способ микроклонального размножения картофеля

Формула изобретения

Способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты, микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части, причем выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С с последующим получением микроклубней картофеля in vitro.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, картофелеводству, семеноводству картофеля, а именно к ускоренному размножению семенного картофеля на безвирусной основе.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro. Черенкование проводят на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по Мурасиге-Скугу, сахарозу, Fe-хелата, глицерин, ИУК (гетероауксина), агар-агара, витамины по Уайту и коричную кислоту. Полученные растения высаживают в грунт (RU №2181942, МПК ⁷ А01Н 4/00, С12N 5/02, опубл. 10.05.2002 г.).

Недостатками данного способа являются низкая скорость роста растений in vitro, небольшой выход растений-регенерантов и микроклубней из одного исходного растения in vitro, кроме того, приживаемость растений, выращенных на питательной среде in vitro при пересадке в грунт, составляет всего 70-80%.

Технический результат заключается в повышении жизнеспособности и ускорении роста эксплантов, увеличении коэффициента размножения растений-регенерантов и количества микроклубней in vitro, а также улучшении приживаемости растений-регенерантов при пересадки в грунт.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, в питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты. Микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части. Выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью, с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С, с последующим получением микроклубней картофеля in vitro.

Увеличение или уменьшение температуры выращивания растений-регенерантов от предлагаемой (23-25°С днем и 17-18°С ночью) и концентрации сахарозы в среде (20 г/л) приводит к снижению роста растений-регенерантов и уменьшению коэффициента их размножения.

Изменение пределов температуры получения микроклубней, предлагаемой по данному способу (8-10°С), и концентрации сахарозы в среде (80 г/л) приводит к уменьшению выхода микроклубней и их массы.

При добавлении в питательную среду 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты происходят более быстрый рост стебля, формирование хорошо развитой корневой системы и образование большого числа междоузлий, что позволяет вести повторное микрочеренкование через 3-4 недели. В результате происходит повышение коэффициента размножения, в связи с чем увеличивается выход пробирочных растений через 3 месяца после посадки одного исходного до 1,5-2 тыс. штук, в зависимости от сорта. Корневая система растений-регенерантов картофеля in vitro, культивируемых на данной среде, более мощная, и такие растения лучше укореняют в грунте (процент выживания 90-98%).

Опыты проводились в лаборатории клеточной инженерии кафедры ботаники и физиологии растений ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева» с коллекционными безвирусными сортами картофеля. Питательная среда в контрольном варианте (табл.1) готовилась по прототипу, в опытном - с добавлением 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты и 1000-2000 мг/л активированного угля.

Таблица 1.
Состав питательной среды, мг/л	Контроль (прототипя)	Предлагаемое решение
Аммоний азотнокислый	1650	1650
Калий азотнокислый	1900	1900
Кальций хлористый двухводный	440	440
Магний сернокислый семиводный	370	370
Калий фосфорнокислый однозамещенный	170	170
Борная кислота	6,2	6,2
Марганец сернокислый четырехводный	27,7	27,7
Цинк сернокислый четырехводный	8,6	8,6,
Калий йодистый	0,83	0,83
Натрий молибденовокислый двухводный	0,25	0,25
Медь сернокислая пятиводная	0,025	0,025
Кобальт хлористый шестиводный	0,025	0,025
Трилон Б	373	373
Железо сернокислое семиводное	27,8	27,8
Глицин	3	3
Коричная кислота	0,5-1,0	-
Гетероауксин	1	-
Тиамин	1,0	0,5
Пиридоксин	0,2	0,5
Пантотенат кальция	0,2	-
Активированный уголь	-	1000-2000
Аскорбиновая кислота	-	1-2
Сахароза	30000	20000-80000
Агар-агар	7000,0	7000
Вода	до 1 л	до 1 л

Способ осуществляют следующим образом.

В вымытые и высушенные пробирки (19×210 мм) наливают по 7-10 мл агаризированной среды, закрывают ватно-марлевыми пробками, составляют в медицинские бюксы, автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°С. Используют 2 варианта питательных сред, которые различают по содержанию сахарозы. Для выращивания растений-регенерантов используют питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, сахарозу, глицин, агар-агар, витамины по Уайту, 20 г/л сахарозы и дополнительно 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты, а для получения микроклубней аналогичную питательную среду, содержащую 80 мг/л сахарозы.

Микрочеренкование исходных растений производят в ламинар-боксе. Пробирочные растения, имеющие 12-15 листьев, извлекают из пробирки и черенкуют на чашке Петри. В пробирки высаживают с помощью пинцета по 2 однопочковых черенка из апикальной (верхушечной) и средней частей растения на питательную среду, содержащую 20 г/л сахарозы. Пробирки с черенками подписывают и выставляют в штативах на стеллажи с освещением 4-5 тыс. люкс люминесцентными лампами, фотопериод 16 ч и поддерживают температуру ночью 17-18°С, днем - 23-25°С для дальнейшего получения растений-регенерантов. Пробирки с черенками базальной части (2-3 черенка прикорневой зоны), высаженными на питательную среду, содержащую 80 г /л сахарозы, помещают в темноту при температуре 8-10°С для дальнейшего клубнеобразования.

В табл.2 представлена динамика развития растений-регенератов картофеля сорта Невский in vitro в зависимости от состава питательной среды по предлагаемому способу, (содержащей 20 г/л сахарозы).

Таблица 2.
Питательная среда	Возраст растения-регенеранта, сут.
	10	20	30
Длина корня, мм
Прототип	10,1±0,5	21,7±0,6	36,4±0,8
Среда 1	11,7±0,4	24,6±0,5	40,1±0,7
Среда 2	12,3±0,3	25,1±0,7	49,7±0,8
Среда 3	14,3±0,4	25,7±0,5	48,3±0,7
Среда 4	12,5±0,8	25,8±0,4	47,1±0,5
Длина побега, см
Прототип	3,1±0,5	5,7±0,6	8,4±0,8
Среда 1	3,7±0,3	6,6±0,2	9,1±0,7
Среда 2	3,9±0,3	7,1±0,7	10,7±0,8
Среда 3	4,3±0,7	7,7±0,3	11,3±0,7
Среда 4	4,9±0,8	8,8±0,4	12,2±0,5
Количество узлов/листьев, шт.
Прототип	3,0±0,1	5,7±0,6	8,1±1,7
Среда 1	3,2±0,2	6,3±0,4	9,1±0,7
Среда 2	3,4±0,3	6,6±0,8	9,7±0,6
Среда 3	3,3±0,7	6,8±0,7	10,3±0,7
Среда 4	4,1±0,8	8,8±0,4	11,2±0,5
Примечания:
Среда 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты
Среда 2 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты
Среда 3 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля
Среда 4 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля

К концу первой недели растения-регенеранты из микрочеренков в варианте с активированным углем и аскорбиновой кислотой были на 0,5-1,5 см выше растений контрольного варианта и достигали 3,5-4,9 см. В условиях опытной среды растения раньше и быстрее формировали корневую систему: к концу второй недели длина корней растений-регенерантов достигла 1,1-1,5 см, а к концу третьей - 2,5-2,6 см, в то время как в контрольном варианте она составила лишь 0,5-1,0 см и 2,0-2,2 см. Интенсивное корнеобразование в дальнейшем обеспечивало более быстрый рост стебля у растений-регенерантов. В течение третьей недели максимальный ежедневный прирост у растений по предлагаемому способу составил 5-8 мм, у растений контрольной группы 3-6 мм. Растения контрольного варианта к концу третьей недели культивирования отставали в росте на 2,0-3,5 см. К повторному черенкованию в опытных вариантах растения были готовы к концу 3-й - началу 4-й недели. Количество черенков к этому сроку на опытных растениях было 8-11 против 6-8 на контрольных (табл.3).

Таблица 3
Сорт	Контроль (прототип)	Среда 1	Среда 2	Среда 3	Среда 4
Жуковский ранний	10,3±0,4	12,3±0,4	12,2±0,1	13,5±0,2	15,2±0,1
Удача	11,3±0,4	12,3±0,4	12,2±0,1	13,5±0,2	15,2±0,1
Невский	9±0,7	9,1±0,2	9,7±0,6	10,3±0,7	11,2±0,5
Никулинский	7,2±0,7	7,5±0,2	8,7±0,6	9,3±0,3	9,7±0,1
Примечания:
Среда 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты
Среда 2 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты
Среда 3 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля
Среда 4 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля

В табл.4 представлены результаты исследований по динамике развития растений-регенерантов, полученных из различных типов черенков картофеля сорта Невский in vitro, по предлагаемому способу на среде №4, содержащей 20 г/л сахарозы и дополнительно 2000 мг/л активированного угля, 2 мг/л аскорбиновой кислоты.

Таблица 4
Тип экспланта	Возраст растения-регенеранта, сут.
	10	20	30
Длина корня, мм
апикальный	14,3±0,1	25,7±0,5	49,7±0,8
средний	12,3±0,3	25,1±0,7	48,3±0,7
базальный	11,7±0,2	24,6±0,5	40,1±0,7
Длина побега, см
апикальный	4,9±0,8	8,8±0,4	16,2±0,5
средний	3,9±0,3	7,1±0,7	12,7±0,8
базальный	3,1±0,5	5,7±0,6	10,4±0,8
Количество узлов/листьев, шт.
апикальный	4,1±0,8	8,8±0,4	15,2±0,5
средний	3,4±0,3	6,6±0,8	12,7±0,6
базальный	3,3±0,4	6,8±0,7	10,3±0,7

К концу первой недели растения-регенеранты, полученные из микрочеренков апикальной (верхушечной) и средней частей растения, были на 0,5-1,0 см выше растений, полученных из базальной части. Они раньше и быстрее формировали корневую систему. Интенсивное корнеобразование в дальнейшем обеспечивало более быстрый рост стебля у растений-регенерантов. Растения, полученные из черенков базальной части (2-3 черенка прикорневой зоны), к концу третьей недели культивирования отставали в росте на 1,5-3 см. К повторному черенкованию в опытном варианте черенки, полученные из апикальной и средней части растений, были готовы к концу 3-й недели, а базальной части - к 4-5-й неделе.

Коэффициент размножения растений-регенерантов картофеля через 4 недели после черенкования представлен в табл.5.

Таблица 5
Сорт	Апикальные	Средние	Базальные
Жуковский ранний	15,2±0,1	13,5±0,2	12,3±0,4
Удача	15,3±0,2	12,2±0,1	11,3±0,4
Невский	11,2±0,5	9,7±0,6	9,1±0,2
Никулинский	9,7±0,1	9,3±0,3	7,5±0,2

В то же время способность к клубнеобразованию у черенков различных ярусов растения различна. Черенки апикальной части растения образуют незначительное количество мелких клубней, причем значительно позже, чем черенки из базальной части растения, которые образовывают крупные микроклубни. В опытах выявлено, что масса микроклубней, полученных на однопочковых микрочеренках картофеля in vitro, выше при использовании черенков базальной части (табл.6).

Полученные предлагаемым способом микроклубни были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующим выращивании in vivo формировали здоровые растения

Таблица 6
Сорт	Масса микроклубня, мг
	Апикальная часть	Средняя часть	Базальная часть
Жуковский ранний	12,8±1,5	36,8±2,1	81,6±6,7
Удача	19,8±1,4	46,8±5,8	95,8±5,7
Невский	17,2±2,7	25,2±2,6	90,3±3,4
Никулинский	25,2±2,6	46,3±3,5	100,8±3,5

Полученные растения-регенеранты картофеля с хорошо развитыми механическими и проводящими тканями стебля, обширной корневой системой и хорошо развитыми листьями при пересадке в грунт легко адаптировались к условиям in vivo, что обеспечивало их высокую приживаемость (90-98%) по сравнению с прототипом (70-80%).

Отсюда следует, что предлагаемый способ позволяет повысить коэффициент размножения растений-регенерантов картофеля in vitro за 3 месяца последовательного черенкования на 0,2-1,5 тыс. штук от одного исходного за счет сокращения периода между повторными черенкованиями, увеличения выхода микрочеренков и пробирочных растений и их лучшей приживаемости в грунте, а также дополнительного получения микроклубней.