способ получения иммуносорбента для связывания вирусспецифических антител

Формула изобретения

1. Способ получения иммуносорбента для связывания антител, специфических к оболочечным вирусам, включающий инкубирование неорганического сорбента-носителя с вируссодержащей жидкостью, отличающийся тем, что в качестве неорганического сорбента-носителя используют ультрадисперсный кислородсодержащий графит в виде вспученных частиц слоистого графита с удельной поверхностью 1500-2000 м³/г с размером частиц 25-50 мкм, содержащий кислород в количестве 12-14 мас.% на 73-76 мас.% углерода, который предварительно подвергают кипячению в течение 10-15 мин при соотношении графит: дистиллированная вода - 1: 1000-5000 по массе, затем перемешивают, центрифугируют и полученный осадок суспендируют в водном буферном растворе, полученную суспензию сорбента-носителя при содержании графита не менее 2 мас.% инкубируют с вируссодержащей жидкостью при температуре 5-35°С.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что вируссодержащая жидкость содержит вирус гриппа.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к вирусологии - к способам получения иммуносорбентов, и может найти применение в диагностике вирусных инфекций.

Иммуносорбенты являются основными биоактивными компонентами тест-систем для иммунодиагностики. Иммуносорбенты для обнаружения антител к вирусам получают путем иммобилизации вирусов или антигенов на полимерном (RU 2138286, А61К 38/36, С07К 14/00, G01N 33/53, 27.09.1999; SU 1517545, G01N 33/53, опубл. 15.12.1993) или неорганическом носителе (RU 2140084, G01N 33/551, G01N 33/552, G01N 33/533, B01J 20/02, B01J 20/10, опубл. 20.10.1999; RU 2192013, G01N 33/543, G01N 33/531, опубл. 27.10.2002).

Например, известен способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита С, включающий инкубирование полимерного носителя с вирусспецифическим белком в течение 20-24 час при 4°С, отмывку избытка белка и высушивание полученного иммуносорбента. В качестве вирусспецифического белка используют белок, продуцируемый рекомбинантным штаммом Е. Coli, в виде раствора в ацетатном или фосфатном буфере. Для снижения неспецифической сорбции иммуносорбента его после высушивания обрабатывают 10%-ным раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота или 5-7%-ным раствором обезжиренного молока (RU 2095815, G01N 33/543, опубл. 10.11.1997).

Недостатками данного известного способа получения иммуносорбента являются его ограниченность только одним вирусспецифическим белком, а также проблематичность его применения для других носителей, в частности неорганических.

Наиболее близким к предлагаемому способу получения иммуносорбента является способ получения иммуносорбента, способного связывать антитела к вирусам гриппа, заключающийся в инкубации порошка сульфата бария (BaSO₄ ) (в качестве неорганического сорбента-носителя) с жидкостью, содержащей вирус гриппа, при 4°С в течение 1 часа из расчета 1 г BaSO₄ на начальную концентрацию вируса, равную 1 миллиону гемагглютинирующих единиц (ГЕ) или 1000 ГЕ на 1 мг BaSO₄ - используют концентрированный вирусный препарат, содержащий не менее 2000 ГЕ в 0,2 мл. Полученную взвесь центрифугируют при 2000 об/мин, осадок отмывают от избытка вируса физиологическим раствором с рН 7,2. Иммуносорбент можно хранить в лиофилизованном виде до 18 мес. или в физиологическом растворе в виде 50%-ной взвеси при 4°С до 2 мес. (Закстельская Л.Я., Шендерович С.Ф. Использование иммуносорбента для удаления противогриппозных антител из диагностических сывороток. Лабораторное дело, 1979, №12, стр.748-749 - прототип).

Недостатком способа-прототипа является низкая сорбционная способность используемого в нем сорбента-носителя, что приводит к низкой эффективности иммуносорбента в процессе связывания гриппозных антител. Кроме того, способ требует строгого соблюдения температурного режима, что усложняет процесс.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка такого способа получения иммуносорбента для связывания вирусспецифических антител, который позволит значительно повысить сорбционную способность сорбента-носителя и обеспечит высокую эффективность иммуносорбента при связывании вирусных антител и, кроме того, позволит упростить процесс.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым способом получения иммуносорбента, включающим инкубирование неорганического сорбента-носителя с вируссодержащей жидкостью, в котором, согласно изобретению, в качестве неорганического сорбента-носителя используют ультрадисперсный кислородсодержащий графит в виде вспученных частиц слоистого графита, содержащий кислород в количестве 12-14 мас.% на 73-76 мас.% углерода, который предварительно подвергают обработке водой при 95-100°С, затем центрифугируют и полученный осадок суспендируют в водном буферном растворе, полученную суспензию сорбента-носителя при содержании графита не менее 2 мас.% инкубируют с вируссодержащей жидкостью при температуре 5-35°С.

В способе можно использовать ультрадисперсный кислородсодержащий графит с удельной поверхностью 1500-2000 м³ /г и с размером частиц 25-50 мкм.

Вируссодержащая жидкость может содержать оболочечный вирус.

Оболочечный вирус в вируссодержащей жидкости может быть вирусом гриппа.

При выборе сорбента-носителя главным критерием была высокая сорбционная способность по отношению к вирусам.

Одним из наиболее известных в вирусологии сорбентов для связывания вирусов является суспензия формализованных куриных эритроцитов (Ровнова З.И. Вопросы вирусологии, 1959, №4, стр.465). Однако широкого практического применения этот сорбент не нашел, так как процесс сорбции требует строгого соблюдения специального температурного режима, при нарушении которого комплекс эритроцитов с вирусами разрушается, и вирионы выходят в раствор.

До последнего времени считалось, что сорбенты на основе активированных углей не способны удалять вирусы из воды (RU 2237022, C02F 1/28, C02F 1/50, опубл. 27.09.2004, приоритет США от 20.05.1999).

Однако ряд исследований указывает на возможность использования различных модификаций активированного угля для адсорбции вирусов.

В работе (dark K.J, Sarr A.B et al. Vet. Microbiol. 1998, v.63 (2-4), p.137-146) глина или древесный уголь использовались как сорбенты для рота- и коронавирусов коров, вызывающих гастроэнтериты у млекопитающих и птиц. В работе (Zadorozhnaia V.I. Mikrobiol. J., 1996, v.58 (3), p.83-7) угольный сорбент был предложен для удаления из растворов энтеровирусов (полиовирусов типа 2). В патенте (RU 2237022, C02F 1/28, C02F 1/50, опубл. 27.09.2004, приоритет США от 20.05.1999) предложен угольный сорбент, представляющий собой частицы активированного угля, имеющие размер от 0,1 до 5000 мкм, способный удалять патогены нано-размера, например вирусы, из воды (на примере бактериофага MS-2). Сорбент для применения помещают на фильтр специальной конструкции, при этом предусматривается предварительное экструдирование частиц активированного угля в виде полых трубок.

Следует отметить, что в зависимости от состава и способа получения активированных углей наблюдается широкий диапазон их сорбционных свойств, в частности распределения пор по размерам и величины удельной поверхности.

В настоящее время известны различные формы модифицированного графита в виде слоистых соединений графита, которые используются в различных областях хозяйства (SU 1614350, С01В 31/04, опубл. 20.02.1995; SU 1813711, С01В 31/04, опубл. 07.05.1993; RU 2089495, С01В 31/04, опубл. 10.09.1997; RU 2090498, С01В 31/04, опубл. 20.09.1997).

Для исследований был выбран ультрадисперсный кислородсодержащий графит (содержание кислорода 12-14 мас.% на 73-76 мас.% углерода) с удельной поверхностью 1500-2000 м ³/г, содержащий вспученные частицы слоистого графита размером 25-50 мкм, получение которого описано в патенте RU 2198137, С01В 31/04, опубл. 10.02.2003. Выбор данного ультрадисперсного графита был обусловлен тем, что он является относительно дешевым материалом и обладает высокой сорбционной емкостью к ароматическим и алифатическим химическим соединениям. Для адсорбции биологических объектов из водных сред данный графитовый сорбент не удобен из-за чрезвычайно низкого удельного веса (0,25 г/см³).

В результате проведенных экспериментов был разработан предлагаемый способ получения иммуносорбента, включающий предварительную обработку ультрадисперсного графита водой при 95-100°С, что позволило существенно повысить эффективность взаимодействия сорбента с объектами, адсорбируемыми из жидких сред: при гидротермической обработке (при 95-100°С) происходит замещение в исходном ультрадисперсном графите газовой компоненты жидкой средой. Одновременно происходит стерилизация сорбента-носителя.

Для получения иммуносорбента использовались оболочечные вирусы, к которым относятся, например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, арбовирусы и др. Для испытаний были взяты эталонные и эпидемические штаммы вирусов гриппа A (H1N1, H3N2) и В (относящиеся к семейству ортомиксовирусов), изолированные в период 1982-2004 гг., обладающие различной структурой поверхностных белков и соответственно физико-химическими свойствами. Вирусы гриппа культивировались в различных системах (куриные эмбрионы (КЭ), культуры тканей MDCK). В работе использовались также очищенные в градиенте концентрации сахарозы 10-50% концентрированные аллантоисные вирусы гриппа (выращенные на КЭ).

Определение концентрации вирусов в растворе проводили с помощью реакции гемагглютинирующей активности (РГА). Определение концентрации антител в сыворотках - с помощью реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА). Обе реакции осуществляли с использованием 0,75%-ной взвеси эритроцитов крови человека с 0(I) группой крови. Концентрацию белка в растворах определяли по методу Лоури (Lowry O.K. et al. Protein measurement with folin reagent. J. Biol. Chem., 1951, V.193, p.265-267).

Предлагаемый способ получения иммуносорбента осуществляют следующим образом.

Сухой ультрадисперсный кислородсодержащий графит с удельной поверхностью 1500-2000 м ³/г, содержащий вспученные частицы слоистого графита размером 25-50 мкм, смешивают с дистиллированной водой при массовом соотношении графит:вода 1:1000-5000, смесь нагревают до кипения и кипятят в течение 10-15 мин, затем перемешивают 20 мин и центрифугируют в течение не менее 10 мин при 10000 об/мин. Полученный осадок суспендируют в водном буферном растворе, например, в Трис-HCl буфере (рН 7,2). Содержание графита в суспензии не менее 2 мас.%. Полученную суспензию графита инкубируют с вируссодержащей жидкостью на шейкере при температуре 5-35°С в течение 15-30 мин и центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость исследуют на наличие вируса с помощью РГА. Осадок - иммуносорбент - отмывают физиологическим раствором с рН 7,2 (ФР) до отсутствия вируса в надосадочной жидкости (контроль по РГА) и используют в экспериментах по связыванию вирусспецифических антител из иммунных сывороток. Иммуносорбент хранят в физиологическом растворе при 4°С.

Исследование сорбции разных штаммов вирусов гриппа А и В на модифицированном гидротермической обработкой ультрадисперсном графите (сорбенте-носителе) показало, что все вирусы успешно взаимодействовали с сорбентом-носителем при разных условиях независимо от антигенных свойств поверхностных белков. Вирусы гриппа А и В сорбировались из различных вируссодержащих жидкостей: аллантоисной жидкости КЭ культуральной жидкости MDCK, ФР и буферных растворов. В опытах навески суспензии сорбента-носителя варьировались от 50 до 200 мг при постоянном объеме добавляемой вируссодержащей жидкости V_o=200 мкл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными в таблицах.

В таблице 1 приведены данные по иммобилизации различных вирусов в зависимости от концентрации вируса (титра в ГЕ) в вируссодержащей жидкости. Диапазон начальных титров вируса в вирусных препаратах - от 16 до 32768 ГЕ в 200 мкл. Начальные титры вирусов в пересчете на 1 мг суспензии сорбента-носителя находились в диапазоне от 0,3 до 650 ГЕ (в пересчете на сухой графит - 15-32500 ГЕ на 1 мг). Конечные титры (после сорбции) в растворе составляли 2-256 ГЕ (в пересчете на 1 мг суспензии сорбента-носителя 0,04-5,0 ГЕ соответственно), то есть наблюдалось падение гемагглютинирующего титра вирусов гриппа после сорбции в 8-128 раз. С увеличением концентрации вируса в исходном растворе процессы сорбции протекают эффективнее.

Таблица 1
Адсорбция вирусов гриппа А и В (50 мг 2%-ной суспензии сорбента-носителя в 200 мкл вирусного препарата)
Вирус	Антигенная формула	Система культивирования, очистка	Титр вируса в РГА, ГЕ в 0,2 мл
			До сорбции	После сорбции
А/Техас/1/77	A/H3N2	КЭ	16	<2
А/Сичуань/2/87	A/H3N2	КЭ, очищенный	2048	16
	A/H3N2	КЭ, очищенный	32768	256
А/Техас/1/77	A/H3N2	КЭ	16	<2
Эпидемическийштамм	A/H1N1	КЭ	32	4
В/Шанхай/361/02	В	КЭ	32	4
Эпидемические Штаммы	A/H1N1	MDCK	64	2
	A/H3N2		64	<2
	В		128	8

Помимо регистрации падения титра вируса в вируссодержащей жидкости в результате иммобилизации вируса на сорбенте-носителе были проведены контрольные опыты по определению (по методу Лоури) сорбции белков, присутствующих в вируссодержащей жидкости (в том числе и вирусных). Для оценки сорбционной способности сорбента-носителя использовали белки с различным молекулярным весом и различным размером молекул: аллантоисные белки, бычий сывороточный альбумин, белки иммунной сыворотки.

Было показано, что бычий сывороточный альбумин полностью сорбируется из 1%-ного водного раствора на сорбент-носитель при контакте в течение 30 мин при 22°С. Сорбция белков сыворотки происходила до 53%. При изучении взаимодействия сорбента-носителя с аллантоисной жидкостью как содержащей вирусы гриппа, так и без них, было установлено, что белки из аллантоисной жидкости, не содержащей вируса, сорбировались примерно на 64%. Процент сорбции белков на сорбент-носитель из аллантоисной вируссодержащей жидкости варьировал от 69 до 83%, то есть на долю адсорбированных вирусов приходится примерно до 19% белка. Следует отметить, что сорбция белков несколько возрастала, если аллантоисный вирус был разведен буфером.

Было проанализировано также влияние температуры и отношения массы суспензии сорбента-носителя к объему раствора, содержащего вирусы. Масса суспензии сорбента-носителя в образцах варьировала от 50 до 200 мг, объем вируссодержащей жидкости был постоянен и равнялся 200 мкл. Как показали исследования (см. таблицу 2), иммобилизация вирусов (на примере А/Сичуань/2/87 A/H3N2) происходит одинаково интенсивно при температурах от 5 до 35°С. Изменение навески суспензии сорбента-носителя от 50 до 200 мг на интенсивности сорбции вирусов не сказывается.

Таблица 2
Влияние температуры сорбции и концентрации сорбента-носителя на адсорбцию очищенного эталонного штамма вируса гриппа A(H3N2)
Вирус	Антигенная формула	Титр вируса в РГА		Температура, °С	Навеска суспензии сорбента-носителя, мг
		До сорбции	После сорбции
			64		50
				20
			64		100
А/Сичуань/ 2/87	A/H3N2	32000		20
			128	20	150
			64		200
				20
			128		150
				35
			128		150
				5

Для определения оптимального времени контакта вируссодержащей жидкости с сорбентом-носителем были проведены исследования влияния длительности ее инкубирования с сорбентом-носителем на процесс сорбции. Результаты опытов (на примере вируса А/Сичуань/2/87 A/H3N2) показали (см. таблицу 3), что сорбция происходит практически одинаково в диапазоне времени от 15 до 120 мин.

Таблица 3
Влияние длительности контакта вируссодержащей жидкости с сорбентом-носителем
Вирус	Антигенная формула	Система культивирования, очистка	Титр вируса в РГА, ГЕ в 0,2 мл		Условия сорбции
			До сорбции	После сорбции	Время, мин	ГС
А/Сичуань/2/87	A/H3N2	КЭ, очищенный, концентрированный	131072	1024	15	22
				1024	30	22
				512	60	22
				512	120	22

Особый интерес представляло определить, насколько стабильно связан вирус с сорбентом-носителем в иммуносорбенте. Для этого исследовали десорбцию вируса с иммуносорбента в два раствора: буфер Трис-HCl и ФР. В опытах иммуносорбент смешивали с одним из указанных растворов (объем 200 мкл) и выдерживали в течение 72 час при 35°С или помещали на шейкер на 1 час при 20°С. Затем иммуносорбент центрифугировали в течение 5 мин при 2000-3000 об/мин. Надосадочную жидкость исследовали на наличие вируса в РГА. Было установлено, что вирус в иммуносорбенте прочно связан с сорбентом-носителем, так как процесс десорбции выражен слабо: титры вируса в надосадочной жидкости после десорбции не превышали 8 ГЕ (см. таблицу 4).

Изучение взаимодействия иммуносорбента с антителами.

Приготовленный иммуносорбент с иммобилизованным вирусом А/Сичуань/2/87 A(H3N2) смешивали с раствором иммунной сыворотки, содержащей гомологичные антитела к этому вирусу. Смесь выдерживали при различных условиях: 1) в течение 30 мин при 22°С или при 37°С и 2) 16 час при 4°С. Затем смесь центрифугировали. Надосадочную жидкость исследовали на наличие антител в РТГА. Анализ раствора сыворотки до и после взаимодействия с иммуносорбентом показал, что титр сыворотки снижался с 1/640 до <1/20, что указывает на связывание антител к вирусу гриппа из сыворотки иммуносорбентом в исследованных условиях (таблица 5). Аналогичные результаты были получены для иммуносорбентов с вирусами гриппа A(H1N1) и В при взаимодействии с гомологичными сыворотками.

Таблица 4
Десорбция вирусов гриппа с иммуносорбента
Вирус	Антигенная формула		Система культивирования, очистка	Титры вируса в РГА				Условия десорбции
				До сорбции		После сорбции	После десорбции	Т, °С		Время, час.	Буфер
А/Сичуань/2/87	A/H3N2		КЭ, очищен.	8000		64	<2	20		1	Трис-HCl
						256	8	20		1	ФР
						64	4	35		72	Трис-HCl
						32	8	35		72	ФР
В/Шанхай/ 362/02	В		КЭ	256		32	4	20		1	Трис-HCl
Эпидемич. штаммы	A/H3N2		MDCK	128		2	<2	35		72	Трис-HCl
	В			256		64	<2	35		72	Трис-HCl
Таблица 5
Связывание антител иммуносорбентом, содержащим вирус гриппа A/H3N2, из гомологичной иммунной сыворотки
Титры иммунной сыворотки в РТГА					Условия взаимодействия сыворотки с иммунносорбентом
До взаимодействия с иммунносорбентом		После взаимодействия с иммунносорбентом			температура, °С				Время контакта
640		<20			37				30 мин
640		<20			22				30 мин
640		<20			4				16 час

Таким образом, разработанный способ получения иммуносорбента позволяет значительно повысить сорбционную способность сорбента-носителя и обеспечивает получаемому иммуносорбенту способность полностью связывать вирусспецифические антитела из иммунных сывороток. Использование различных вирусов позволит получать широкий набор иммуносорбентов для определения спектра антител в иммунных сыворотках. Способ отличается простотой и высокой воспроизводимостью.