способ определения количественного содержания примеси 4-метиламиноантипирина в многокомпонентных лекарственных препаратах жаропонижающего, аналгезирующего, противопростудного действия

Формула изобретения

Способ определения примеси 4-метиламиноантипирина (4-МААП) в многокомпонентных лекарственных препаратах жаропонижающего, аналгезирующего, противопростудного действия методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с ультрафиолетовым (УФ) детектором с использованием внешнего стандарта, отличающийся тем, что при анализе раствор испытуемых препаратов, содержащих анальгин, парацетамол, кофеин, фенобарбитал и кодеина фосфат или анальгин, напроксен, кофеин, фенобарбитал и кодеин, и раствор сравнения, представляющий собой разбавленный в 50 раз испытуемый раствор, стабилизированный сульфитом натрия, последовательно хроматографируют на жидкостном хроматографе в режиме линейного градиента концентрации ацетонитрила в подвижной фазе в течение анализа с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила с фосфатным буферным раствором, определяют площадь пика 4-МААП в два разные момента времени после начала анализа, рассчитывают по формуле площадь пика 4-МААП в момент растворения пробы и рассчитывают исходное содержание 4-МААП по формуле:

где С_а - концентрация анальгина в растворе сравнения в процентах от исходной;

S _a - площадь пика анальгина на хроматограмме раствора сравнения;

S₀- площадь пика 4-МААП в начальный момент времени, вычисленная по формуле:

где S_п - площадь пика 4-МААП на последней хроматограмме;

S₁ - площадь пика 4-МААП на первой хроматограмме;

t - разница по времени между хроматограммами;

t - время с момента растворения пробы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а именно к способам определения примесей в многокомпонентных лекарственных препаратах жаропонижающего, аналгезирующего, противопростудного действия, и может быть использовано в практике контрольно-аналитических лабораторий фармацевтических предприятий и аптечной сети. Способ относится к числу массовых.

В состав таблеток «Пенталгин Н» и «Пенталгин ФС» в качестве действующих веществ входят анальгин (0,300 г), кофеин (0,050 г) и фенобарбитал (0,010 г). Кроме этого, препараты содержат 0,008 г кодеина и 0,100 г напроксена («Пенталгин Н») и 0,008 г кодеина фосфата и 0,300 г парацетамола («Пенталгин ФС») и вспомогательные вещества и наполнители. В связи с содержанием в таблетках относительно неустойчивого анальгина в них также возможно присутствие продуктов разложения этого вещества. Для обеспечения качества препаратов и их безопасности для потребителей необходимо контролировать содержание этих примесей в процессе производства и хранения таблеток. В связи с этим проблема разработки достоверных способов их количественного определения очень актуальна. Эта задача также осложнена неустойчивостью анальгина, который разлагается в испытуемом растворе сразу же после его приготовления

Наиболее близким к заявляемому изобретению по поставленной задаче, техническому решению и достигаемым результатам является способ определения количественного содержания примесей в анальгине и его растворах для инъекций методом ВЭЖХ (А.А. Тулаганов, А.В. Михалев, Л.М. Осокина, А.П. Арзамасцев. Количественное определение содержания примесей в анальгине и его растворах для инъекций методом ВЭЖХ. Хим.-фарм. журн. - 1992. - Вып.4. - С.76 - 77), в котором анализ проводят методом ВЭЖХ с обращенно-фазовой хроматографической колонкой и ультрафиолетовым детектором, с использованием в качестве подвижной фазы смеси метанола с фосфатным буферным раствором в изократическом режиме, с использованием внешнего стандарта для количественного определения примесей в пробах.

Недостатком описанного способа является низкая точность. Так, авторами прототипа указано, что при концентрации примеси 4-метиламиноантипирина (4-МААП) от 0,1 до 6% относительное стандартное отклонение составляет 6%. Причиной этого является процесс разложения анальгина в испытуемом растворе, поэтому получаемый результат является суммой исходного содержания 4-МААП в анальгине и его количества, образовавшегося в растворе уже после растворения анализируемого образца.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения количественного содержания 4-МААП в таблетках «Пенталгин Н» и «Пенталгин ФС» без учета примеси, образовавшейся в испытуемом растворе.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что анализ ведут методом ВЭЖХ с обращенно-фазовой хроматографической колонкой и ультрафиолетовым детектором с использованием внешнего стандарта, отличающегося тем, что при анализе раствор испытуемых препаратов, содержащих анальгин, парацетамол, кофеин, фенобарбитал и кодеина фосфат или анальгин, напроксен, кофеин, фенобарбитал и кодеин и раствор сравнения, представляющий собой разбавленный в 50 раз испытуемый раствор, стабилизированный сульфитом натрия, последовательно хроматографируют на жидкостном хроматографе в режиме линейного градиента концентрации ацетонитрила в подвижной фазе в течение анализа с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила с фосфатным буферным раствором, определяют площади пика 4-МААП в два разные момента времени, затем по формуле рассчитывают площадь этой примеси в начальный момент времени и по формуле рассчитывают содержание 4-МААП в анализируемых таблетках.

Разложение анальгина начинается немедленно в момент прибавления к навеске образца водно-органического растворителя. Это подтверждается и зависимостью от времени с момента растворения содержания 4-МААП в испытуемых растворах таблеток «Пенталгин Н» (фиг.1). Поскольку для получения одной хроматограммы требуется, как минимум, 3 минуты (растворение пробы, фильтрование раствора, процесс хроматографирования), то получить значение площади примеси в начальный момент времени практически невозможно. Однако в данной работе нами была установлена возможность теоретического расчета этого значения, соответствующего содержанию 4-МААП в исходном (сухом) образце. Эта возможность основана на также установленном в данной работе линейном характере зависимости концентрации 4-МААП в испытуемом растворе таблеток от времени с момента растворения. Эта линейная зависимость подтверждается данными, представленными в табл.1. Коэффициент корреляции линейной зависимости, рассчитанный по методу наименьших квадратов, близок к 1 (0,99). С использованием этой зависимости рассчитывали значение площади пика 4-МААП в момент растворения пробы. Смысл данного расчета объясняет фиг.2. Содержание 4-МААП в анализируемых таблетках рассчитывали относительно площади пика анальгина в растворе сравнения. Раствор сравнения готовили разведением испытуемого раствора в 50 раз, то есть этот раствор содержит 2% анальгина от исходной концентрации. Для стабилизации анальгина в испытуемом растворе и в растворе сравнения в них добавляли сульфит натрия в концентрации 5,0 мг/мл. Этот реактив лишь замедляет образование 4-МААП, однако площадь пика анальгина в период производимых измерений (10 - 30 мин после растворения пробы) остается практически постоянной. Концентрацию 4-МААП рассчитывали как произведение соотношения площадей пиков 4-МААП в испытуемом растворе и анальгина в растворе сравнения на коэффициент отклика К_откл анальгина по отношению к 4-МААП. Необходимость введения K _откл обусловлена разной чувствительностью используемого в работе диодно-матричного детектора к 4-МААП и анальгину. Последнее объясняется различием коэффициентов молярного погашения этих веществ. K_откл в данной работе определяли по хроматограммам раствора, содержащим 4-МААП и анальгин в одинаковой концентрации.

Способ осуществляется следующим образом: раствор испытуемого препарата и раствор сравнения анализируют на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым (УФ) детектором и обращенно-фазовой хроматографической колонкой, отличающийся тем, что при анализе раствор испытуемых препаратов, содержащих анальгин, парацетамол, кофеин, фенобарбитал и кодеина фосфат или анальгин, напроксен, кофеин, фенобарбитал и кодеин, и раствор сравнения, представляющий собой разбавленный в 50 раз испытуемый раствор, стабилизированный сульфитом натрия, последовательно хроматографируют в режиме линейного градиента концентрации ацетонитрила в подвижной фазе в течение анализа с использованием в качестве подвижной фазы смеси ацетонитрила с фосфатным буферным раствором, определяют площади пика 4-МААП в два разные момента времени, затем по формуле рассчитывают площадь этой примеси в начальный момент времени и по формуле рассчитывают содержание 4-МААП в анализируемых таблетках

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Приготовление раствора 4-МААП определенной концентрации.

Около 0,0600 г анальгина (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл 1M HCl, доводили водой до метки, перемешивали и нагревали на водяной бане при 60°С в течение 2 часов. Концентрацию раствора рассчитывали по уравнению предполагаемой реакции и подтверждали методом ВЭЖХ. Согласно стехиометрии реакции 0,060 г анальгина соответствует 0,037 г 4-МААП.

Определение коэффициента отклика анальгина по отношению к 4-МААП.

Около 0,0600 г анальгина (точная навеска) и около 0,5 г сульфита натрия помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 40 мл воды и перемешивали до растворения веществ. Доводили полученный раствор водой до метки и перемешивали (раствор А). Около 0,5 г сульфита натрия помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли 40 мл воды и перемешивали до растворения вещества. Добавляли 2,0 мл раствора 4-МААП определенной концентрации, доводили полученный раствор водой до метки, перемешивали и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (раствор Б). 20 мкл раствора Б хроматографировали на жидкостном хроматографе с использованием обращенно-фазовой хроматографической колонки в градиентном режиме. Состав ПФ в течение анализа изменяли согласно следующей программе:

Время, мин	ПФ А, об.%	ПФ В, об.%
0	100	0
10	0	100(80)
11	0	100 (80)
12	100	0
15	100	0

В качестве подвижных фаз (ПФ) использовали растворы, содержащие ацетонитрил, 0,025М раствор калия фосфорнокислого однозамещенного и воду (объемное соотношение 10:25:65 для ПФ А и 60:25:15 для ПФ В). Для ПФ В в скобках указаны значения, использованные при анализе таблеток «Пенталгин ФС». Детектирование вели при 244 нм.

Получали не менее 3 хроматограмм, рассчитывали площади пиков анальгина и 4-МААП и рассчитывали К_откл по формуле:

где S_ан и S _4МААП - площади пиков анальгина и 4-МААП соответственно, в мВ·с;

С_4МААП и С _ан - концентрации 4-МААП и анальгина соответственно, в мг/мл.

Данные для расчета К_откл, представлены в табл.2. Согласно этим данным

К _откл=0,660.

Определение метрологических характеристик методики определения 4-МААП в таблетках «Пенталгин ФС».

Правильность методики оценивали по результатам анализа модельных растворов, содержащих все действующие и все вспомогательные вещества препарата, по методу «введено - найдено». В качестве плацебо использовали растертые таблетки. Для приготовления модельных растворов в мерные колбы вместимостью 100 мл помещали по 0,16 г плацебо (из расчета 1/5 таблетки), 0,5 г Na ₂SO₃, 10 мл H₂ O, перемешивали 2 мин, добавляли 30 мл CH₃ CN, перемешивали 2 мин, добавляли определенное количество раствора 4-МААП, доводили до метки Н₂O, перемешивали и фильтровали через гидрофильный мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Добавленные количества 4-МААП охватывали интервал от 25 до 150% от ПДК примеси в таблетках (2% от содержания анальгина). Всего готовили и анализировали 17 растворов. Параллельно готовили раствор сравнения, для чего в мерную колбу вместимостью 100 мл помещали по 0,16 г плацебо (из расчета 1/5 таблетки), 0,5 г Na ₂SO₃, 10 мл Н₂ O, перемешивали 2 мин, добавляли 30 мл CH₃ CN, перемешивали 2 мин, доводили водой до метки и перемешивали. 2,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, в которую также добавляли 0,5 г Na₂ SO₃, 10 мл Н₂О и 5 мл CH₃CN, перемешивали, доводили водой до метки и фильтровали через гидрофильный мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Полученные растворы анализировали при условиях, описанных в разделе «Определение коэффициента отклика анальгина по отношению к 4-МААП». Получали 3 хроматограммы каждого раствора и рассчитывали площади пиков 4-МААП на 1-й и 3-й хроматограммах (разница по времени 32 мин). Рассчитывали площадь пика 4-МААП в начальный момент времени S₀ по формуле:

где S_п - площадь пика 4-МААП на последней хроматограмме;

S₁ - площадь пика 4-МААП на первой хроматограмме;

t - разница по времени между 1-й и 3-й хроматограммами (32 мин);

t - время с момента растворения пробы (42 мин).

Находили содержание 4-МААП в анализируемых пробах С _пр в процентах от содержания анальгина по формуле:

где S₀ - площадь пика 4-МААП в начальный момент времени;

S_a - площадь пика анальгина на хроматограмме раствора сравнения;

С_а - концентрация анальгина в растворе сравнения в процентах от исходной (2,0 в/об.%).

Из полученных значений С_пр вычитали значения, найденные при аналогичном анализе растворов плацебо без добавок раствора 4-МААП. Полученные количества 4-МААП сравнивали с введенными и рассчитывали значения относительной ошибки. Результаты расчета, проведенного с помощью Excel, приведены в табл.3. Они показывают, что систематическая погрешность определения отсутствует, так как среднее значение относительной погрешности e _{r ср} мало и меньше доверительного интервала e_r значений относительной погрешности.

Определение содержания 4-МААП в таблетках «Пенталгин Н» и «Пенталгин ФС».

Анализ проводили аналогично описанному в разделе «Определение метрологических характеристик», но без добавления раствора 4-МААП. Навеска растертых таблеток составляла 0,160 г для «Пенталгина ФС» и 0,145 г для «Пенталгина Н». Полученные результаты представлены в табл.1 и 4, хроматограммы испытуемых растворов - на фиг.3 и 4, хроматограммы растворов сравнения - на фиг.5.

Результаты определения 4-МААП в таблетках «Пенталгин Н» Таблица 1
Лаб.работа:8-1103
t, мин	10	26	42	58	74
К откл	0,660
Sанс , мВ·с	276876	271105	266680	273029	267758
S пр, мВ·с	104537	117521	132871	147835	163576
С пр,% ( =0,05, n=3)	0,452±0,009
Лаб. работа 9-1203
Sанс, мВ·с	297893	285011	281888	286298	285393
Sпр, мВ·с	106239	120039	135575	148466	163574
Спр,%( =0,05,n=3)	0,429±0,012
Лаб. работа 10-1203
Sанс, мВ·c	274999	270255	269818	273876	272113
Sпр, мВ·с	108955	121933	137514	149956	165705
Спр, % ( =0,05, n=3)	0,478±0,009
Серия 22072005
t, мин	10	28	46	64	82
Sпр, мВ·с	113838	130561	146802	166009	185732
Cпр, % ( =0,05, n=5)	0,418±0,005
Серия 35102005
Sпр, мВ·с	123081	135576	154853	172974	189951
Спр, % ( =0,05, n=5)	0,459±0,007
Серия 471105
Sпр, мВ·с	112197	126807	144354	158498	172105
Спр, % (а=0,05, n=5)	0,423±0,003

Обозначения: S_ан - площадь пика анальгина в испытуемом растворе;

S_анс - площадь пика анальгина в растворе сравнения;

S _пр - площадь пика 4-МААП;

С_пр - концентрация 4-МААП, рассчитанная по формуле (1).

Данные для расчета коэффициента отклика анальгина по отношению к 4-МААП

Таблица 2
с ан., мг/мл	Sан, мВ·с	c4МААП, мг/мл	S4МААП, мВ·c
0,012	320128	0,0108	433026
	318617		432066
	317328		434158
S ср, мВ*с	318691		433083
Коткл ан/4МААП	0,660

Метрологические характеристики методики определения 4-МААП в таблетках «Пенталгин ФС», полученные при анализе модельных растворов

Таблица 3
Smax, %	s 2 max	ср, %	max, %	е r ср, %	er max , %	er, %
0,078	0,006	9,2	17,3	- 0,044	-3,64	0,673

Условные обозначения:

S_max - максимальное значение стандартного отклонения;

S² _max - максимальное значение дисперсии;

_ср - среднее значение относительного доверительного интервала;

_max - максимальное значение относительного доверительного интервала;

е_{r ср} - среднее значение относительной погрешности;

е_{r max} - максимальное значение относительной погрешности;

е_r - доверительный интервал значений относительной погрешности

Результаты определения 4-МААП в таблетках «Пенталгин ФС» с использованием разных растворителей.(P=0,95; n=3)