способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах

Формула изобретения

1. Способ детекции патогенных микобактерий в клиническом образце, где указанный способ включает стадии:

а. очистки клинического образца от загрязнений, включая слизь, общепринятыми способами, для получения обработанного клинического образца,

b. обработки очищенных клинических образцов, полученных на стадии (а), лизирующим буфером для инактивации живых патогенных микобактерий,

с. выделения геномной ДНК из клинического образца со стадии (b),

d. амплификации выделенной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) с применением олигопраймеров с нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID No: 5 и 6, с получением продукта PCR с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID No:4,

е. дальнейшей амплификации с помощью PCR продукта с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID No:4, и получения амплифицированного продукта PCR,

f. анализа амплифицированного продукта PCR со стадии (е) способом, выбранным из электрофореза в геле, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) для детекции присутствия патогенных микобактерий в образце.

2. Способ по п.1, где продукт PCR с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID No:4, имеет следующую последовательность нуклеотидов:

5'TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGT

GGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCC

GCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAAC

CGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGA

GCTACTTGGTCATGGTGAACTGGGCGACGTTGATTAGGCCTCTGCG

GAAGCGCTCCGCGCATCCGGTCAGATAGTGCATGAAGTTGTTGTA

GACCTCTTCGGACTGTACGGCGATGGCGCGTTCGCGGGCAGCCTGT

AGGTTGGCGGCCATGCATCGAGAGTCCGTGCGTAGTGGGAATTC-3'

3. Способ по п.1, где клинический образец выбирают из мокроты, спинномозговой жидкости, образца промывания желудка, крови, образцов биоптата тканей или аспиратов костного мозга и других жидкостей или тканей организма.

4. Способ по п.1, где очистку образца на стадии (а) от загрязнений (живых организмов, отличных от микобактерий, и слизи) проводят раствором для деконтаминации с последующим концентрированием образца центрифугированием.

5. Способ по п.4, где раствор для деконтаминации содержит изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,5-2,0М помимо щелочи средней силы и муколитического средства.

6. Способ по п.1, где лизирующий буфер содержит изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,5-8,0М, Трис-Cl рН 7,6 в диапазоне приблизительно 20-100 мМ, N-лаурил саркозил в диапазоне приблизительно 0,5-2%, EDTA в диапазоне приблизительно 0,1-20 мМ, -меркаптоэтанол в диапазоне приблизительно 1,0-25,0 мМ и ацетат аммония (СН₃COONH ₄) в диапазоне приблизительно 0,3-1,0 М.

7. Способ по п.1, где выделенная ДНК из клинических образцов свободна от неспецифической ДНК и ингибиторов PCR.

8. Способ по п.1, где амплификации ДНК на стадии (е) достигают посредством условий проведения циклов PCR с понижением температуры, где указанные условия предусматривают стадии с начальной температурой отжига в диапазоне 62-72°С с последующим понижением температуры в диапазоне приблизительно 0,2-1°С на цикл PCR для первых 10-25 циклов, являющихся стадией с понижением температуры, до оптимальной температуры отжига приблизительно 56-62°С для других 30 циклов PCR.

9. Способ по п.1, где олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента ДНК для специфической детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, выбирают из группы:

а. 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (SEQ ID No:5), являющийся прямым праймером.

b. 5'GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (SEQ ID No:6), являющийся обратным праймером.

10. Способ по п.1, где длина олигонуклеотидных праймеров составляет между 5 и 100 нуклеотидами.

11. Диагностический набор для детекции патогенных микобактерий в клиническом образце, содержащий:

а. прямой праймер SEQ ID No:5 и

b. обратный праймер SEQ ID No:6.

12. Диагностический набор по п.11, где SEQ ID No:5 представляет собой 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3'

13. Диагностический набор по п.11, где SEQ ID No:6 представляет собой 5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3'.

14. Применение праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ. ID No:5 и SEQ ID No:6 для детекции патогенных микобактерий в клиническом образце.

15. Набор для детекции патогенных микобактерий, содержащий праймеры, имеющие нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID No:5 и 6, где

а. 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (SEQ ID No:5), являющийся прямым праймером.

b. 5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (SEQ ID No:6), являющийся обратным праймером.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, таких как мокрота, спинномозговая жидкость, образцы промывания желудка, биоптатах тканей и т.д., где новый фрагмент ДНК лежит в межгенной области между генами синтазы метилмиколовой кислоты mmaA1 и mmaA2, и по изобретению применяют пару сконструированных олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации ДНК-мишени в клинических образцах.

Предпосылки изобретения

Туберкулез является смертельным заболеванием номер один. Огромное число людей каждый год умирает от одного инфекционного заболевания. По сообщениям Всемирной организации здравоохранения (WHO) каждый год сообщают о более чем 8 миллионов случаев туберкулеза с более чем 2,9 миллионами смертей (Dolin et al., 1995).

Смертность от туберкулеза постепенно снижалась до начала 90-х благодаря преимуществу доступности сильнодействующих противотуберкулезных лекарственных средств. Случаи туберкулеза и смертей от него снова находятся на подъеме, главным образом из-за синергического действия совместной инфекции вирусом иммунодефицита человека (HIV) (Hopewell, P. C et al., 1992), появления множественной лекарственной устойчивости (MDR) штаммов M.tuberculosis (Bloom, B. R, and C. L. Murray., 1992) и вовлечения так называемых нетуберкулезных микобактерий.

Известно около 70 видов микобактерий, большинство из которых не являются патогенными для человека. Туберкулез вызван инфекцией, обусловленной M.tuberculosis, с редкими случаями, вызываемыми M.bovis. Данные организмы очень близки генетически и их называют организмами туберкулезного комплекса микобактерий (MTC). Существует более дюжины других патогенных микобактерий, вызывающих подобную туберкулезу инфекцию легких или других частей тела. Данные организмы называют отличными от туберкулезных микобактериями (MOTT) или нетуберкулезными микобактериями (NTM). В результате эпидемии СПИД данные так называемые нетуберкулезные микобактерии стали существенными и их выделяют у большого количества туберкулезных пациентов, совместно зараженных HIV.

Ранний туберкулез часто остается нераспознанным у здорового во всем остальном индивидуума. Отсутствие простых, быстрых и надежных тестов, которыми можно специфически детектировать M.tuberculosis и другие возбудители в клиническом образце, представляет огромную проблему и для ведения индивидуального пациента, и для осуществления соответствующего инфекционного контроля и мер здравоохранения.

Классические способы диагностики предусматривают исследование кислотоустойчивых микобактерий в мазке мокроты под микроскопом и рентген легких. Однако в огромном большинстве случаев на ранних стадиях заболевания анализ мазка мокроты отрицателен для микобактерий и изменения легкого, возможно, не очевидны на рентгене до нескольких месяцев после инфекции. Хотя окрашивание кислотоустойчивых бацилл в мазке (AFB) занимает менее двух часов, его чувствительность недостаточна, и в некоторых случаях оно может быть неспецифичным (Ebersole, L. L. 1992). Кроме того, при положительном результате окрашиванием AFB не различают виды микобактерий.

В настоящее время единственным абсолютно надежным способом диагностики является способ, основанный на культивировании M.tuberculosis из клинического образца и ее морфологической и биохимической идентификации. Культивирование M.tuberculosis и других родственных организмов является чувствительным и специфичным, однако трудоемким, и занимает 6-12 недель при культивировании на твердых средах и от трех до шести недель - на жидких средах, в течение какого времени пациент может стать тяжелобольным и заразить других индивидуумов. Поэтому быстрый тест, способный надежно обнаруживать присутствие M.tuberculosis , жизненно важен для раннего обнаружения, лечения и ведения пациента.

Недавно разработано несколько молекулярных тестов для быстрой детекции и идентификации M.tuberculosis. Коммерческий тест Gen-Probe "Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test" разработан Abe et al и Miller et al. В данном тесте амплифицируют 16S рибосомальную РНК из респираторных образцов и применяют хемилюминесцентный зонд для детекции амплифицированного продукта с опубликованной чувствительностью приблизительно 91%. Другие коммерческие тесты, основанные на лигазной цепной реакции (LCR) (Abbott Laboratories), полимеразной цепной реакции (PCR) (Roche Diagnostics Systems, Eastman Kodak Co., Johnson & Johnson), Q-бета-репликазе (Gene Trak) и амплификации с вытеснением цепей (Becton Dickinson) обсуждают в обзоре Forbes.

Другие способы, основанные на иммунологической детекции инфекции M.tuberculosis посредством способов, не связанных с культивированием, представляют собой латекс-агглютинацию, радиоиммуноанализ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и т.д. Основным недостатком данных способов является недостаток у них чувствительности и/или специфичности (Kandival, G. V. et al., 1986; 1984; Yenez, M. A. et al., 1986). Серологические способы могут быть полезны при некоторых клинических течениях, но данный подход, в общем, ограничен из-за низкой чувствительности и/или специфичности (Daniel, T. M. and S. M. Debanne, 1987).

Развитие полимеразной цепной реакции (PCR) (Saiki et al.), позволяющей амплифицировать и детектировать ДНК из малых количеств образцов нуклеиновых кислот, сделало возможным детектировать специфические для M.tuberculosis нуклеиновые кислоты в клинических образцах. Некоторые из ранних сообщений основаны на детекции 16S рибосомной РНК или ее гена. При детекции M.tuberculosis и родственных организмов сначала амплифицируют фрагмент ДНК с применением праймеров, консервативных для всех бактерий, затем применяют видоспецифические зонды для детекции различных видов микобактерий. Главным недостатком данного способа является то, что он трудоемкий и занимает более 24 часов до окончания. Видоспецифические зонды, применяемые для детекции последовательностей различных видов в амплифицированном продукте, различаются только несколькими основаниями, и последующий анализ данной амплифицированной ДНК, основанный на гибридизации, может привести к ложноположительному тесту при проведении не совсем в идеальных условиях.

Обнаружение встроенного элемента IS6110 (Cave et al., Thierry et al.) и предположение, что данный элемент может присутствовать только в комплексе M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum и M.microti) породило целые серии стратегий быстрой диагностики (Brisson-Noel et al., Clarridge et al., Forbes et al., Hermans et al., Kolk et al., Kox et al., Zambardi et al.). Данные тесты предусматривают различные способы выделения ДНК из мокроты. Для амплификации последовательностей ДНК IS6110 из выделенной ДНК применяют PCR. Успешную амплификацию данной ДНК считают признаком присутствия инфекции M.tuberculosis . Патенты США № 5168039 и 5370998 на имя Crawford et al. посвящены детекции туберкулеза, основанной на IS6110. Другой патент США № 5731150 выдан CIBA CORNING DIAGNOSTICS CORP (Gurpreet S et.al). Guesdon J. L. опубликовал Европатент EP 0461045 по детекции туберкулеза, основанной на IS6110. Опубликовано, что элемент IS6110 присутствует в десяти, двух, одной, пяти и пяти копиях в M.tuberculosis , M.bovis, M.bovis-BCG, M.africanum и M.microti, соответственно (Spargo et al.). В большинстве сообщений при применении детекции туберкулеза, основанной на IS6110 или других PCR, заявляют о чувствительностях более 75% и специфичностях, приближающихся к 100%.

При тщательном изучении применения данной последовательности в качестве мишени для основанной на PCR диагностики M.tuberculosis выявили несколько недостатков. Анализ сравнением вслепую среди 7 основных лабораторий, описанный Noordhoek et al., поднял большой интерес, когда в нем опубликовали долю ложноположительных результатов от 3 до 77% и чувствительность в пределах от 2 до 90%. Данное исследование являлось показательным, так как позволяло всем участвующим лабораториям применять их собственные стратегии для идентификации IS6110, и конечные результаты ясно демонстрируют, что существующие протоколы обладают серьезными недостатками и по чувствительности, и по специфичности.

В другом исследовании Lee et al. (1994) сообщили о 62% ложноположительных результатов при анализе образцов спинномозговой жидкости, полученной от пациентов с туберкулезным менингитом. В то время как некоторые ложноположительные результаты можно объяснить контаминацией образца амплифицированной ДНК IS6110, происходящей из предварительно обработанных в той же самой лаборатории образцов, это не главный источник ошибки, потому что большинство лабораторий поддерживает превосходные способы защиты образцов, чтобы избежать контаминации. Такое большое число ложноположительных результатов присутствует из-за наличия последовательностей, подобных IS6110, в организмах, отличных от M.tuberculosis. IS6110 представляет собой перемещающийся встроенный элемент (Calos and Miller), а данные фрагменты ДНК обладают свойством являться «мобильными». Похоже, что IS6110 также вероятно, происходит из других организмов (или передан им), и определенные области ДНК, возможно, остались консервативными среди этих организмов в течение эволюции. В сообщении, опубликованном Mariani et al., также обсуждают горизонтальную передачу между организмами последовательностей, родственных элементу IS6110 M.tuberculosis. Этим можно объяснить некоторые ложноположительные тесты, опубликованные в литературе. Кроме того, Kent et al. удалось амплифицировать родственные IS6110 последовательности из микобактерий, отличных от M.tuberculosis , подтверждая подозрение, что подобные IS6110 последовательности присутствуют в других организмах и их можно обнаружить PCR с праймерами, специфическими для IS6110, сконструированными для детекции M.tuberculosis. Чтобы исследовать данную публикацию, провели систематический анализ последовательностей нуклеиновых кислот, хранящихся в GenBank, и участки последовательностей, подобных IS6110, обнаружили в организмах, отличных от M.tuberculosis . Многие из данных организмов обнаружены в клинических образцах.

Другим фактом, делающим IS6110 неподходящей мишенью для детекции туберкулеза, является тот, что в некоторых недавних сообщениях показано, что в некоторых изолятах M.tuberculosis последовательность IS6110 в геноме может совершенно отсутствовать, таким образом, приводя к ложноотрицательным результатам. В исследованиях азиатских изолятов сообщают, что данная последовательность может отсутствовать по меньшей мере в некоторых изолятах (Yuen, L. K., et al. 1993).

Другим очень важным аспектом для детекции, дифференцировки и лечения туберкулеза является появление вируса иммунодефицита человека (HIV). Эпидемиология и этиология туберкулеза подверглась резким изменениям со времени распространения HIV, возбудителя синдрома приобретенного иммунодефицита (AIDS). С появлением AIDS число случаев туберкулеза значительно возросло (Bafica, A. et al.). Среди смертей от AIDS более 30% обусловлены туберкулезом. С 1991 года число пациентов с туберкулезом, инфицированных HIV, возросло от 3% до более 10%. Среди пациентов с AIDS только M.tuberculosis и M.bovis не являются единственными возбудителями туберкулеза. Так называемые нетуберкулезные микобактерии становятся важными патогенами для пациентов с туберкулезом с нарушенным иммунитетом. В различных лабораториях выделили другие патогенные микобактерии, названные нетуберкулезными микобактериями, из клинических образцов, полученных от пациентов с совместной инфекцией HIV. Наиболее важными из них являются M.avium и близкородственная группа микобактерий, т.е. M.intracellulare и M.chelonae. Данные организмы известны как организмы комплекса микобактерий avium-intracellulare (комплекс MAI). Комплекс организмов MAI дает симптомы, неотличимые от туберкулеза. Они ответственны за легочные, так же как за диссеминированные формы заболевания у большого числа пациентов, особенно инфицированных вирусом иммунодефицита человека (HIV). M.avium в одиночку выделяли из вплоть до 30% клинических образцов от пациентов с легочным туберкулезом и даже из большего числа от пациентов с диссеминированным туберкулезом. M.kansassi и M.scrofulaceum представляют собой другие нетуберкулезные микобактерии, выделенные из значительного числа пациентов с AIDS и туберкулезом. Другие нетуберкулезные микобактерии также выделены из клинического образца, полученного от пациента с AIDS.

Причиной меньшего выделения нетуберкулезных микобактерий может являться недоступность простых, точных и надежных тестов для выделения и дифференцировки различных типов нетуберкулезных микобактерий. Такие данные позволяют предполагать, что нетуберкулезные микобактерии становятся важными этиологическими факторами в пробуждении распространения AIDS.

Данная информация, что IS6110 не является специфическим для M.tuberculosis и может отсутствовать во многих изолятах, вместе с фактом, что другие нетуберкулезные микобактерии являются возбудителем туберкулеза, особенно у пациентов, совместно зараженных ВИЧ. Из опубликованных сообщений ясно, что никакой существующий способ, основанный на IS6110 и других последовательностях-мишенях, не обеспечивает уровня надежности, необходимого для клинического диагностического теста.

Это усиливает необходимость изменения способа детекции туберкулеза. Это требует определения новых мишеней, обеспечивающих детекцию всех патогенных микобактерий в клиническом образце вместо детекции только группы организмов комплекса M.tuberculosis . В идеале должен существовать способ диагностики, которым вместо детекции только группы бактерий комплекса M.tuberculosis можно детектировать в клиническом образце все патогенные микроорганизмы, включая нетуберкулезные микобактерии. После детекции различных патогенных микобактерий в клиническом образце различные типы патогенных микобактерий можно дифференцировать по различным видам микобактерий способом PCR-RPLF, как описано в данном исследовании. Для пациентов, инфицированных одним NTM или NTM вместе с группой организмов комплекса M.tuberculosis, делают быструю ссылку на возможную совместную инфекцию HIV, и это может являться хорошим параметром для оценки инфекции HIV и ее распространения в популяции. Доступно немного таких тестов, которыми можно детектировать патогенные микобактерии в клинических образцах, так же как дифференцировать их.

«Mycobacterium tuberculosis Direct Test» разработан Abe et al и Miller et al. В данном тесте амплифицируют 16S рибосомальную РНК M.tuberculosis из респираторных образцов и применяют хемилюминесцентный зонд для выявления амплифицированного продукта с опубликованной чувствительностью около 91%. Данный тест является сложным, занимает более 24 часов до завершения и для идентификации различных микобактерий предусматривает пробы, различающиеся только немногими основаниями, что приводит к ложноположительному результату при выполнении даже в немного менее строгих условиях.

Успех основанного на PCR анализа зависит от нескольких факторов. Наиболее важными из них являются выделение нуклеиновой кислоты хорошего качества, подлежащей PCR, дизайн праймера для PCR, специфического для патогена, и условия PCR, в которых можно специфически амплифицировать последовательность-мишень из выделенной ДНК.

Основным недостатком доступных в настоящее время основанных на PCR анализов для детекции микобактерий является отсутствие способа выделения нуклеиновой кислоты, являющегося простым, эффективным и обеспечивающим безопасность исполнителя. Лизис микобактерий и выделение нуклеиновой кислоты из клинического образца без совместно выделяемых примесей, как известно, присутствующих в большинстве клинических образцов, является критической стадией основанного на PCR анализа. Основным недостатком опубликованных протоколов является тот, что большинство способов, применяемых для выделения нуклеиновых кислот, нельзя легко применять для всех типов образцов. Любое выделение нуклеиновой кислоты, требующее трудоемкой и неэффективной очистки ДНК, уменьшает скорость и чувствительность теста. Кроме того, вынужденность проводить различные процедуры выделения для различных типов образцов, также делает целый процесс дорогим и медленным. Безопасность исполнителя также представляет собой главную заботу при обработке образцов содержащих живые M.tuberculosis. После тщательного анализа различных способов выделения ДНК, описанных ранее, обнаружено, что они не являлись высокоэффективными или были неспособными удалить примеси, как правило, присутствующие в большинстве клинических образцов (Boom, R. C.). Таким образом, требуется простой, эффективный и надежный способ выделения нуклеиновой кислоты из различных клинических образцов для обеспечения чувствительности и воспроизводимости основанного на PCR анализа.

Специфическая и неспецифическая амплификация последовательности-мишени является другим критическим фактором для успешного основанного на PCR анализа. При малейших не оптимальных условиях даже специфические и уникальные праймеры могут приводить к неспецифической амплификации полосы правильного размера и, таким образом, приводить к ложноположительным результатам (Gurpreet, S et al.). На это необходимо направлять усилия по практическому пути с эффективными затратами.

Цель изобретения

Основной целью изобретения является предоставление способа детекции патогенных микобактерий в клинических образцах.

Другая цель изобретения относится к дизайну и композиции анализа для определения инфекции, обусловленной микобактериями, детекцией фрагмента ДНК посредством амплификации части генного кластера в различных клинических образцах, таких как мокрота, спинномозговая жидкость, образцы промывания желудка, кровь, аспираты костного мозга, образцы биоптатов тканей и т.д.

Еще одна цель изобретения относится к разработке эффективного способа выделения ДНК из всех типов клинических образцов.

Еще одной целью изобретения является формирование набора олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих специфическую амплификацию части гена посредством полимеразной цепной реакции.

Еще одной целью изобретения является способ полимеразной цепной реакции, позволяющей специфическую амплификацию мишени.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа дифференцировки между различными видами микобактерий.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, таких как мокрота, спинномозговая жидкость, образцы промывания желудка, биоптатов тканей и т.д. Новизна изобретения относится к новому фрагменту ДНК, лежащему в межгенной области между генами синтазы метилмиколовой кислоты mmaA1 и mmaA2 и в фланкирующей области генов mmaA1 и mmaA2. В данном тесте применяют пару олигонуклеотидных праймеров, специфически амплифицирующих ДНК-мишень из клинических образцов. Изобретение относится к способу выделения ДНК из клинического образца, который является более безопасным и повышает выход ДНК из клинических образцов по сравнению с существующими способами. Настоящее изобретение относится также к способу амплификации ДНК, приводящему к специфической амплификации ампликона-мишени без применения дорогих реагентов, таким образом, приводя к экономичному тесту. Настоящее изобретение относится к способу дифференцировки различных видов патогенных микобактерий в клиническом образце посредством анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) амплифицированного продукта PCR.

Краткое описание сопутствующих фигур/чертежей

Фиг.1. Схематическая диаграмма кластера генов синтазы метилмиколовой кислоты mmaA4-mmaA1 микобактерий и положение прямого A и обратного D праймеров.

Фиг.2. Последовательность генов mmaA2 и mmaA1 с межгенной областью 166 пар оснований (показана в нижнем регистре). Положение прямого A, SEQ ID No:1 и обратного праймера D, SEQ ID No:2. Последовательность обоих праймеров подчеркнута и дана наклонным шрифтом.

Фиг.3. Амплификация PCR геномных ДНК различных микобактерий с праймерами A и D (линии 1-15): 1. M.avium 2. M.bovis 3. M.chelonae 4. M fortuitum 5. M.intracellulare 6. M.kansassi 7. M.phlei 8. Маркер длины ДНК по 100 п.о. 9. M.marinum 10. M.scrofulaceum 11. M.smegmatis 12. M.szulgai 13. M.tuberculosis и 14 отрицательный контроль. AD обозначает амплифицированный продукт 363 п.о.

Фиг.4. Линейная диаграмма, показывающая карту рестрикции эндонуклеазами HaeI и MspI внутри AD.

Фиг.5. Линейная диаграмма, показывающая карту рестрикции эндонуклеазами FmuI, CviRI и TaqI внутри AD.

Фиг.6. Рестрикционная карта AD, показывающая участки рестрикции эндонуклеазами AcaIV и HaeIII.

Фиг.7. Линейная диаграмма, показывающая различные стадии реакции PCR.

Подробное описание изобретения

Целью данной работы являлась разработка комплексного способа, позволяющего быструю, безопасную и специфическую детекцию микобактерий, вызывающих туберкулез. Лимитирующими стадиями любой основанной на PCR диагностики являются выделение ДНК из клинического образца, конструирование праймера для PCR, обеспечивающего специфическую амплификацию последовательности-мишени, и разработка условий PCR, позволяющих только специфическую амплификацию последовательности-мишени. Серьезным ограничением доступных тестов является то, что они выявляют, но не могут дифференцировать различные виды микобактерий.

В различных доступных протоколах описаны различные способы выделения нуклеиновой кислоты и смеси реагентов для лизиса микобактерий и очистки нуклеиновой кислоты из клинического образца. В различных способах лизис достигают посредством обработки образца щелочами, органическими растворителями, хаотропными средствами, детергентами или их смесью. В нескольких простых способах заявляют о достижении лизиса простым кипячением в щелочи, буфере для PCR или даже в чистой воде. Хотя данные способы являются простыми и, как правило, хорошо работают в чистой культуре, они не так полезны для клинического образца. Вообще преобладающее понятие, что реакция PCR является надежной, и нуклеиновую кислоту, высвобожденную способами грубого лизиса, можно применять непосредственно в реакции PCR, не является верным. Данные способы просты в применении, но часто неспособны убить всех присутствующих в клиническом образце микобактерий, и таким образом могут быть опасны для пользователя. Опубликовано, что такие препараты содержат много примесей, которые легко могут ингибировать реакцию PCR. Обнаружено, что такие препараты могут не приводить к амплификации даже при разведении ДНК в несколько раз. Факт, что выделение чистой ДНК имеет предельную важность для успеха основанного на PCR анализа.

Авторы настоящего изобретения тщательно оптимизировали все стадии очистки нуклеиновой кислоты и разработали способ, являющийся простым, надежным, эффективным и обеспечивающим полную безопасность исполнителя. Дальнейшая обработка загрязненных образцов, таких как мокрота, щелочью средней силы и муколитическим средством, помогает удалить много загрязняющих веществ и приводит к выделению более чистой ДНК. Данные стадии полезны также для удаления других загрязняющих организмов, присутствующих в загрязненных образцах, таких как мокрота, образцы промывания желудка и т.д., так как мокрота представляет собой наиболее общеупотребительный собираемый и признанный клинический образец для легочного туберкулеза и, как известно, содержит несколько загрязнителей, являющихся потенциальным ингибитором реакции PCR. В модифицированном буфере для лизиса, разработанном по настоящему изобретению, применяют сильное хаотропное средство, т.е. изотиоцианат гуанидина. Это помогает инактивировать все микобактерии, присутствующие в клиническом образце, жестко лизировать микобактериальную клетку, денатурировать и удалить белки, что приводит к выделению более чистой ДНК (таблица 1) и также обеспечивает безопасность исполнителя. Посредством нагревания образца в модифицированном буфере для лизиса легко лизируют даже наиболее крепкие клетки и объекты, такие как споры и полиэдры бакуловируса. В более раннем сообщении той же группы показали применение изотиоцианата гуанидина для лизиса и очистки нуклеиновых кислот из жестких материалов, таких как полиэдры бакуловирусов и микобактерии (Das et al) и (Bose M. et al).

Таблица 1 Порядковые номера от одного до трех представляют собой образцы, полученные, как описано здесь, в то время как порядковые номера от четырех до шести представляют собой образцы, полученные способом Gurpreet et al.
Порядковый номер	Степень разведения	OD при 260 нм	OD при 280 нм	Отношение 260/280	Концентрация	Чистота
1	50	0,011	0,019	1,82	27,60 мкг/мл	Нет загрязнения белком
2	50	0,010	0,017	1,85	25,00 мкг/мл	Нет загрязнения белком
3	50	0,013	0,024	1,88	33,03 мкг/мл	Нет загрязнения белком
4	50	0,006	0,011	1,62	17,13 мкг/мл	Загрязнение белком
5	50	0,009	0,015	1,66	23,46 мкг/мл	Загрязнение белком
6	50	0,008	0,013	1,63	20,37 мкг/мл	Загрязнение белком

Другим преимуществом применения данного реагента является то, что большинство белков в данном буфере денатурированы, что приводит к полному лизису микобактерий, присутствующих в образцах. Описан также другой способ с применением данного реагента (Gurpreet, S et al.). Настоящий способ отличается от них по нескольким направлениям. Модифицированный буфер для лизиса по настоящему способу имеет состав, обеспечивающий более полный лизис, обеспечивает лучшую депротеинизацию и помогает осадить даже малое количество ДНК. Это приводит к получению более чистой ДНК с улучшенным выходом. Вместо применения для лизиса изотиоцианата гуанидина-трис-фенола буфер для лизиса по настоящему изобретению содержит детергент N-лаурил саркозил, 200 мМ NaCl и 10 мМ 2'-меркаптоэтанол вместе с 4M изотиоцианатом гуанидина. Так как фенол является чрезвычайно взрывоопасным и таким образом опасным, его не включили в модифицированный буфер для лизиса. Данные модификации делают модифицированный буфер для лизиса по настоящему изобретению полным и более эффективным. Детергент способствует растворению липида клеточной стенки и белка и таким образом приводит к полному лизису клеточной стенки микобактерий, богатой различными типами сложных липидов. Применение NaCl способствует осаждению нуклеиновой кислоты, присутствующей в малом количестве, и таким образом дает приблизительно в 1,4-1,5 раз лучший выход ДНК, чем способ, описанный Gurpreet et al. Это является важным, особенно при работе с клиническим образцом, обладающим малыми количествами микобактерий на мл образца. Клетки микобактерий инактивировали и лизировали нагреванием обрабатываемого и деконтаминируемого образца в модифицированном буфере для лизиса при 85°C в течение 20 мин. Это безопасно по сравнению с кипячением, как описано в нескольких способах, становящегося излишним и могущим привести к выстреливанию крышки или разрыву некоторых пробирок. Лизат экстрагировали один раз щелочным фенолом. Замечено, что депротеинизация щелочным фенолом не является излишней, как заявлено во многих протоколах. Данная простая стадия приводит к удалению всех белков, включая белки, тесно связанные с ДНК, и таким образом приводит к получению более чистой нуклеиновой кислоты. Это увеличивает воспроизводимость анализа, особенно при работе с загрязненными образцами, такими как мокрота и образцы промывания желудка. Нуклеиновую кислоту осаждали из водной фазы равным объемом изопропанола.

На следующей стадии конструировали набор олигонуклеотидных праймеров, специфический для патогенных микобактерий. Принимали меры, чтобы убедиться, что данная последовательность отсутствует у других патогенных организмов или у человека, так как нельзя исключить присутствия таких организмов или клеток человека в клинических образцах. Для данной цели применяли генный кластер mmaA1-mmaA4 микобактерий под инвентарными номерами MTCY20H10.23c-MTCY20H10.26c (фиг.1). Данный генный кластер содержит четыре гена, разделенных тремя спейсерными областями различной длины (фиг.1). Данные гены синтаз метоксимиколовой кислоты ответственны за синтез и модификацию комплекса предельных миколовых кислот, присутствующих в патогенных микобактериях. Данные миколовые кислоты вовлечены в патогенность микобактерий. Прямой праймер A, SEQ ID:3, локализован от 1 до 9 основания в гене mmaA2, 11 п.о. данного олигонуклеотидного праймера лежит в спейсерной области 167 п.о. между генами mmaA2 и mmaA1. Обратный праймер D, SEQ ID No:4 локализован от 688 до 705 основания в гене mmaA1 фиг.1 и фиг.2. Последовательности данных праймеров сконструированы с применением программного обеспечения Primer Select (Lasergene, DNASTAR) и не показывают гомологии с последовательностями организмов, отличных от M.tuberculosis и M.bovis.

Применяли также другой подход, чтобы убедиться, что данная последовательность праймера специфична для патогенных микобактерий. Олигонуклеотидную последовательность переводили в аминокислотную (пептид) и сравнивали с набором генов многих патогенных организмов и человека с применением программного обеспечения Genome Calculator, разработанного в данном институте (Institute for Genomics and Integrative Biology). Данное программное обеспечение переводит последовательность ДНК в аминокислотную (пептид) и сравнивает его со всеми последовательностями, доступными в базе данных, переводя их в библиотеку коротких пептидов. Данное программное обеспечение определило последовательности праймеров как специфичные для M.tuberculosis и M.bovis и не присутствующие ни у одного из 24 других патогенных организмов или у человека, чья последовательность генома доступна в базах данных. PCR с геномной ДНК всех тестируемых патогенных микобактерий приводила к амплификации с применением данных праймеров, в то время как PCR с применением геномной ДНК непатогенных микобактерий не приводила к амплификации фиг.3 и таблица 2.

Таблица 2 Амплификация PCR AD из различных патогенных и непатогенных видов микобактерий
Виды микобактерий	Штамм	Патогенный/непатогенный	Результат PCR
M.avium	АТСС	Патогенный	Положительный
М.bovis	ATCC	Патогенный	Положительный
M.chelonae	ATCC	Патогенный	Положительный
M.fortuitum	ATCC	Патогенный	Положительный
M.intracellulare	ATCC	Патогенный	Положительный
M.kansassi	ATCC	Патогенный	Положительный
M.marinum	ATCC	Патогенный	Положительный
M.phlei	ATCC	Непатогенный	Отрицательный
М.smegmatis	ATCC	Непатогенный	Отрицательный
M. scrofulaceum	ATCC	Патогенный	Положительный
M.szulgai	ATCC	Патогенный	Положительный
M.tuberculosis	ATCC	Патогенный	Положительный
M.xenopi	ATCC	Патогенный	Положительный

После дизайна специфического праймера следующей критической стадией являлся дизайн и разработка условий PCR, при которых специфически амплифицируют только желаемую мишень. Это очень важно, так как PCR в неоптимальных условиях приводит к амплификации другого фрагмента ДНК, близко сходного с желаемой мишенью по размеру, Gurpreet et al. Это, в свою очередь, приводит к меньшей амплификации желаемой последовательности-мишени и таким образом уменьшает специфичность и чувствительность. В отличие от праймеров, применяемых Gurpreet et al. в их изобретении, праймеры авторов настоящего изобретения не приводят к амплификации полосы приблизительно такого же размера из непатогенных микобактерий, даже в неоптимальных условиях (фиг.3).

Любая неспецифическая амплификация происходит из-за неспецифического отжига олигонуклеотидных праймеров на стадии отжига PCR. Наиболее общепринятой стратегией, чтобы избежать неспецифической амплификации, является выполнение горячего старта PCR. Этого достигают добавлением критического компонента реакции, когда реакционная смесь является горячей. Для данной цели применяют фермент, удерживаемый в восковых бусинах, или в последнее время стал доступным новый фермент термополимераза (Thermopolymerase Gold, Perkin Elmer). Данный фермент остается связанным с моноклональным антителом, полученным против данного фермента, и становится активным только после инкубации при 95°C в течение 10-15 мин. Однако применение данных мер делает тест дороже на 10-20%.

Дополнительно модифицировали условия проведения циклов, которые будут мешать отжигу праймера с участками, отличными от желаемых. Этого достигали, если несколько начальных циклов PCR проводили при более высокой температуре отжига, чем расчетная температура плавления олигонуклеотидного праймера, и затем постепенно уменьшали температуру отжига в каждом цикле и проводили остальные 25 циклов при оптимальной температуре отжига. После образования специфических ампликонов на начальных циклах они не позволяют неспецифическим продуктам конкурировать с ними на поздних циклах. Данный тип условий проведения циклов назван PCR с понижением температуры и способствует специфической амплификации без применения дорогих реагентов. Данная мера помогает сделать тест более эффективным в затратах и удобным.

Следующей стадией анализа является детекция амплифицированного продукта PCR. Амплифицированный продукт PCR можно выявлять несколькими различными способами. Наиболее общеупотребительным и простым способом детекции амплифицированного продукта PCR является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Применение агарозного геля проще, чем электрофорез в полиакриламидном геле или ELISA для ДНК, который является трудоемким, требует больше времени для детекции и большей квалификации. Полиакриламидные гели являются менее чувствительными по сравнению с агарозными гелями, так как полиакриламид гасит краситель бромид этидия, применяемый для детекции. Кроме того, акриламид является потенциальным нейротоксином и таким образом потенциально опасен для пользователя. Для разделения продукта PCR применяли способ горизонтального электрофореза в агарозном геле. Амплифицированный продукт выявляли на коротковолновом УФ-трансиллюминаторе.

Недавно описано мечение продукта PCR биотином или флуоресцентным красителем с последующей детекцией продукта посредством ELISA. Данный способ можно легко приспособить к любому из основанных на PCR анализов, включая предложенный авторами настоящего изобретения.

Данный основанный на PCR способ детекции не только предназначен для детекции различных типов патогенных микобактерий в клиническом образце, но его можно применять для их дифференцировки по различным видам с применением анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) амплифицированного PCR фрагмента. RFLP является очень мощным инструментом для различения различных видов и штаммов видов. Это основано на факте, что в каждой ДНК присутствуют участки для одной или более рестрикционных эндонуклеаз. Данные участки точно узнают рестрикционные эндонуклеазы класса II, полученные из различных бактерий. В естественном ходе эволюции организма один или несколько данных участков модифицированы или утрачены. Таким образом, рестрикция одним и тем же ферментом фрагмента ДНК приводит к полиморфизму длины фрагментов между различными видами организмов и таким образом служит эффективным инструментом для дифференцировки и эпидемиологии. AD является подходящим кандидатом для анализа PCR-RFLP различных видов микобактерий, так как данный фрагмент содержит часть двух генов с межгенной областью 167 п.о. Данный фрагмент ДНК обладает парами участков для нескольких рестрикционных эндонуклеаз, разделенными несколькими основаниями, что дает фрагменты в диапазоне размеров, пригодном для анализа электрофорезом в полиакриламидном геле, см. табл.3 (фиг.4, 5 и 6). Данные участки лежат в межгенной области, так же как в гене mmaA1 (фиг.4, фиг.5 и фиг.6). Рестрицированный продукт можно легко разделить в 10-12% полиакриламидном геле для RFLP-картирования различных видов. Присутствие межгенной области 167 п.о. в сочетании с хорошо спланированными участками для какой-нибудь общеупотребительной эндонуклеазы делает AD подходящим кандидатом для дифференцировки различных видов патогенных микобактерий посредством анализа PCR-RFLP.

Таблица 3 Размеры фрагментов ДНК для нескольких рестрикционных эндонуклеаз
Фермент	Число участников	Положение	Число фрагментов рестрикции	Размеры фрагментов
HaeI	2	47 п.о., 219 п.о.	3	47 п.о, 144 п.о. и 172 п.о.
Msp I	2	33 п.о., 244 п.о.	3	33 п.о., 119 п.о. и 211 п.о.
BsmNI	3	74 п.о., 239 п.о. и 333 п.о.	4	30, 74, 94 и 165 п.о.
CviRI	3	61, 257 и 334 п.о.	4	29, 61, 77 и 196 п.о.
MwoI	3	67, 237 и 331 п.о.	4	32, 67, 94 и 170 п.о.
TaqI	3	98, 142 и 337 п.о.	4	26, 44, 98 и 195 п.о.
Aca IV	4	45, 120, 217 и 326 п.о.	5	37, 45, 75, 97 и 109 п.о.
HaeIII	4	47, 122, 219 и 328 п.о.	5	35, 47, 75, 97 и 109 п.о.

Реагенты для PCR готовили и дозировали в чистой комнате, предназначенной для приготовления реагентов для PCR. В комнату для приготовления смесей для PCR никогда не вносили образцы, культуру или очищенную ДНК. ДНК-мишень добавляли к смеси для PCR в отдельной комнате, которая никогда не подвергалась воздействию амплифицированной ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе MJ mini thermal cycler (M. J. Research) с применением 200-мкл тонкостенных пробирок с прикрепленными индивидуальными крышками (Axygen). Первый раствор, добавленный в пробирку для ПЦР, содержал 2,0 мкл 10 х буфера для PCR (100 мМ трис pH 8,3, 500 мМ KCl, 15 мМ MgCl₂), 2,0 мкл смеси dNTP (2,0 мМ каждый из dATP, dGTP, dTTP и dCTP), 1,0 мкл праймера SEQ ID No:5=5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (5 пикомоль/мкл), 1,0 мкл праймера SEQ ID No:6=5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (5 пикомоль/мкл), 0,2 мкл Taq-полимеразы, содержащие 1 единицу фермента, и 11,8 мкл воды. Пробирки для PCR переносили в комнату для подготовки образцов и добавляли к ним по 2,0 мкл ДНК. Пробирки хорошо перемешивали постукиванием и проводили программу PCR с понижением температуры (фиг.7). Данная программа предусматривает одну начальную денатурацию при 9°C в течение 3 мин. За стадией начальной денатурации следовали 14 циклов с понижением температуры, состоящих из одной денатурации при 94°C в течение 45 секунд, одного отжига, начинающегося с 70°C в течение 45 секунд с уменьшением на 0,8°C в каждом цикле с понижением температуры и одной достройки при 72°C в течение 1 мин. За этим следовали 25 обычных циклов, состоящих из одной денатурации при 94°C в течение 45 секунд, одного отжига при 58°C в течение 45 секунд и одной достройки при 72°C в течение 1 мин. После завершения PCR пробирки переносили в другую комнату для анализа амплифицированного продукта PCR. 10 мкл из реакционной смеси наносили на 2,0% агарозный гель, другие 10 мкл реакционной смеси сохраняли для анализа PCR-RFLP, пока не потребуется.

Всего применяли 142 клинических образца, чтобы оценить данный основанный на PCR анализ для детекции патогенных микобактерий в клинических образцах. Из них 141 представляли собой образец мокроты, и один представлял собой спинномозговую жидкость.

Из 74 образцов, положительных по способу кислотоустойчивого мазка, 68 являлись также положительными по PCR. Четыре из них являлись положительными по мазку, но отрицательными по PCR. Результаты мазков всех этих пациентов имели скудное описание кислотоустойчивой микроскопии. Кроме того, повторные образцы от этих пациентов являлись положительными по PCR. Два образца, полученных от тех же самых пациентов, являлись положительными по мазку, но отрицательными по PCR. При усилении реакционной смеси, содержащей ДНК из этих образцов, очищенной ДНК, обнаружили, что эти образцы содержали ингибиторы PCR. Данные образцы снова обрабатывали модифицированным буфером для лизиса и осаждали изопропанолом, повышая амплификацию. Тридцать один пациент являлся отрицательным по кислотоустойчивой микроскопии, но положительным по PCR. Клиническая история всех данных пациентов показала, что они являлись положительными по микобактериям по способу мазка, подвергались лечению и стали отрицательными по мазку из-за низкой бактериальной нагрузки в данном образце. Остальные тридцать семь образцов являлись отрицательными и по способу мазка, и по способу PCR. При изучении их истории болезни обнаружили, что они являлись отрицательными по другим клиническим параметрам и поступили в больницу на основании предварительных симптомов, подобных жару и кашлю.

Соответственно, основной вариант осуществления по настоящему изобретению относится к способу детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, где указанный способ предусматривает стадии:

(a) очистки клинического образца от загрязнений, включая слизь, общепринятыми способами,

(b) обработки очищенных клинических образцов, полученных на стадии (a), модифицированным буфером для лизиса для инактивации живых патогенных микобактерий, чтобы сделать процесс безопасным для пользователя,

(c) выделения геномной ДНК из обработанного клинического образца, полученного на стадии (b), с применением модифицированного способа для увеличения выхода и качества ДНК,

(d) конструирование последовательности SEQ ID No:4 из ДНК, полученной на стадии (c), для специфической детекции патогенных микобактерий, где указанная сконструированная последовательность содержит выбранную межгенную область SEQ ID No:3, фланкирующую область, содержащую часть гена mmaA1, SEQ ID No:1 и часть гена mmaA2, SEQ ID No:2, из ДНК, полученной на стадии (c),

(e) конструирование и синтез набора специфических олигонуклеотидных праймеров из SEQ ID No:5, который является прямым праймером, и SEQ ID No:6, который является обратным праймером, для полимеразной цепной реакции (PCR) амплификации SEQ ID No:4,

(f) разработка способа амплификации PCR для специфической амплификации SEQ ID No:4 со стадии (d), где указанный способ предусматривает применение специфических олигонуклеотидных праймеров, сконструированных и синтезированных на стадии (e), для детекции присутствия патогенных микобактерий в клинических образцах и

(g) анализ амплифицированного продукта PCR посредством анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) для дифференцировки видов патогенных микобактерий для быстрого определения совместной инфекции HIV.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к SEQ ID No:4, где указанная SEQ ID обладает следующей последовательностью 5' GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG 3'.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к клиническим образцам, выбранным из мокроты, образцов промывания желудка, спинномозговой жидкости, крови, образцов биоптатов тканей или аспиратов костного мозга и других жидкостей организма или тканей.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к очистке образца на стадии (a) от загрязнений (живых организмов, отличных от микобактерий, и слизи), которую проводят посредством обработки смесью для деконтаминации, содержащей щелочь средней силы, NaOH, тринатрийцитрат, муколитическое средство и изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,4-2,5М с последующим концентрированием образца центрифугированием.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к обработке смесью для деконтаминации, содержащей щелочь средней силы, NaOH, тринатрийцитрат, муколитическое средство и изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,5-2,0М.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к такому, где ДНК на стадии (c) выделяют из обработанного клинического образца с применением модифицированного буфера для лизиса посредством включения ингредиентов, содержащих изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,5-8М, Трис-Cl pH 7,6 в диапазоне приблизительно 20-100 мМ, N-лаурил саркозил в диапазоне приблизительно 0,5-2%, EDTA в диапазоне приблизительно 0,1-20 мМ, -меркаптоэтанол в диапазоне приблизительно 1-25 мМ и NH ₄COOH в диапазоне приблизительно 0,3-1M, и очистки ДНК для улучшения выхода посредством полного осаждения органическими растворителями.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к приблизительно 4М изотиоцианату гуанидина, приблизительно 50 мМ Трис-Cl pH 7,6, приблизительно 1% N-лаурил саркозилу, приблизительно 1 мМ EDTA, приблизительно 10 мМ -меркаптоэтанолу, приблизительно 0,7М NH ₄COOH.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к органическим растворителям, где органические растворители выбирают из группы, включающей в себя смесь фенол/хлороформ и хлороформ.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к увеличению выхода геномной ДНК в диапазоне приблизительно от 25 до 50%.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к увеличению выхода геномной ДНК в диапазоне приблизительно от 30 до 40%.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному буферу для лизиса, где модифицированный буфер для лизиса обеспечивает получение более чистой ДНК.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к обработке, где обработка модифицированным лизирующим буфером, содержащим 4M изотиоцианат гуанидина, инактивирует живые микобактерии, чтобы сделать способ безопаснее для исполнителя.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к достижению амплификации ДНК с высоким выходом на стадии (f) посредством модифицированных условий проведения циклов PCR с понижением температуры, где указанные условия предусматривают стадии с начальной высокой температурой отжига в диапазоне приблизительно 62-72°C с последующим понижением температуры в диапазоне приблизительно 0,2-1°C на цикл PCR для первых 10-25 циклов, являющихся стадией с понижением температуры, до оптимальной температуры отжига приблизительно 56-62°C для других 30 циклов PCR.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к достижению амплификации ДНК с высоким выходом посредством модифицированных условий проведения циклов PCR с понижением температуры, где указанные условия предусматривают стадии с начальной высокой температурой отжига приблизительно 70°C с последующим с понижением температуры приблизительно 0,8°C на цикл PCR для первых приблизительно 14 циклов до приблизительно 58°C для других 25 циклов PCR.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к олигонуклеотидным праймерам, обеспечивающим амплификацию межгенной области из SEQ ID No:4 для детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, выбранным из группы

a. 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (SEQ ID No:5), являющийся прямым праймером.

b. 5'GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (SEQ ID No:6), являющийся обратным праймером.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к длине олигонуклеотидных праймеров, где длина олигонуклеотидных праймеров составляет между 5 и 100 основаниями.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностическому набору для детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, содержащему праймеры, выбранные из группы, включающей в себя:

(a) 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (SEQ ID No:5), являющийся прямым праймером, и

(b) 5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (SEQ ID No:6), являющийся обратным праймером.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению праймеров, обладающих последовательностями SEQ ID No:5 и SEQ ID No:6 для детекции патогенных микобактерий, где указанный способ предусматривает стадии:

a. выделения геномной ДНК из обработанного клинического образца с применением модифицированного способа для увеличения выхода и качества ДНК,

b. конструирование последовательности из SEQ ID No:4 из ДНК, полученной на стадии (a) для специфической детекции патогенных микобактерий, где указанная сконструированная последовательность содержит выбранную межгенную область SEQ ID No:3, фланкирующую область, содержащую часть гена mmaA1, SEQ ID NO:1 и часть гена mmaA2, SEQ ID No:2, из ДНК, полученной на стадии (a),

c. разработку способа амплификации PCR для специфической амплификации SEQ ID NO:4 со стадии (b), и

d. анализа амплифицированного продукта PCR посредством анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) для дифференцировки видов патогенных микобактерий для быстрого определения совместной инфекции HIV.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к SEQ ID No:4, где сконструированная SEQ ID No:4 обладает следующей последовательностью 5'GAGGTGTAATGCCTTTCCGGACCCTAGGTGGCCTTTCGGTGCTTGCACGGAACGCACCGATGCTTCCCCCTCCCCGCATGCTCGAGGCATGCTATCCGATACAGGGCCGCCGCACTAAACCGCGATCGAATTTGCCCAGGTCAGGGAACGGATATGAGCGGACGAG 3'.

В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению, где клинический образец выбирают из мокроты, образцов промывания желудка, спинномозговой жидкости, крови, образцов биоптатов тканей или аспиратов костного мозга и других жидкостей организма или тканей.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к очистке образца на стадии (a) от загрязнений (живых организмов, отличных от микобактерий, и слизи), которое проводят посредством обработки смесью для деконтаминации, содержащей щелочь средней силы, NaOH, тринатрийцитрат, муколитическое средство и изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,4-2,5М с последующим концентрированием образца центрифугированием.

Настоящее изобретение иллюстрируют следующими примерами, где следующие образцы даны для иллюстрации настоящего изобретения и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Реагенты

Trizma (Трис-основание), N-ацетил-L-цистеин (NALC), бромид этидия, агароза, K₂HPO₄, KH ₂PO₄, цитрат натрия, N-лаурил саркозил, EDTA, 2-меркаптоэтанол приобретены в Sigma Aldrich, USA.

Термополимераза и dNTP приобретены в New England Biolabs, USA.

Пластиковые изделия приобретены в Axygen USA и Corning-Costar USA.

Пример 2: Сбор и обработка клинических образцов

Клинические образцы 142 мокрот и одной спинномозговой жидкости от пациентов отбирали в стерильные флаконы для образцов в Ramakrishna Mission Free Tuberculosis Clinic Karol Bagh, New Delhi, India. Образцы обрабатывали немедленно каждый раз, когда это было возможно, или хранили при 4°C в течение ночи перед обработкой.

Мокрота

Образцы мокроты обрабатывали способом с NALC-NaOH. Приблизительно по 1-3 мл мокроты переносили в 15 мл центрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой (Corning Costar Corp USA). К каждому образцу добавляли 1-3 мл обрабатывающего буфера для деконтаминации, бережно перемешивали и оставляли стоять 15 минут при комнатной температуре. Образцы растворяли в 3 объемах 0,67М фосфатного буфера pH 6,8 и центрифугировали при 3500 g 15 мин в роторе с качающимися стаканами (Remi cetrifuge India). Осадки ресуспендировали в 300 мкл стерильной дистиллированной воды. Одну треть из обработанных образцов применяли для культивирования, если требовалось, а другие две трети - для PCR. Часть, отложенную для PCR, инактивировали и лизировали добавлением в пробирки 0,5 мл буфера для лизиса и нагреванием при 85°C в течение 20 мин.

Спинномозговая жидкость

Спинномозговую жидкость (CSF) считают в основном стерильной и не нуждающейся в обработке и деконтаминации. По 1-2 мл спинномозговой жидкости (CSF) переносили в микроцентрифужную пробирку (MCT) и центрифугировали при 12000 g в течение 3 минут в микроцентрифуге (Eppendorf, A.G Germany). Осадок промывали 0,067М фосфатным буфером pH 7,0 и ресуспендировали в 300 мкл стерильной дистиллированной воды. Без обработки применяли для PCR.

Пример 3: Получение мазка

Кислотоустойчивое окрашивание проводили с применением красителя основного фуксина по способу окрашивания Zeihl-Neelsen. Из слизистой части мокроты небольшую часть размазывали по области 1×2 см. Мазок недолго фиксировали нагреванием, погружали в краситель основной фуксин и недолго нагревали над горелкой Бунзена. Окраску убирали кислым спиртом, 3% серной кислотой в 95% этаноле. Стекла промывали дистиллированной водой и проводили обращенную окраску метиленовым синим (0,3% хлорид метиленового синего) 1-2 минуты. Ополаскивали водой и сушили на воздухе. Стекла исследовали под маслом иммерсионным объективом при 400x на бинокулярном микроскопе (Zeiss, Germany). Мазки оценивали по рекомендациям WHO.

Пример 4: Выделение ДНК из обработанных клинических образцов с применением модифицированного буфера для лизиса

Порцию (200 мкл) обработанного и деконтаминированного образца переносили в микроцентрифужную пробирку. Туда добавляли 500 мкл модифицированного буфера для лизиса, содержащего 4M изотиоцианат гуанидина, 50 мМ Трис-Cl (pH 8,0), 1% N-лаурил саркозил, 1 мМ EDTA, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,2М NaCl и перемешивали переворачиванием. Пробирки инкубировали при 85°C с периодическим перемешиванием в течение 20 мин для лизиса клеток. К лизату добавляли 200 мкл 2,5М ацетата аммония pH 7,6, перемешивая переворачиванием. Смесь центрифугировали при 12000 g в течение 5 минут. Супернатант один раз экстрагировали фенолом и хлороформом. ДНК осаждали 0,8 объема изопропилового спирта. Осадок тщательно промывали 70% этиловым спиртом, недолго высушивали на воздухе и растворяли в 30 мкл буфера TE (10 мМ Трис-Cl pH 8,3 и 0,01 мМ EDTA pH 8,0), 2 мкл из этого применяли для амплификации PCR.

Пример 5: Дизайн праймеров

Пару олигонуклеотидных праймеров для амплификации части жизненно важного гена патогенной микобактерии конструировали с применением программного обеспечения Primer select (программное обеспечение DNASTAR от LASERGENE INC). Гены синтазы метилмиколовой кислоты представляют собой кластер из четырех генов, mmaA1-mmaA4. Данные гены вовлечены в синтез и модификацию миколовых кислот, и сообщают, что они присутствуют только в патогенных микобактериях. 11 п.о. прямого праймера лежат в межгенной области между генами mmaA1 и mmaA2, в то время как обратный праймер локализован в гене 1 метилмиколовой синтазы (mmaA1). Данные праймеры проверяли на специфичность для микобактерий с применением программного обеспечения GENOME CALCULATOR, разработанного биоинформатическим подразделением данного центра. Прямой олигонуклеотидный праймер, SEQ ID No:5, обладает длиной 27 п.о. Обратный олигонуклеотидный праймер, SEQ ID No:6, обладает длиной 25 пар оснований. Прямой праймер локализован от 1 до 9 основания в гене mmaA2, 11 п.о. данного олигонуклеотидного праймера лежат в спейсерной области 167 п.о. между генами mmaA2 и mmaA1.

Обратный праймер D, SEQ ID No:2 локализован от 688 до 705 основания в гене mmaA1 (фиг.1 и 2). Последовательность праймера обладает семью выступающими парами оснований на 5'-конце, содержащими участок для рестрикционной эндонуклеазы Bam HI. Олигонуклеотидный праймер D также обладает семью выступающими парами оснований на 5'-конце, содержащими участок для EcoRI. С данными праймерами специфически амплифицируют участок размером 373 пары оснований, названный AD, из жизненно важного гена патогенной микобактерии.

Прямой праймер SEQ ID No:5

5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3'

Обратный праймер SEQ ID No:6

5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3'

Пример 6: Амплификация PCR AD из ДНК, выделенной из клинических образцов

Реакцию PCR проводили в реакционном объеме 20 мкл, содержащем 2,0 мкл ДНК из описанного выше выделения, 50 мМ KCI, 10 мМ Трис-Cl pH 8,3, 1,5 мМ MgCl₂ , 10 пмоль каждого олигонуклеотидного праймера и 1 единицу термополимеразы. Реакции проводили в двух повторностях, во втором случае использовали 2,0 мкл 10-кратного разведения описанной выше ДНК.

Несколько различных условий проведения циклов для получения чистого продукта PCR без неспецифической амплификации. Сначала обычные условия проведения циклов, предусматривающие одну начальную денатурацию при 95°C в течение 3 мин, с последующими 30 циклами из одной денатурации при 94°C в течение 45 сек, одного отжига праймеров при 60°C в течение 45 сек и одной достройки при 72°C в течение 1 минуты. За этим следовала конечная достройка при 72°C в течение 5 минут. Это хорошо работало с очищенной ДНК, но приводило к неспецифической амплификации с ДНК, выделенной из клинических образцов. Чтобы преодолеть это, был принят новый метод полимеразной цепной реакции.

PCR с понижением температуры

Способ PCR с понижением температуры представляет собой эффективный способ для устранения неспецифической амплификации и таким образом улучшает выход и эффективность реакции PCR. В PCR с понижением температуры температура отжига олигонуклеотидного праймера немного превышает расчетную (температуру плавления) Tm, и Tm отжига уменьшают в каждом цикле, пока не достигают желаемой температуры отжига. Данная мера не позволяет образования неспецифического продукта на начальных циклах и помогает улучшить специфическую амплификацию, так же как во много раз улучшает эффективность реакции PCR.

Условия проведения циклов PCR с понижением температуры

В данной программе после одной начальной денатурации при 95°C в течение 3 мин следовали 14 циклов с понижением температуры с одной денатурацией при 94°C в течение 45 сек, одним отжигом, начинающимся при 70°C в течение 45 сек с понижением на 0,8°C в каждом цикле, одной достройкой при 72°C в течение 1 минуты. За понижением температуры следовали 25 циклов с одной денатурацией при 94°C в течение 45 сек, одним отжигом при 58°C в течение 45 сек и одной достройкой при 72°C в течение 1 минуты.

Пример 7: Детекция амплифицированных продуктов PCR

Амплифицированные продукты PCR анализировали электрофорезом в агарозном геле. Реакционную смесь после PCR смешивали с 1,0 мкл 6x буфера для нанесения на гель, и полную реакционную смесь наносили на 1,8% агарозный гель. Приготовление гелей и прогон в них проводили в 1x TAE буфере (0,04М Трис-ацетат и 0,001М EDTA). После электрофореза гель окрашивали в окрашивающем растворе, содержащем 0,5 мкг/мл бромида этидия. Гель фотографировали и документировали с применением системы для документации Eagle eye (Stratagene).

Преимущества настоящего изобретения

Доступно несколько способов основанной на PCR детекции микобактерий в клинических образцах, как описано выше. Однако каждый способ обладает собственными недостатками, и ни один из них не является полным. Основные недостатки имеют место при выделении ДНК из клинических образцов. Клинические образцы, поставляемые в лабораторию для детекции, содержат некоторые примеси, очищаемые совместно с ДНК посредством большинства из описанных способов и мешающие дальнейшим стадиям детекции. Способ авторов настоящего изобретения для выделения ДНК устраняет данное выделение и предоставляет чистую ДНК для PCR. Другим преимуществом данного способа является выбор олигонуклеотидных праймеров для специфической амплификации фрагмента ДНК-мишени, специфической для патогенных микобактерий. Сконструирован набор праймеров, в котором один из праймеров лежит в межгенной области между жизненно важными генами микобактерий, в то время как другой локализован в жизненно важном гене. Таким образом, данная пара праймеров является крайне уникальной для патогенных микобактерий и обеспечивает специфическую амплификацию участка ДНК из патогенных микобактерий, а не из других микобактерий, как сообщали для многих доступных праймеров. Другим преимуществом данного способа является то, что он не предусматривает дорогих реагентов для амплификации PCR последовательности-мишени в строгих условиях для достижения специфической амплификации, что увеличивает стоимость теста. Вместо этого по данному способу применяют уникальные условия проведения циклов для достижения специфической амплификации ДНК-мишени. Таким образом, стоимость теста уменьшена приблизительно на 10-20%. Другое преимущество данного способа обусловлено уникальной структурой амплифицированной ДНК, которая содержит межгенную область, и ее фланкирующая область попадает на два жизненно важных гена микобактерий, что делает ее идеальной мишенью для идентификации различных штаммов патогенных микобактерий, на основании полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP). Другим преимуществом данного способа является то, что данный способ предусматривает стадию в начале теста, на которой инактивируют патогенные микобактерии в клинических образцах, что делает способ безопасным для пользователя.

Ниже предоставлена информация по списку последовательностей SEQ ID No:1, 2, 3, 4, 5, 6.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ

ЗАЯВИТЕЛЬ: CSIR

НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах

КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 06

АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ: Institute of Genomics and integrative Biology (Formerly Centre for Biochemical Technology), Mall Road, Delhi-110007, India, Tel.00-91-11-7666158. Fax. 00-91-7667471

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID No:1

1. Характеристики последовательности:

1. Длина: 861 п.о.

2. Тип: ДНК

3. Организм: М. tuberculosis

4. Источник: природная последовательность

5. Название/обозначение: mmaA1

6. Последовательность ID No:1

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID No:2

1. Характеристики последовательности:

1. Длина: 864 п.о.

2. Тип: ДНК

3. Организм: M.tuberculosis

4. Источник: природная последовательность

5. Название/Обозначение: mmaA2

6. Последовательность ID No:2

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID No:3

1. Характеристики последовательности:

1. Длина: 166 п.о.

2. Тип: ДНК

3. Организм: M.tuberculosis

4. Источник: природная последовательность

5. Название/Обозначение: межгенная область между mmaA1 и mmaA2

6. Последовательность ID No:3

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID No:4

1. Характеристики последовательности:

2. Длина: 363 п.о.

3. Тип: ДНК

3. Организм: М.tuberculosis

4. Источник: природная последовательность и искусственная последовательность

5. Название/Обозначение: область между прямым праймером (SEQ ID:5) и обратным праймером (SEQ ID No:6)

Последовательность ID No:4

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID No:5

1. Характеристики последовательности:

1. Длина: 27 п.о.

2. Тип: ДНК

5'TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3'

3. Организм: искусственная последовательность

4. Источник: синтетический олигонуклеотид

5. Название/Обозначение: прямой праймер

6. Последовательность ID No:5

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID No:6

1. Характеристики последовательности:

1. Длина: 25 п.о.

2. Тип: ДНК

5'GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3'

3. Организм: искусственная последовательность

4. Источник: синтетический олигонуклеотид

5. Название/Обозначение: обратный праймер

6. Последовательность ID No:6

Список литературных источников

Bafica A, Scanga CA, Schito ML, Hieny S, Sher A. 2003 J Immunol Aug 1; 171(3): 1123-7.

Bennedsen., J, Thomson, V.O, Pfyffer, G. E, Funke, J, Feldman, K, Beneke, A, Jenkins, P.A, Heginbothom, M., Fahr, A., Hengstler, M., Cleator, G., Clapper, P and Wilkins, E. G. I. 1996. J. Clin Microbiol. 34: 1407-1411.

Boom, R. С J. A.Sol, M. M. Salimans, C. L. Jansen, P. M. E. Wertheim-Van Dillen, and J.Van der Noorda. 1990. J. Clin. Microbiol. 28: 495-503.

Brisson-Noel, A., C. Aznar, C.Chureau, S. Nguyen, C. Pierre, M. Bartoli, R. Bonte, G. Pialoux. B. Gicquel, and G. Garrigue. 1991. Lancet 338: 364-366.

Clarridge et al. Journal of Clinical Microbiology 31:2049-2056, 1993.

Daniel, Т. M., and S.M. Debanne, 1987. Am. Rev. Res. Dis. 135: 1137-1151.

Eisenach. K.D., M.D. Cave, J, H. Bates and J. T. Crawford. 1990 J. Infect. Dis. 161: 997-981.

Hermans, P.W.M, A.R.J. Suchitema, D.V. Soolingen. C. P. H. J. Verstyner, E. M. Bik, J. E. R. Thole, A. H. J. Kolk, and J. D. A. V. Embden. 1990. J. Clin. Microbiol. 28: 1204-1213.

Kadival. G. V., T. B. M. S. Mazarelo and S. D. Chaparas 1986. J. Clin. Microbiol. 23: 901-904.

Kolk A. H. J., A. R. J. Suchitema, S. Kuijper, J. Van Leewen, P. M. W. Hermans, J. D. A. Van Embden, and R. A. Hartskreel. 1992. J. Clin. Microbiol. 30: 2567-2575.

Kent et al, J. Clin. Microbiol. 33: 2290-2293, 1995.

Kolk et al, J. Clin. Microbiol. 30: 2567-2575, 1992.

Kox at al, J. Clin. Microbiol. 32: 672-678, 1994.

Lee et al, J. Neurological Sciences 123: 173-179, 1994.

Noordhoek, G T., A. H. Т. Kaan, S. Mulder, H. Wilke, and A. H. J. Kolk. 1995. J. Clin. Pathol: 48: 810-814.

Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuichi, G.T. Horn, K.B. Mullis and H.A. Erlich, 1988. Science. 239: 487-491.

Schirm., J., Oosendrop, L.A.B, and Milder, J.G. 1995. J. Clin. Microbiol. 33: 3221-3224.

Thierry. D., A. Brisson-Noel, V. Levy-Frebault, S. Nguyen, J.Guedson, and B. Gicquel 199).

Thierry, D., Cave, M. D, Crawford, J. T, Bates, J. S, Gicquel, B. and Geusdon, J. L. 1989. Nuc. Acid. Res. 18: 188.

Yenez, M. A., M. P. Coppola, D. A. Russo, E. Delaha, S.D. Chaparas, and H. Yeager Jr. 1986. J. Clin. Microbiol. 23: 822-825.

Yuen, L.K W., Ross, B.C., Jackson, K. M. and Dwyer, B. 1993. J. Clin. Microbiol. 31: 1615-1618.

Zambardi et al, Annales de Biologie Clinique 50: 893-897, 1993.