя двусторонний критерий U Манна-Уитни. Статистический анализ кривых выживаемости осуществляли по критерию Каплана-Мейера. Различия в пролиферативных ответах, секреции TNF- и TGF- сравнивали, используя двухсторонний независимый t-критерий. Все статистические тесты осуществляли с использованием программы SPSS 10.0. Уровень значимости для всех тестов устанавливали <0,05.

Пример 1. Влияние перорального лечения с использованием Сор1 на TNBS-индуцированный колит у мышей BALB/c

Колит индуцировали TNBS в 50% этаноле. GA вводили перорально (250 мкг/мышь на кормление) через день, начиная либо за семь, либо за три дня до индукции заболевания, в день индукции, а также через два дня после индукции и продолжали, как указано в таблице 2B ниже, левый ряд. Оценку ободочной кишки осуществляли на 7 или 8 день после индукции заболевания. Мышей, которые погибли в течение первых 2 дней (обычно около 20% во всех группах), считали случайно погибшими при обработке и соответственно они не представлены; каждая группа состояла из 4-7 мышей, которые выживали после 2 дней.

В первой группе экспериментов тестировали способность перорально введенного GA (250 мкг/мышь, через день, начиная за 7 дней до индукции заболевания, 8 кормлений) ослаблять экспериментальный TNBS-индуцированный колит у мышей BALB/c. Макроскопическая оценка ободочной кишки мышей, которых кормили GA, по сравнению с ободочной кишкой контрольных мышей в трех разных экспериментах показала, что лечение GA сильно снижает повреждение ободочной кишки, характерное для заболевания, как суммарно показано в таблице 2A. Соответственно различные макроскопические патологические проявления, т.е. тяжелое изъязвление и/или воспаление, спайки с близлежащими органами, диарея и утолщение стенки кишечника, все значимо снижались (в среднем в 3,5-4,0 раза в трех экспериментах) при лечении GA. Общее макроскопическое повреждение, получаемое при арифметическом суммировании оценок в баллах всех четырех патологических проявлений, уменьшалось с 10,2 в контроле до 2,7 в группах, подвергнутых лечению GA, то есть в 3,8 раза.

Типичные ободочные кишки нормальной мыши, а также мыши с TNBS-индуцированным колитом, оцененным в 8 баллов (изъязвление/воспаление в двух местах, большие спайки, диарея и утолщение кишечника) по сравнению с ободочными кишками от двух TNBS-индуцированных мышей, которых лечили перорально GA и которые оценены в 1 бал (только очаговая гиперемия), показаны на Фиг.1A. Как показано, лечение GA привело к заметному уменьшению макроскопического повреждения ободочной кишки, индуцированного TNBS.

GA был особенно эффективен, когда кормления начинали за семь дней до введения TNBS и продолжали после индукции заболевания (всего 8 кормлений через день). В таких условиях достигали снижения тяжести заболевания в 5,2 раза (таблица 2B). Однако значимое целебное действие наблюдали также, когда обработку GA начинали только за три дня до индукции (снижение в 2,75 раза) или в день введения TNBS и даже через два дня после индукции заболевания (снижение в 2,2 раза).

Потеря массы является характерной для колита. У мышей BALB/c с TNBS-индуцированным колитом наблюдалась значительная потеря массы (10% массы их тела на 3 день после введения TNBS), при этом она начинала восстанавливаться с 7 дня, но не возвращалась к их исходной массе, как показано на Фиг.1B. Мыши, которых кормили GA, претерпевали только умеренную потерю массы (максимум 5% от массы их тела на 3 день) и затем наблюдалось восстановление массы до полного восстановления их исходной массы на 5 день. Таким образом, у обработанных GA мышей наблюдались значимо более высокие массы, чем массы у необработанных мышей, и через 5-8 дней после индукции заболевания кривые их масс были сходны с кривой для нормальных мышей, у которых не индуцировали заболевание.

Во всех группах примерно 20% погибали в первые два дня после введения TNBS. Их считали случайно погибшими и исключали из всех расчетов или представления. Смертность от заболевания превышала 55% у необработанных мышей через 8 дней после индукции, тогда как только 20% смертность наблюдали у GA-обработанных мышей в результате патологического процесса (Фиг.1C). Таким образом, пероральное лечение мышей BALB/c с использованием GA приводило к повышенной выживаемости кроме уменьшенных проявлений TNBS-индуцированного колита.

Гистологическая оценка образцов ободочной кишки от мышей с TNBS-индуцированным колитом, не обработанных GA, выявила тяжелое повреждение слизистой оболочки, расширение очагов воспаления, сопровождаемое трансмуральным воспалением, обширное изъязвление и тяжелое нарушение нормальной структуры (Фиг.2C, 2D). В отличие от этого в ободочных кишках TNBS-индуцированных мышей, которых лечили GA, наблюдали более сохраненную слизистую оболочку (Фиг.2E) и только редкую инфильтрацию мононуклеарных клеток в подслизистой оболочке и криптах (Фиг.2F). Структура кишечника у GA-обработанных мышей была повреждена намного меньше и железистая структура была хорошо сохранена (Фиг.2E, 2F), подобно структуре кишечника нормальных мышей (Фиг.2A, 2B). Средняя гистологическая оценка мышей, выживающих вплоть до 7 дня, у которых брали гистологические образцы, составляла 7,8 в группе с колитом и 2,8 в группе обработки GA (при максимальной оценке 12,0), свидетельствует о снижении в 2,8 раза (p=0,007). Обработка GA без индукции TNBS не давала никакого гистологического или макроскопического повреждения.

Пример 2. Влияние различных способов обработки GA на TNBS-индуцированный колит у мышей разных линий

Чтобы выяснить, ограничено ли целебное действие GA на TNBS-индуцированный колит пероральным введением мышам линии BALB/c или он оказывает более общее действие, авторы исследовали способность GA, введенного различными путями и в разных дозах, подавлять TNBS-индуцированный колит у мышей двух дополнительных линий. Поэтому тестировали действие перорального лечения (250 мкг/кормление через день, начиная за 7 день до индукции заболевания) однократной инъекции депонируемой дозы (5 мг/мышь подкожно (п/к) в ICFA за 14 дней до индукции) или ежедневных инъекций (2,5 мг/мышь п/к в PBS, начиная либо за 7, либо за 14 дней до индукции) в линии SJL/J и гибридной линии F1 SJL/J и BALB/c-(SJL/J×BALB/c)F1.

Макроскопическая оценка ободочных кишок, которая суммирована в таблице 3, выявила, что подобно линии BALB/c обе линии были высоко чувствительными к TNBS-колиту (100% частота заболевания в необработанных контрольных группах). Особенно чувствительными были мыши SJL/J, у которых была выявлена оценка 12,4 из максимальной общей оценки 14. Агрессивное заболевание в линии SJL/J сопровождалось симптомом особенно маленьких селезенок и исключительно увеличенных MLN. Пероральное лечение GA уменьшало макроскопическое повреждение, индуцированное заболеванием в обеих линиях (хотя в меньшей степени, чем у BALB/c, таблица 1). Таким образом, было обнаружено снижение общего макроскопического повреждения в 1,8 и 1,7 раза у мышей (SJL/J×BALB/c)F1, которых кормили GA, по сравнению с необработанными мышами, наблюдаемое через 5 и 11 дней после введения TNBS соответственно. У мышей SJL/J, у которых обнаруживалось наиболее тяжелое заболевание, получено только незначительное влияние перорального лечения с помощью GA (снижение на 1,7 пункта в общей оценке в баллах). С другой стороны, лечение GA, вводимым ежедневными инъекциями, было более эффективным, чем пероральное лечение, и сильно уменьшало повреждение ободочной кишки, характерное для заболевания. Так через 5 дней после индукции заболевания получали 3,5- и 4,6-кратное уменьшение общей макроскопической оценки в баллах у мышей (SJL/J×BALB/c)F1, которым проводили инъекции, начиная с -7 и -14 дня, соответственно, по сравнению с необработанными мышами. Еще более выраженный эффект получали через 11 дней после индукции заболевания, когда мышам проводили инъекции GA ежедневно, у которых показано почти полное выздоровление (только у одной из семи мышей наблюдали очаговую гиперемию в каждой группе, получая общую оценку 0,1), в то время как большинство необработанных контрольных мышей все еще были больными (общая оценка - 5,3). Кроме того, значимое снижение макроскопической оценки в баллах при ежедневных инъекциях GA получали даже у мышей SJL/J, у которых наблюдалось наиболее тяжелое заболевание (2,7-кратное снижение по сравнению с необработанным контролем при инъекциях с -7 дня), сопровождаемое нормальной картиной селезенки и MLN. Однократная инъекция GA в виде депонируемой дозы в ICFA была не достаточной для эффективного предотвращения макроскопического повреждения, индуцированного введением TNBS. Хотя макроскопические оценки, полученные при указанном лечении, были ниже, чем оценки для необработанных контролей, указанный эффект был небольшим и статистически незначимым.

Как показано на Фиг.3A-3B, TNBS-индуцированный колит в обеих линиях приводит к значительной потере массы. Поэтому через 2 дня после индукции наблюдали 12% и 15% снижение массы у мышей (SJL/J×BALB/c)F1 (A) и SJL/J (B), не получавших лечения. Кроме того, в то время как у мышей F1 наблюдалось последующее восстановление массы (восстановление 95% их исходной массы на 6 день), мыши SJL/J продолжали терять массу вплоть до 4 дня, и их средняя масса на 5 день составляла только 80% от их исходной массы. Лечение GA частично подавляло степень потери массы, вызванной TNBS-колитом в обеих линиях. Это проявлялось в ограниченном статистически незначимом подавлении потери массы у мышей, которых лечили перорально, и в большом статистически значимом подавлении потери массы у мышей, которым проводили ежедневные инъекции. Например, мыши (SJL/J×BALB/c)F1, которым проводили ежедневные инъекции (начиная с -7 дня) теряли только 4% своей исходной массы в 1 день после индукции и затем восстанавливались, демонстрируя полное восстановление массы на 6 день. В обеих линиях, F1, у которых проявлялось более умеренное заболевание, а также SJL/J, у которых проявлялось более тяжелое заболевание, массы тела мышей, которым ежедневно инъецировали GA, были значимо выше, чем массы необработанных мышей (p<0,01).

Смертность от заболевания превышала 40% у необработанных мышей в обеих линиях (на 8 день у мышей (SJL/J×BALB/c)F1 и на 5 день у мышей SJL/J), тогда как после перорального лечения GA в указанных двух группах наблюдали только 30% и 18% смертность соответственно (Фиг.3C, 3D). Кроме того, ежедневная инъекция GA (начиная как за 7, так и за 14 дней до индукции заболевания) полностью предотвращала смертность в группе (SJL/J×BALB/c)F1 и только 8% погибало в группе SJL/J (P<0,05 для обеих линий), что свидетельствует о том, что GA по существу предотвращает смертность вследствие заболевания, значимо повышая выживаемость.

GA также был эффективным в предотвращении макроскопического повреждения ободочной кишки, индуцированного TNBS-колитом, как показано на Фиг.3E и 3F. Так у мышей (SJL/J×BALB/c)F1 наблюдали 1,8-кратное снижение гистологической оценки в баллах при пероральном лечении и 6,6-кратное при ежедневных инъекциях (начиная либо за 7, либо за 14 дней до индукции заболевания). У мышей SJL/J, у которых проявлялось наиболее тяжелое заболевание, получали только небольшое, статистически незначимое действие лечения GA (снижение общей оценки на 0,5 и 1,8 пунктов при кормлении и инъекции соответственно).

Пример 3. Влияние GA на реактивность лимфоцитов при TNBS-индуцированном колите

Чтобы исследовать влияние лечения GA на реактивность T-клеток при TNBS-индуцированном колите, авторы исследовали пролиферативный ответ клеток и секрецию цитокинов TNF- и TGF- у мышей с индуцированным колитом, которых лечили GA, по сравнению с необработанными мышами. Реактивность клеток селезенки - системный ответ, а также реактивность местных мезентериальных лимфатических узлов (MNL), соседних с больным органом, анализировали в трех линиях мышей. Пролиферация в ответ на экстракт ободочной кишки, полученный от нормальных сингенных мышей (CE), и на GA, показана на Фиг.4A-4F. Заметный пролиферативный ответ на экстракт ободочной кишки демонстрировали клетки MLN, т.е. 8,9-, 2,0- и 3,3-кратный у мышей с индуцированным колитом по сравнению с ответом нормальных MLN в линии BALB/c (Фиг.4B), (SJL/J×BALB/c)F1 (Фиг.4D) и SJL/J (Фиг.4F) соответственно (P<0,05). Указанная реактивность была ограничена местными MLN, так как системно не наблюдали значимой пролиферации на CE по сравнению с ответом таких же клеток без антигена (Фиг.4A, 4C, 4E). Указанный локальный ответ на экстракт ободочной кишки заметно ингибировался при лечении GA, что проявлялось в виде 66% ингибирования в MLN мышей BALB/c. Кроме того, MLN мышей (SJL/J×BALB/c)F1 и SJL/J, которых лечили либо перорально, либо парентерально GA, отвечали на CE подобно MLN от нормальных мышей, что свидетельствует о полном ингибировании ответа на экстракт ободочной кишки при лечении GA. Лимфоциты от GA-обработанных мышей как из селезенки, так и из MLN пролиферировали в ответ на лекарственное средство GA, при этом системный ответ был значительно выше, чем ответ клеток MLN.

Клетки от мышей с TNBS-индуцированным колитом секретировали большие количества TNF- , которые регистрировали по ответу по отношению к стимулятору широкого спектра анти-CD3. Как показано на Фиг.5A и 5B, и у мышей BALB/c и у мышей (SJL/JxBALB/c)F1 указанное повышение было более выражено в спленоцитах, чем в клетках из MLN. В отличие от этого у мышей SJL/J не обнаруживалось такого системного повышения (Фиг.5C); однако секреция TNF- клетками их MLN была сильно увеличена. Лечение GA во всех линиях приводило к сильному снижению TNF- как в селезенке, так и в MLN, так что уровни секреции у мышей с индуцированным колитом, которых лечили GA, были даже ниже, чем у нормальных мышей. Указанное снижение уровня TNF- обнаруживали во всех случаях, за исключением MLN мышей SJL/J, которых лечили GA перорально, у которых также не наблюдалось значимого снижения патологических проявлений. Однако у мышей SJL/J, которых лечили GA ежедневно парентеральным способом, все же наблюдалось значительное снижение уровней TNF- , а также пониженная оценка заболевания в баллах. Стимуляция in vitro либо GA, либо CE не приводила к секреции TNF- .

Также оценивали секрецию TGF- в ответ на лечение GA, а также на стимул широкого спектра действия анти-CD3. Результаты, полученные у мышей BALB/c, показаны на Фиг.6A-6B. Клетки селезенки и в меньшей степени клетки MLN секретировали TGF- в ответ на GA. Указанный ответ был более выраженным у мышей, которых лечили GA (Фиг.6A). Стимуляция анти-CD3 приводила к секреции чрезмерных количеств TGF- клетками селезенки нормальных мышей, а также мышей с колитом (Фиг.6B). Интересно, что в MLN секреция TGF- была значимо снижена у мышей с индуцированным колитом (6,5-кратное снижение по сравнению с MLN нормальных мышей), но лечение GA вызывало заметное повышение секреции TGF- в MLN (в 2,2 раза выше, чем секреция у нормальных мышей). Сходные результаты получали у мышей (SJL/J×BALB/c)F1, но не у мышей SJL/J, у которых наблюдались наиболее агрессивные проявления заболевания (результаты не показаны).

Пример 4. Влияние Сор1 на индуцированный натриевой солью декстран сульфата натрия (DSS) колит у мышей

Кормление мышей в течение нескольких дней полимерами в виде декстран сульфата натрия (DSS) в питьевой воде индуцирует острый колит с кровяной диареей, гистологическим повреждением и воспалением (Wirtz and Neurath, 2000).

Самок мышей C57BL/6 7-недельного возраста кормили 2,5% раствором DSS в питьевой воде в течение 7 дней. GA вводили подкожно, используя ежедневные инъекции, 2,5 мг/день в PBS, начиная либо за 7 дней до кормления DSS, либо в тот же самый день.

Результаты предварительного эксперимента с использованием данной модели показаны на Фиг.7. Обнаружено, что не подвергнутые лечению мыши, которых кормили DSS, претерпевали значительную потерю массы, начиная с 5 дня, и потерю 17% массы их тела на 7 день после кормления DSS. Мыши, которых лечили GA, претерпевали только умеренную потерю массы (максимум 7% у мышей, которым проводили инъекции, начиная с -7 дня, и 4% у мышей, которым проводили инъекции с 0 дня на 7 день). Приведенные результаты показывают, что GA также может оказывать целебное действие на DSS-индуцированный колит.

Колит индуцировали у мышей BALB/c с использованием TNBS в 50% этаноле. GA вводили перорально (250 мкг/мышь) через день, начиная с указанного дня относительно индукции заболевания. Оценку ободочной кишки осуществляли на 7 или 8 день после индукции заболевания. Мышей, которые погибли в течение первых 2 дней (обычно около 20% во всех группах), считали случайно погибшими при обработке и соответственно они не представлены; каждая группа состояла из 4-7 мышей, которые выживали после 2 дней. * указывает значимое уменьшение макроскопического проявления у GA-обработанных мышей по сравнению с необработанными мышами (p<0,05).

Таблица 3 Влияние различных курсов лечения GA на макроскопические проявления TNBS-индуцированного колита в разных линяих мышей
Линия мышей	Обработка	N	Макроскопическая оценка повреждения ободочной кишки
			Изъязвление (максимум 10)	Спайки (максимум 2)	Диарея (максимум 1)	Утолщение (максимум 1)	Общая оценка (максимум 14)
SJL/J×BALB/c (оценка через 5 дней после индукции заболевания)	Контроль	8	6,8	1,6	0,7	0,5	9,6
	GA перорально через день (начиная с -7 дня)	8	3,8	1,0	0,3	0,3	5,4
	GA, инъецированный однократно в -14 день	8	4,4	1,4	0,3	0,3	6,4
	GA, инъецируемый ежедневно (начиная с -7 дня)	7	1,4	0,8	0,4	0,1	2,7*
	GA, инъецируемый ежедневно (начиная с -14 дня)	7	1,4	0,4	0,2	0,1	2,1*
SJL/J×BALB/c (оценка через 11 дней после индукции заболевания)	Контроль	7	3,3	1,1	0,4	0,4	5,3
	GA перорально через день (начиная с -7 дня)	7	2,3	0,6	0,1	0,2	3,2
	GA, инъецированный однократно в - 14 день	6	2,3	1,0	0,2	0,2	3,7
	GA, инъецируемый ежедневно (начиная с - 7 дня)	8	0,1	0,0	0,0	0,0	0,1*
	GA, инъецируемый ежедневно (начиная с - 14 дня)	8	0,1	0,0	0,0	0,0	0,1*
SJL/J (оценка через 5 дней после индукции заболевания)	Контроль	10	8,4	2,0	1,0	1,0	12,5
	GA перорально через день (начиная с - 7 дня)	11	7,1	1,8	0,9	0,9	10,7
	GA, инъецируемый ежедневно (начиная с - 7 дня)	11	3,5	1,2	0,5	0,5	5,7*

Колит индуцировали с использованием TNBS в 50% этаноле. GA вводили одним из следующих путей: перорально (0,25 мг), 8 кормлений, начиная за 7 дней до индукции заболевания; однократной инъекцией (5 мг/мышь) п/к в ICFA, за 14 дней до индукции заболевания; ежедневными инъекциями (2,5 мг/мышь) п/к, начиная либо за 14, либо за 7 дней до индукции заболевания. Мышей, которые погибли в течение первых 2 дней (обычно около 20% во всех группах), считали случайно погибшими при обработке и соответственно они не представлены. * указывает значимое уменьшение макроскопического проявления у GA-обработанных мышей по сравнению с необработанными мышами (p<0,05).

ССЫЛКИ

Aharoni R, Teitelbaum D, Sela M, et al. Copolymer 1 induces Т cells of the Т helper type 2 that crossreact with myelin basic protein and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.94: 10821-6 (1997)

Aharoni R, Teitelbaum D, Sela M, Arnon R. Bystander suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by Т cell lines and clones of the Th2 type induced by Copolymer 1. J. Neuroimmunol. 91: 135-46 (1998)

Aharoni R., Teitelbaum D., Arnon R., Sela M. Copolymer 1 inhibits manifestations of graft rejection. Transplantation 27: 598-605 (2001)

Bregenholt S. Cells and cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel disease: new insights from mouse T-cell transfer models. Exp Clin Immunogenet 17: 115-29(2000)

Elson CO, Beagley KW, Sharmanov AT, Fujihashi K, Kiyono H, Tennyson GS, Cong Y, Black CA, Ridwan BW, McGhee JR. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease mucosa immune responses and protection by tolerance. J Immunol 157: 2174-2185 (1996)

Fridkis-Hareli M, Teitelbaum D, Gurevich E, et al. Direct binding of myelin basic protein and synthetic copolymer 1 to class II major histocompatibility complex molecules on living antigen-presenting cells - specificity and promiscuity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.91: 4872-6 (1994)

Fridkis-Hareli M, Neveu JM, Robinson RA, Lane WS, Gauthier L, Wucherpfennig KW, Sela M, Strominger JL. Binding motifs of copolymer 1 to multiple sclerosis- and rheumatoid arthritis-associated HLA-DR molecules. J Immunol. 162: 4697-4704 (1999)

Fridkis-Hareli M, Santambrogio L, Stern JN, Fugger L, Brosnan C, Strominger JL. Novel synthetic amino acid copolymers that inhibit autoantigen-specific Т cell responses and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis. J Clin Invest 109: 1635-1643 (2002)

Johnson KP, BR Brooks, JA Cohen, CC Ford, J Goldstein, RP Lisak, LW Myers, HS Panitch, JW Rose, and RB Schiffer. Copolymer 1 reduces relapse rate and improves disability in relapsing-remitting multiple sclerosis: results of a phase III multicenter, double-blind placebo-controlled trial. The Copolymer 1 Multiple Sclerosis Study Group. Neurology 45: 1268-1276 (1995)

Kipnis, J. and Schwartz, M. Dual Action of Glatiramer Acetate (Cop-1) as a Treatment for Autoimmune Diseases and a Vaccine for Protective Autoimmunity after CNS Injury. Trends Mol. Med.8: 319-323 (2002)

MacDonald TT, Monteleone G, Pender SLF Recent developments in the immunology of inflammatory bowel disease. Scand. J. Immunol. 51:2-9 (2000)

Neuhaus O, Farina C, Yassouridis A, Wiendl H, Then Bergh F, Dose T, Wekerle H, Hohlfeld R. Multiple sclerosis: comparison of Copolymer-1 reactive Т cell lines from treated and untreated subjects reveals cytokine shift from Т helper Т helper 2 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.97: 7452-7 (2000)

Reuter BK, Asfaha S, Buret A, Sharkey KA, Wallace JL. Exacerbation of inflammation-associated colonic injury in rat through inhibition of cyclooxygenase-2. J. Clin. Invest.98: 2076-85 (1996)

Sandborn WJ, Targan SR Biologic therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterol.122: 1592-608 (2002)

Schlegel PG, Aharoni R, Chen Y, Chen J, Teitelbaum D, Arnon R, Sela M, Chao NJ. A synthetic random copolymer with promiscuous binding to class II MHC molecules inhibits T-cell proliferative response to major and minor histocompatibility antigens in vitro and confers the capacity to prevent murine graft-versus-host disease in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.93: 5061-6 (1996)

Sela M, Teitelbaum D. Glatiramer acetate in the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Pharmacother. 2: 1149-65 (2001)

Shanahan F. Inflammatory bowel disease: Immunodiagnostics, irnmunotherapeutics, and ectotherapeutics. Gastrcenterol. 120: 622-35 (2001)

Van Deventer SJH Immunotherapy of Crohn's disease. Scand. J. Immunol. 51: 18-22 (2000)

Wirtz S., Neurath M. Animal models of intestinal inflammation: new insights into the molecular pathogenesis and immunotherapy of inflammatory bowel disease. Int J. Colorectal Dis 15: 144-160(2000)