способ оценки биологической ценности антоцианового красителя, полученного бескислотным способом

Формула изобретения

Способ оценки биологической ценности антоцианового красителя, полученного бескислотным способом, заключающийся в том, что готовят спиртовой раствор анализируемого красителя, 1-4 мкл полученного раствора наносят на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля, после высыхания пробы проводят хроматографирование восходящим способом в системе растворителей н-амиловый спирт - уксусная кислота - вода, взятых в соотношении 2:1:1, затем пластину сушат, обрабатывают 1%-ным раствором хлорного алюминия в этаноле и рассматривают в УФ-свете, а оценку биологической ценности красителя проводят по наличию в нем флавоноидов, обнаруживаемых по зонам, флуоресцирующим в УФ-свете.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам оценки биологической ценности антоциановых красителей и может быть использовано как на стадии выделения красителя из растительного сырья, так и при последующем его применении в фармацевтической, ликероводочной, безалкогольной, кондитерской и других отраслях пищевой промышленности.

Одним из наиболее распространенных в природе красящих веществ являются антоцианы. Антоцианы являются натуральными растительными красящими веществами, придающими лепесткам цветов, плодам, листьям и стеблям окраску от розовой до темно-фиолетовой. Например, присутствием антоцианов обусловлена окраска малины, черники, смородины, брусники, сливы и многих других растений, ягод и плодов.

Натуральные красящие вещества, как правило, принадлежат к числу естественных пищевых компонентов, употребляемых человеком. Безвредность большинства из них не вызывает сомнений, так как адаптация человеческого организма к естественным природным веществам совершалась в ходе эволюции. Натуральные пищевые красители содержат в своем составе, кроме красящих пигментов, другие полезные биологически активные компоненты: витамины, гликозиды, органические кислоты, ароматические вещества, микроэлементы и др. Поэтому использование их для окрашивания продуктов питания позволяет не только улучшить внешний вид, но и повысить пищевую ценность изделия.

Химическая структура антоцианов позволяет отнести их к группе природных полифенольных соединений, объединенных общим строением углеродного скелета С₆-С₃-С ₆. Сочетание С₆-С ₃-С₆ присуще не только антоциановым пигментам, но и флавоноидам, катехинам и другим группам веществ, отличающимся от антоцианов цветом и физическими свойствами. Антоцианы, как и флавоноиды, обладают антиокислительной активностью, которой придают большое значение при лечении рака, атеросклероза, гипертонической болезни и других не менее распространенных и тяжелых заболеваний.

Качественный состав антоцианов, как правило, специфичен для конкретного вида растений и довольно стабилен. Однако он зависит от сортовых особенностей и условий произрастания растения. Чаще всего встречаются следующие антоцианиды (агликоны): цианидин, пеларгонидин, дельфинидин, пеонидин, петунидин, мальвидин.

Известны различные способы анализа антоциановых красителей из растительного сырья. Однако подавляющее большинство методов рассматривают натуральные красители лишь как альтернативу искусственным пищевым красителям, упуская из внимания, что это одновременно и ценная биологически активная добавка, обладающая сильным антиоксидантным действием. В состав антоцианового красителя, выделенного из природного сырья, входят флавоноиды, присутствие которых обеспечивает высокую биологическую ценность продукта, доля которых зависит от качества используемого сырья, от соблюдения технологических условий получения красителя и сроков хранения экстракта.

Для анализа антоциановых красителей изучают спектральные характеристики их растворов, записывая спектры электронного поглощения пигментов на спектрофотометре и используют метод обращенно-фазовой ВЭЖХ (патент RU №2219783, 2003, А23С 23/00).

Первый метод не позволяет определить флавоноиды в присутствии красителей, а оценка качества красителя основана на изменении количества пигментов во времени. Второй метод позволяет определить состав красителя, но стадия подготовки пробы к анализу очень трудоемкая, длительная. И ее выполнение возможно лишь опытным аналитиком. Кроме того, для проведения анализа любым из применяемых способов необходимо дорогостоящее оборудование, и достоверность результатов во многом зависит от точности действий, проводимых экспериментатором на стадиях подготовки. С целью установления наличия флавоноидов в сумме экстрактивных веществ, включающих наряду с ними дубильные вещества, фенолкислоты и арбутин, проводят хроматографирование водно-спиртового извлечения на бумаге в системе растворителей 15% уксусная кислота и н-бутанол-уксусная кислота - вода (4:1:2), просмотр высушенных хроматограмм, обработанных раствором хлорида алюминия в УФ-свете (патент RU №2076727, 1997, А61К 35/78). Для обнаружения флавоноидов в сборе, содержащем органические кислоты, эфирные масла, тритерпеноиды, флавоноидные соединения (гиперозид, кверцетин, кемпферол, рутин) и сахара спиртовые извлечения объемом 0,1 мл наносят на бумажную хроматограмму на линию старта и рядом наносят в виде точки «свидетеля» флавоноидов. Хроматографируют нисходящим способом в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2), хроматограмму высушивают и проявляют 2-5%-ым спиртовым раствором хлористого алюминия, а затем сушат и просматривают в УФ-свете (патент RU №2135198, 1999, А61К 35/78).

При проведении хроматографирования в тонком слое сорбента отмечается более высокая воспроизводимость результатов и более эффективное разделение компонентов по сравнению с применением метода бумажной хроматографии.

Для хроматографирования восходящим способом необходима предельно простая установка - хроматографическая камера, представляющая собой стеклянный сосуд, прикрываемый крышкой, и проведение анализа предложенным способом не требует особых навыков и профессионализма экспериментатора. В этом заключается доступность и массовость метода. В случае проведения хроматографирования нисходящим способом применяют усложненную конструкцию хроматографической камеры, и анализ проводится опытным экспериментатором.

Известно применение метода хроматографирования в тонком слое сорбента для обнаружения флавоноидов в присутствии «свидетеля» для определения возможных примесей в анализируемом веществе, например, путем приготовления спиртового раствора анализируемого вещества, использование в качестве подвижной фазы систему растворителей: хлороформ - спирт - ледяная уксусная кислота - 25% раствор аммиака в соотношении 9:1:1:0,5 и обнаружение зон веществ на хроматограмме в УФ-свете (патент RU №2225205, 2004, А61К 31/4409). Данный метод достаточно чувствительный и объективный, но требует в каждом случае для четкого разделения пятен определяемых веществ применения других условий анализа.

К чистоте и качеству «свидетеля», используемого для определения флавоноидов в вышеуказанном способе, существуют высокие требования. К тому же цена данного стандарта высока. Использование в нашем случае "свидетеля" не только экономически не выгодно, но и нецелесообразно. Так как для отнесения к одному классу веществ достаточно применить качественную реакцию, характерную данному классу соединений.

Выработка натуральных пищевых красителей в настоящее время ограничена в масштабах и в ассортименте. В то же время различные отрасли пищевой промышленности испытывают большую потребность в колорантах вследствие запрещения использования ряда пищевых синтетических красителей. Немаловажным обстоятельством является и тот факт, что в Российской Федерации в настоящее время нет развитой промышленности по производству натуральных пищевых красителей и большинство пигментов ввозится из-за границы.

Для применения антоцианового красителя в пищевой, фармацевтической промышленности важно разработать простую, нетрудоемкую, доступную методику анализа, позволяющую оценивать краситель с точки зрения биологической ценности (одновременное присутствие антоцианов и других флавоноидов).

Наибольшее влияние на эффективность ТСХ влияет выбор растворителя и марки хроматографической пластины. Экспериментальная проверка представленных в литературе систем растворителей в сочетании с сорбентами для разделения компонентов антоцианового экстракта хроматографическим способом показала отсутствие оптимальной методики приводящей к хорошему результату.

Однако в случае выбранного нами объекта - антоциановых красителей, в которых основными компонентами являются антоцианы, окрашенные соединения из класса флавоноидов, вышеуказанные способы не могут быть использованы ввиду невозможности обнаружения слабоокрашенных или неокрашенных флавоноидов на их фоне.

Задачей изобретения является нахождение метода оценки биологической ценности красителя по наличию в нем флавоноидов.

Технический результат заключается в повышении чувствительности способа, позволяющего проводить определение неокрашенных и слабоокрашенных флавоноидов в антоциановых красителях, полученных бескислотным способом.

Технический результат достигается тем, что способ оценки биологической ценности антоцианового красителя заключается в том, что готовят спиртовой раствор анализируемого красителя, 1-4 мкл полученного раствора наносят на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля, после высыхания пробы проводят хроматографирование восходящим способом в системе растворителей: н-амиловый спирт - уксусная кислота - вода, взятых в соотношении 2:1:1, затем пластину сушат, обрабатывают проявителем - 1%-ным раствором хлорного алюминия в этаноле и рассматривают в УФ-свете, а оценку биологической ценности красителя проводят по наличию в нем флавоноидов, обнаруживаемых по зонам, флуоресцирующим в УФ-свете.

Новым в достижении технического результата является использование в качестве подвижной фазы системы растворителей н-амиловый спирт - уксусная кислота - вода в соотношении 2:1:1 и пластин со слоем силикагеля.

В таблице приведены значения R_f для отдельных компонентов антоциановых красителей, полученные экспериментально при их разделении заявленным способом. В графах таблицы «Компоненты» знаком «+» отмечены флавоноиды, наличие цвета свидетельствует о наличии антоцианов, пустые ячейки обозначают прочие компоненты антоциановых красителей. Из приведенных данных видно, что заявленный способ позволяет четко идентифицировать неокрашенные и слабоокрашенные флавоноиды на фоне других окрашенных антоциановых красителей и остальных компонентов антоциановых красителей.

При выполнении работы применяются стеклянные камеры цилиндрической формы высотой 20-25 см и диаметром 15 см, внутри которых создается атмосфера, насыщенная парами растворителя. Для анализа применяют пластины высотой 10 см со слоем силикагеля, руководствуясь рекомендациями по их применению. Для получения компактных «стартовых пятен» диаметром не более 4-5 мм проводили дробное (по частям) нанесение проб микрошприцем МШ-10. Элюент представляет собой смесь н-амиловый спирт: уксусная кислота: вода (2:1:1). Рекомендуется насыщать хроматографическую камеру парами элюента за час до анализа. Элюент не теряет качества при длительном хранении.

В качестве проявителя используется 1%-ный раствор хлорного алюминия в этаноле.

Так как краситель представляет собой вязкую малоподвижную массу, то небольшое количество анализируемого образца предварительно растворяют в этиловом спирте (95%).

Способ заключается в следующем: эликвоты анализируемого раствора 1-4 мкл наносят микрошприцем на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля, помещают в хроматографическую камеру, где осуществляется разделение компонентов анализируемого раствора. Как только элюент достигает линии фронта, пластину вынимают из камеры и сушат на воздухе и обрабатывают проявителем - 1%-ным раствором хлорного алюминия в этаноле и рассматривают в УФ-свете. Если наблюдают зоны, флуоресцирующие в этом свете, то делаю вывод о том, что в анализируемом растворе присутствуют флавоноиды, что указывает на высокую биологическую ценность красителя.

Экспериментально установлено что технический результат достигается независимо от применяемых марок пластин со слоем силикагеля.

Предложенный способ испытан на антоциановых красителях, полученных бескислотным способом из выжимок ежевики, каркаде, черноплодной рябины, черной смородины, которые хранились различное время.

Пример 1. Анализ красителя из ежевики (свежеприготовленный).

Краситель предварительно растворяют в этиловом спирте. Несколько проб раствора анализируемого красителя объемом 4 мкл наносят парциально микрошприцем на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля. После того как пробы подсохли, пластину погружают в хроматографическую камеру, насыщенную парами элюента н-амиловый спирт : уксусная кислота : вода (2:1:1) и осуществляют хроматографирование. Как только растворитель достигает линии фронта, пластину вынимают из камеры и сушат на воздухе. После этого пластину обрабатывают проявителем - 1%-ным раствором хлорного алюминия в этаноле. Выявляют одну зону с R _f=0,42, дающую положительную реакцию на флавоноиды (характерная реакция флоуресцирования в УФ-свете). Полученные результаты указывают на высокую биологическую ценность продукта.

Пример 2. Анализ красителя из ежевики (хранившийся 6 месяцев).

Несколько проб раствора анализируемого красителя объемом 4 мкл наносят парциально на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля. Разделение и обработку пластины проводят, как описано в примере 1. Проявитель на флавоноиды показал отрицательный результат, что указывает на отсутствие данного класса соединений в экстракте. Анализируемый образец низкой биологической ценности.

Пример 3. Анализ красителя из каркаде (свежеприготовленный).

Несколько проб анализируемого красителя объемом 1 мкл наносят парциально микрошприцем на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля. Последующие действия описаны в примере 1. В результате обработки пластины проявителем отмечают появление двух зон с R_f=0,38 и R _f=0,68, флуоресцирующих в УФ-свете. Проведенный анализ подтверждает высокую биологическую ценность красителя.

Пример 4. Анализ красителя из каркаде (хранившийся 10 месяцев).

Пробы объемом 1 мкл наносят при помощи микрошприца на стартовую линию хроматографической пластины со слоем силикагеля и проводят анализ, как в выше приведенном примере. Анализ выявил отсутствие флавоноидов в образце, следовательно, его низкую биологическую ценность.

Пример 5. Анализ красителя из черной смородины (свежеприготовленный).

Несколько проб раствора анализируемого красителя объемом 2 мкл наносят парциально микрошприцем на линию старта хроматографической пластины. Разделение и анализ образца проводят, как описано в примере 1. Положительную реакцию на флавоноиды дают компоненты с R_f=0,67 и R _f=0,85. Присутствие флавоноидов подтверждает высокую биологическую ценность продукта.

Пример 6. Анализ красителя из черной смородины (хранившийся 7 месяцев).

В результате анализа установлена низкая биологическая ценность красителя.