способ прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больных распространенными хроническими дерматозами

Формула изобретения

Способ прогнозирования эндогенной интоксикации (ЭИ) организма у больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, обыкновенной пузырчаткой, атопическим дерматитом) путем определения до начала лечения концентрации олигопептидов в составе молекул средней массы из плазмы крови больного, отличающийся тем, что дополнительно в плазме крови определяют концентрацию альфа ₂-макроглобулина, вычисляют отношение концентрации олигопептидов в составе молекул средней массы из плазмы крови к концентрации альфа₂-макроглобулина в плазме крови и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие ЭИ, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень ЭИ, а при значении больше 9,1 - высокую степень ЭИ организма у больного хроническим дерматозом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может применяться для прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, обыкновенной пузырчаткой, атопическим дерматитом).

Клинико-лабораторными исследованиями установлено, что тяжесть течения хронических дерматозов значительно усугубляется развитием эндогенной интоксикации (ЭИ), выраженность которой коррелирует с клиническими проявлениями и степенью метаболических нарушений в организме больного (Переслегина И.А. и соавт., 1996; Химкина Л.Н., 2001; Гараева З.Ш., 2004). В связи с этим лабораторная диагностика ЭИ имеет большое значение для прогнозирования тяжести течения распространенных хронических дерматозов и назначения адекватных методов лечения.

В качестве прототипа изобретения (Жилина Н.М. и соавт., 1999) выбран способ оценки ЭИ организма путем вычисления прогностического индекса интоксикации (ПИИ) по формуле

ПИИ=(МСМпл/МСМэр+ОПпл/ОПэр)/РСА,

где МСМпл - содержание молекул средней массы (МСМ) в плазме крови;

МСМэр - содержание МСМ в эритроцитах;

ОПпл - количество олигопептидов в составе МСМ из плазмы крови;

ОПэр - количество олигопептидов в составе МСМ из эритроцитов;

РСА - резервная связывающая способность альбумина плазмы крови.

При этом ПИИ от 0,5 до 1,5 означает отсутствие ЭИ; ПИИ от 1,55 до 3,84 - компенсаторное состояние ЭИ; ПИИ от 3,85 до 6, 24 - критическое состояние для развития тяжелой ЭИ. Для расчета ПИИ производят определение суммарного количества МСМ и олигопептидов в составе МСМ в плазме и эритроцитах крови, а также РСА.

Однако данный способ обладает рядом существенных недостатков. Для определения ПИИ требуется иметь в лаборатории набор дорогостоящего оборудования: спектрофотометр не хуже СФ-26, флуоресцентный анализатор с набором калибровочных зондов и диагностические наборы. Кроме того, для вычисления ПИИ требуется определять 5 показателей одновременно, что усложняет проведение анализа и увеличивает время его проведения в расчете на одного больного.

Задача изобретения заключается в упрощении способа прогнозирования степени ЭИ и сокращении времени проведения анализа.

Поставленная задача решается тем, что дополнительно в плазме крови определяют концентрацию альфа ₂-макроглобулина, вычисляют отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа₂-макроглобулина и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие ЭИ, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень ЭИ, а при значении больше 9,1 - высокую степень ЭИ организма у больного хроническим дерматозом.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного после поступления в стационар утром натощак берут из локтевой вены 3,0 мл крови и помещают в пробирку с гепарином. Для получения плазмы кровь центрифугируют в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавляют 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Метод определения олигопептидов.

Метод проводится с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия).

В состав набора входит следующее.

1. Реактив Фолина-Чокальтеу (2N) - 20 мл.

(смесь фосфорно-молибденовой и фосфорно-вольфрамовой кислот).

2. Сульфат меди - 0,1 г (4-10 М).

3. Цитрат натрия - 0,2 г (6,8-10 М).

4. Карбонат натрия - 10,0 г (0,094 М).

5. Раствор едкого натра (2N) - 25 мл.

6. Раствор бычьего сывороточного альбумина (250 мкг/мл) для построения калибровочного графика - 3 мл, 1 ампула.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ

Реактив А.

Цитрат натрия (3) количественно растворяют в 15 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляют сульфат меди (2) и общий объем раствора доводят дистиллированной водой до 20 мл. Полученный реактив хранится в посуде из темного стекла в течение 2-4 недель в прохладном месте.

Реактив Б.

Карбонат натрия (4) количественно растворяют приблизительно в 100 мл воды, затем полученный раствор смешивают с предварительно разведенным в 200 мл воды раствором едкого натра (5) и доводят полученный раствор до 500 мл. Полученный реактив пригоден для использования в течение месяца при условии хранения в пластмассовой таре.

Реактив Фолина (1N)

Реактив Фолина-Чокальтеу (2N) из набора разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1.

ПОСТРОЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ И ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА В ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦАХ

1. Для построения калибровочной кривой следует приготовить раствор бычьего сывороточного альбумина в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1
NN	Раствор белка 250 мкг/мл, мл	Дистиллированная вода или буфер, мл	Содержание белка в пробе (мкг)
1.	0,04	0,36	10
2.	0,08	0,32	20
3.	0,1	0,3	25
4.	0,16	0,24	40
5.	0,2	0,2	50
6.	0,28	0,12	70
7.	0,34	0,06	85
8.	0,4	-	100
9.	-	0,4	0

Соответствующий буфер рекомендуется использовать в случае, если он содержится в исследуемых образцах белка.

2. Приготовление рабочего раствора В. К 50 мл реактива Б прибавить 1 мл реактива А. Раствор В всегда готовится непосредственно перед анализом.

3. В каждую пробирку, содержащую разведения белка для калибровочного графика, прибавить по 2 мл рабочего раствора В. Перемешать и дать постоять при комнатной температуре в течение 10 мин для образования биуретовых комплексов. Затем прибавить по 0,2 мл 1N реактива Фолина-Чокальтеу, перемешать и оставить для развития окраски на 30-40 мин.

4. Измерение оптической плотности рекомендуется проводить на спектрофотометре при длине волны 740-750 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют раствор из пробирки К (контрольная проба). Возможно использование фотоколориметра, однако, в этом случае необходимо использовать кюветы с меньшей толщиной слоя, чтобы объем пробы был достаточным.

5. Строится калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка, который должен быть линейным в диапазоне концентраций от 10 до 90-100 мкг белка в образце. При использовании одних и тех же реактивов калибровочный график может использоваться в течение их срока годности.

6. Определение концентрации белка в исследуемых образцах проводится после разведения образцов таким образом, чтобы концентрация белка в них находилась в пределах линейного диапазона калибровочного графика. Например, сыворотку крови необходимо развести в 300 раз. К 0,4 мл разведенного образца (содержащего от 10 до 100 мкг белка в этом объеме) прибавить 2 мл рабочего раствора В, перемешать и дать постоять при комнатной температуре 10 мин. Затем добавить в пробирку 0,2 мл реактива Фолина (1N) и после перемешивания подождать, пока разовьется окраска 30-40 мин. Измерения проводить против контрольного раствора, не содержащего белка, в тех же условиях, что и при построении калибровочного графика.

Если оптическая плотность в исследуемых образцах не соответствует значениям, полученным при построении калибровочного графика, необходимо внести поправку при разведении и повторить определение концентрации белка.

Метод определения уровня альфа₂-макроглобулина.

Определение уровня альфа₂-макроглобулина в той же плазме крови проводится иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия). Оно основано на специфическом взаимодействии между антителами к альфа ₂-макроглобулину поликлональной антисыворотки и соответствующим антигеном при оптимальном рН в присутствии полиэтиленгликоля. Мутность раствора, возникающая в результате образования комплекса, прямо пропорциональна концентрации альфа₂ -макроглобулина в пробе.

СОСТАВ НАБОРА

1. Реагент А 2×50 мл

Фосфатный буфер, рН=7,5	20 ммоль/л
ПЭГ	>=5%
Хлорид натрия	150 ммоль/л
Азид натрия	<0,1%

2. Реагент В 2×1 мл

Поликлональные антитела к альфаз-макроглобулину

Азид натрия

<0,1% 50 ммоль/л

3. Реагент С

Буфер Гуддса, рН=7,5	50 ммоль/л
Хлорид натрия	150 ммол/л
Азид натрия	0,1%

4. Пустой флакон на 20 мл для приготовления рабочего раствора ВС может быть использован для установки на некоторых типах автоанализаторов.

ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ

Реагент А готов к применению. В нераспечатанном флаконе реагент стабилен вплоть до указанной даты при хранении 2...8°С. После вскрытия реагент сохраняет стабильность в течение 120 дней при 2...8°С.

Раствор ВС: Смешайте 1 часть реагента В и 3 части реагента С. Тщательно перемешайте, не допуская вспенивания. Раствор стабилен в течение 60 дней при хранении 2...8°С.

ПРОБЫ

Сыворотка, плазма (ЭДТА).

Стабильность: 5 дней при температуре хранения 2...8°С.

Перед проведением анализа пробы пациентов и контрольные материалы разводятся физиологическим раствором в отношении 1:21 (1v+20v).

УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЯ

Длина волны	340 (334-365) нм
Оптический путь	1 см
Температура	37°С

Измерение: по конечной точке (увеличение оптической плотности).

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до 37°С. Температура должна быть стабильной (+/-0,5°С) в течение всего определения (см. таблицу 2).

Таблица 2
Добавить в кюветы (мкл)	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная (контрольная проба)
Физиологический раствор	100	-	-
Калибратор	-	100	-
Разведенная проба/контроль	-	-	100
Реагент А	900	900	900
Раствор ВС	100	100	100

Осторожно перемешать, инкубировать 10 минут при 37°С. Измерить оптическую плотность калибратора, проб и контрольных материалов против холостой пробы. При отсутствии калибратора результат исследования выдается в усл. единицах оптической плотности = (оптическая плотность пробы × 10).

Пропорциональное изменение объемов реагентов и пробы не влияет на конечный результат.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Для проведения контроля качества рекомендуется использовать контрольные сыворотки с аттестованными для этого метода значениями альфа₂-макроглобулина.

После определения содержания олигопептидов и альфа ₂-маркоглобулина вычисляют отношение их концентраций и при его значении меньше 5,0 прогнозируют отсутствие ЭИ, при значении 5,1-9,0 - среднюю степень ЭИ, а при значении больше 9,1 - высокую степень ЭИ организма у больного хроническим дерматозом.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Больная Г-ва Т.П., 56 лет. И/б №2327, госпитализирована в НИКВИ 15.12.04. с жалобами на многочисленные высыпания на туловище и конечностях, болями в межфаланговых суставах пальцев кистей и стоп, коленных суставах, их деформацию, отечность, утреннюю скованность. Диагноз: псориаз распространенный, инфильтративно-бляшечная форма, стационарная стадия. Псориатический полиартрит.

С целью прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больного после поступления в стационар утром натощак в пробирку с гепарином взяли из локтевой вены 3,0 мл крови. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавили 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Определение количества олигопептидов в составе МСМ плазмы крови проводили с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия), уровень альфа-2 макроглобулина - иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия) и затем вычислили отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа ₂-макроглобулина, чтобы получить значение индекса протеолитической активности (ИПА) у данной больной.

Содержание олигопептидов составило 46,0 мг/л (норма 18,7±1,14 мг/л), количество альфа ₂-макроглобулина - 7,0 у.е. (в норме - 8,54±0,32 у.е.), ИПА - 6,57. Данный показатель отражает среднюю степень эндогенной интоксикации в организме и требует обязательного включения в комплекс терапии препаратов дезинтоксикационного воздействия. С этой целью, наряду с патогенетическими средствами лечения псориаза (метотрексат), больная получала энтеросорбент растительного происхождения - полифепан, физиопроцедуры, в связи с поражением суставов (электрофорез с гепарином на межфаланговые суставы кистей). В процессе лечения очаги псориаза стали менее выраженными, боли в суставах менее интенсивными. Выписана со значительным улучшением.

Пример 2. Больная Л-ва Т.Н., 53 лет. И/б №1773. Госпитализирована в НИКВИ 4.10.04. Диагноз: Псориаз распространенный, прогрессирующая стадия, экссудативная форма. Псориатический полиартрит.

С целью прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больного после поступления в стационар утром натощак в пробирку с гепарином взяли из локтевой вены 3,0 мл крови. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавили 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Определение количества олигопептидов в составе МСМ плазмы крови проводили с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия), уровень альфа-2 макроглобулина - иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия) и затем вычислили отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа2-макроглобулина, чтобы получить значение индекса протеолитической активности (ИПА) у данной больной.

Содержание олигопептидов - 38,0 мг/л (норма 18,7±1,14 мг/л), уровень альфа₂-макроглобулина 3,7 у.е. (в норме - 8,54±0,32 у.е.). ИПА составил 10,2. Данный показатель отражает высокую степень эндогенной интоксикации в организме и требует обязательного включения в комплекс терапии препаратов дезинтоксикационного воздействия парентерального введения. Значительное клиническое улучшение было достигнуто применением наряду с патогенетическими средствами лечения псориаза (метотрексат), внутривенных капельных вливаний реополиглюкина №5.

Пример 3. Больная Л-ва М.П., 44 года. И/б 1763, госпитализирована в НИКВИ 29.09.04 с жалобами на обширные высыпания по всей поверхности верхней части груди, спины, голеней. Диагноз: псориаз распространенный, прогрессирующая стадия. Псориатический артрит.

С целью прогнозирования степени эндогенной интоксикации организма у больного после поступления в стационар утром натощак в пробирку с гепарином взяли из локтевой вены 3,0 мл крови. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1500 об/мин. К 1,0 мл плазмы прибавили 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы.

Определение количества олигопептидов в составе МСМ плазмы крови проводили с использованием набора реактивов для определения белка по методу Лоури фирмы «Синтакон» (СПб, Россия), уровень альфа-2 макроглобулина - иммунотурбидиметрическим методом с использованием диагностических наборов фирмы «SENTINEL» (Италия) и затем вычислили отношение концентрации олигопептидов к концентрации альфа2-макроглобулина, чтобы получить значение индекса протеолитической активности (ИПА) у данной больной.

Содержание олигопептидов в плазме крови данной больной составило 26,0 мг/л (норма 18,7±1,14 мг/л), количество альфа2-макроглобулина - 6,5 у.е. (в норме - 8,54±0,32 у.е.), ИПА - 4,0. Данный показатель отражает отсутствие эндогенной интоксикации на момент обследования и не требует обязательного включения в комплексную терапию препаратов с дезинтоксикационным воздействием. Больная выписана со значительным улучшением состояния кожного процесса.

Всего предлагаемым методом было обследовано 34 больных псориазом, 15 - атоническим дерматитом и 10 - обыкновенной пузырчаткой.

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами перед наиболее совершенным из известных способов.

1. Используется менее дорогостоящее оборудование и реактивы. Для определения ИПА требуется только фотоэлектроколориметр и диагностические наборы.

2. Упрощается процедура оценки степени ЭИ без потери информативности и сокращается время определения в расчете на 1 больного за счет сокращения количества определяемых показателей.

Литература

1. Гараева З.И. Результаты мониторинга показателей эндогенной интоксикации и антиэндотоксинового иммунитета у больных псориазом в процессе их лечения / З.И.Гараева // Тезисы научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов. - Нижний Новгород, 2004. - С.8.

2. Жилина Н.М. Оптимизация диагностики эндогенной интоксикации / Н.М.Жилина. - Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Тула, 1999. - 122 с.

3. Переслегина И.А. Роль детоксицирующих ферментов в регуляции иммунного статуса детей с атоническим дерматитом / И.А.Переслегина, М.Л.Юдина, И.В.Майянская // Эфферентная терапия. - 1996. - №2. - С.55-59.

4. Химкина Л.Н. Значение эндогенной интоксикации при хронических дерматозах. Методы коррекции / Л.Н.Химкина, Н.А.Добротина, Т.В.Копытова // Вестник дерматологии и венерологии. - 2001. - №5. - С.40-43.