способ получения непрерывной клеточной линии и ее применение

Формула изобретения

1. Способ получения непрерывной клеточной линии, способной поддерживать рост альфагерпесвирусов, связанных с клетками, включающий инфицирование или трансфицирование клетки нуклеиновой кислотой или фрагментом герпесвируса, отбор клеток, которые экспрессируют указанную нуклеиновую кислоту или ее фрагмент и культивирование указанной инфицированной или трансфицированной клетки или ее потомства в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты и размножения указанной клетки или ее потомства, где указанная нуклеиновая кислота включает ген гликопротеина gE герпесвируса или его функциональный фрагмент и где экспрессия указанного гена gE или его функционального фрагмента происходит устойчиво.

2. Способ по п.1, где указанная инфицированная или трансфицированная клетка включает клетку позвоночного.

3. Способ по п.1, где указанная инфицированная или трансфицированная клетка включает клетку птицы.

4. Способ по п.1, где указанная инфицированная или трансфицированная клетка включает мышечный миобласт.

5. Способ по п.4, где указанный мышечный миобласт включает QM7.

6. Способ по п.5, где указанная клетка QM7 получена от клетки, депонированной как АТСС CRL-1962.

7. Способ по п.1, где указанный герпесвирус включает вирус болезни Марека, предпочтительно серотипа 1, 2 или 3.

8. Способ по п.7, где указанный вирус болезни Марека включает авирулентный вирус болезни Марека.

9. Способ по п.8, где указанный авирулентный штамм включает Rispens CVI988.

10. Способ по п.1, где указанная непрерывная клеточная линия способна поддерживать рост штамма вируса болезни Марека без адаптации указанного вируса.

11. Клетка непрерывной клеточной линии, способной поддерживать рост альфагерпесвирусов, связанных с клетками, включающая нуклеиновую кислоту герпесвируса или ее фрагмент, где указанная нуклеиновая кислота включает ген гликопротеина gE герпесвируса или его функциональный фрагмент, при этом экспрессия указанного гена gE или его функционального фрагмента происходит устойчиво, и где указанная клетка может проходить, по меньшей мере, 10 пассажей.

12. Применение клетки по п.11 для получения вакцины, способной индуцировать защиту от заболевания у позвоночных.

13. Применение по п.12, где указанным позвоночным является птица.

14. Применение клетки по п.11 для получения и/или поддержания и/или выделения гипервирулентного и/или очень вирулентного и/или очень вирулентного штамма, и/или вирулентного и/или авирулентного штамма вируса болезни Марека.

15. Применение по п.14, дополнительно включающее культивирование указанной клетки с указанным вирусом в присутствии генетицина, его производного или аналога.

16. Применение по п.14, где указанный штамм болезни Марека включает вирус болезни Марека серотипа 1.

17. Применение по п.14, где указанный штамм вируса болезни Марека включает EU1, или RB1B, или 584Ар80С, или CVI988.

18. Применение по п.14, где указанный штамм вируса болезни Марека включает естественный или генетически модифицированный штамм.

19. Применение клетки по п.11 для получения диагностического антигена вируса болезни Марека.

20. Способ получения и/или выделения и/или поддержания штамма вируса болезни Марека, включающий инфицирование клетки по п.11 указанным штаммом и культивирование указанной клетки в условиях, подходящих для размножения указанной клетки и получения, поддержания и выделения вируса болезни Марека.

21. Способ по п.20, включающий культивирование указанной клетки, инфицированной указанным вирусом, в присутствии генетицина, его производного или аналога.

22. Способ по п.20, где указанный штамм вируса болезни Марека включает вирус серотипа 1 и/или серотипа 2 и/или серотипа 3.

23. Способ по п.20, где указанный штамм вируса болезни Марека включает EU1, или RB1B, или 584Ар80С, или CVI988.

24. Способ по п.20, где указанный штамм вируса болезни Марека включает вакцинный штамм.

25. Способ получения диагностического антигена вируса болезни Марека, включающий получение клетки по п.11 и выделение ее компонентов.

26. Способ получения вакцины, способной индуцировать защиту от инфекции альфагерпесвирусов, связанных с клетками, у позвоночных, включающий культивирование клетки по п.11 и сбор ее компонентов клеточной культуры.

27. Способ по п.26, где указанным позвоночным является птица.

28. Вакцина, получаемая способом по п.26.

29. Применение вакцины по п.28 для получения лекарственного препарата для предотвращения и/или лечения заболевания, индуцированного альфагерпесвирусом, связанным с клетками.

30. Применение по п.29, где указанным заболеванием является заболевание, связанное с вирусом болезни Марека.

31. Применение по п.29, где указанным позвоночным является птица.

32. Способ защиты позвоночного от заболевания, включающий введение указанному млекопитающему вакцины по п.28 с фармацевтически приемлемым носителем подходящему реципиенту.

33. Способ по п.32, где указанным позвоночным является птица.

34. Применение по п.15, где указанный штамм вируса болезни Марека включает вирус серотипа 1.

35. Применение по п.34, где указанный штамм вируса болезни Марека включает EU1, или RB1B, или 584Ар80С, или CVI988.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. В частности, оно относится к получению клеточной линии, приспособленной для получения вакцины против заболеваний животных, особенно заболеваний птиц, вызываемых герпесвирусами, в частности альфагерпесвирусами. Оно также относится к получению клеточной линии, подходящей для выделения существующих и появляющихся вновь альфагерпесвирусов, таких как, например, авирулентный, вирулентный и очень вирулентный (или гипервирулентный) штаммы вируса болезни Марека.

Болезнь Марека (MD) представляет собой изнуряющее заболевание, которое поражает кур во всем мире. Ее вызывает вирус болезни Марека (MDV), alfaherpesvirus, и она характеризуется Т-клеточными лимфомами, полиневритом, общей иммуносупрессией и редко атеросклерозом ⁵. Идентифицированы три серотипа MDV, из которых только серотип 1 (MDV-1) является патогенным, тогда как серотип MDV 2 (MDV-2) и серотип 3 (герпесвирус индеек, HVT), не вызывают MD. Инфицирование MDV приводит к развитию латентной инфекции, которая является обычной для alfaherpesvirinae, однако MDV имеет уникальные свойства при сравнении с другими членами этого подсемейства вирусов, так как он может вызывать опухоли и интегрироваться в геном клетки организма хозяина ^11,12.

MD можно контролировать путем иммунизации, но несмотря на вакцинацию, развивается все больше и больше патогенных штаммов MDV ⁴. Эти штаммы классифицированы как так называемые вирулентные (v), очень вирулентные (vv) или очень вирулентные плюс (vv+) штаммы ^28,35. Вакцинация с использованием HVT способна защитить кур от инфицирования vMDV, но не может защитить от вновь появившегося в поздних 1970-х гг. vvMDV ³⁸. Вакцины, содержащие штаммы MDV-2 или комбинации HVT и MDV-2, успешно использовали в 1980-х гг. ^6,34,37,39, но в последние несколько лет были выделены новые штаммы vv+ MDV-1, такие как 648А и 584А, которые могут преодолевать бивалентную вакцинацию и вызывать острый преходящий паралич, а также существенное увеличение смертности в течение первых двух недель после инфицирования ^15,37. Появление vv+ MDV привело к введению вакцины CVI988/Rispens в США, которая используется в Европе с 1970-х гг. ^21,22,36,40.

О выделении новых высоковирулентных штаммов от вакцинированных групп птицы сообщали не только в США, но и в Европе. Сообщают об изменениях клинических признаков и клеточного тропизма для штамма С12/130 ³ . Механизмы, лежащие в основе неуклонного повышения вирулентности MDV и появления более острой нейронной формы MD, остаются неясными, но композиции вакцин и формы применения могут оказывать влияние на это явление ³⁸. MDV проявляет высокую связь с клеткой in vitro, а вакцины от MD, кроме некоторых композиций HVT, представляют собой живые куриные клетки, инфицированные агентом, которые содержатся в жидком азоте до применения ³⁰.

Культивирование MDV in vitro является крайне длительным, трудоемким и сложным для калибровки. В настоящее время имеется представление, что некоторые гликопротеины являются необходимыми для роста вируса в культивируемых клетках, так что вирус, лишенный, например, gE или gI, не распространяется в культуре совсем (Schumacher et al, J.Virol. 75: 11307-11318, 2001). Важным фактором, влияющим на стоимость получения вакцин для предотвращения инфицирования MDV и MD у домашних кур, является использование клеточных культур. К настоящему времени эффективный рост MDV является возможным только на первичных клетках кур или уток. Обычно клеточной культурой выбора для получения вакцин MDV являются фибробласты куриного эмбриона (CEF) ³⁸. Эти CEF также используют для выделения MDV, полученных из клинических источников в форме периферических клеток крови (PBC) или после индукции литической репликации MDV из трансформированных опухолевых Т-клеток. В качестве альтернативы, для выделения вирулентных и не адаптированных к клеточной культуре штаммов или культур вируса могут быть использованы первичные куриные почечные клетки (CKC) или фибробласты утиных эмбрионов (DEF). Доказано, что эти клетки лучше CEF для выделения MDV из клинических образцов. Все известные системы, которые поддерживают рост MDV в культуре, основываются на получении первичных клеточных культур, которые приходится получать непрерывно из яиц с развивающимися эмбрионами или даже вылупившихся птиц в случае CKC. Процедура получения первичных клеток не только является трудоемкой, но также имеет высокую стоимость. Это отражается тем фактом, что приблизительно 30% стоимости получения вакцины составляет получение фибробластов куриных эмбрионов. Получение вакцины очень зависит от непрерывного и надежного снабжения фертильными яйцами от специальных, свободных от патогенов (SPF), стай. SPF стаи выращивают в специальных условиях и регулярно проверяют на отсутствие птичьих патогенов. Любой перерыв в снабжении фертильными SPF яйцами прерывает получение вакцин MDV.

Даже если вирулентные и растущие штаммы MDV успешно размножены и выделены на куриных почечных клетках (CKC) или фибробластах утиных эмбрионов, вакцинные MDV или вирулентные штаммы растут эффективно на клетках CEF только после адаптации. Многие попытки размножать штамм MDV на непрерывных клеточных линиях птиц или млекопитающих потерпели неудачу. Неудачи также были вызваны потерей важных свойств вируса после выращивания на гетерологичных клетках или тем фактом, что могли быть продемонстрированы только незавершенные инфекции. В последнее десятилетие, однако, сообщали о формировании клеточных линий, конститутивно инфицированных MDV. Это, например, было показано Abujoub et al. (Acta Virologica 43: 186-191, 1999 и в EP 0775743), что клетки CHCC-OU2, перманентные производные клеток CEF, могут быть латентно инфицированы вирулентным или авирулентным штаммами MDV. Однако длительные периоды MDV-адаптации к используемой системе клеточной культуры были необходимы, при которых могли появиться изменения в генетической или антигенной композиции отдельных вирусов. Для клеточной линии CHCC-OU2 было необходимо 4 недели культивирования, до того как становились видны MDV-специфичные бляшки. Полученные клеточные линии CEF OU2.1 и OU2.2, содержали латентную форму вирулентного и опухоль-индуцирующего MDV, пока клетки не сливались. Переход из латентной в литическую инфекцию индуцировался, как только строились межклеточные контакты в культурах. Клетки были латентно инфицированы только одним штаммом и - при стечении некоторых механизмов, никому на самом деле не ясных - запускался литический цикл репликации. В заключение, в этой системе необходима специальная клеточная линия для каждого вируса, который необходимо размножать, необходимы длительные периоды адаптации, и есть трудности при выращивании клеток. Кроме того, вирулентный штамм Md11, выращенный на клетках OU-OCL2, все еще был способен индуцировать опухоли в чувствительных куриных линиях. В последнее время тестировали непрерывную клеточную линию Vero в отношении ее чувствительности в отношении роста MDV. Сообщали, что после нескольких циклов слепого пассирования и 3 недель адаптации могли быть получены очень низкие титры MDV серотипа 1 (MDV-1) и серотипа 3 (MDV-3) (т.е. низкие уровни инфекционности вируса). Как подчеркнуто выше, длительная адаптация к системам клеточных культур предрасполагает к нежелательным генетическим изменениям, которые затем могут вызывать, например, недостатки вакцины, когда вакцинные штаммы должны быть адаптированы к этим клеткам. Промышленное птицеводство всегда признавало необходимость в непрерывных клеточных линиях, которые могут быть использованы для получения вакцин от болезни Марека. Хотя разработано множество клеточных линий птиц или млекопитающих (смотри, например, ЕР 0748867 и ЕР 0884382) до настоящего изобретения, не было разработано непрерывной клеточной линии, способной быть эффективной заменой фибробластам куриных эмбрионов (CEF) при получении вакцин. Максимальный титр вируса MDV, получаемый из этих непрерывных клеточных линий, не соответствовал титру вируса, получаемому из первичных клеточных линий. Кроме того, многие гипервирулентные и вирулентные штаммы MDV не могут быть размножены на разработанных ранее непрерывных клеточных линиях и первичных клеточных линиях.

Изобретение обеспечивает способ получения непрерывной клеточной линии, преимущественно свободной от вирусов млекопитающих или птиц, способной поддерживать рост штамма герпесвируса, включающий инфицирование или трансфицирование клетки вектором, содержащим фрагмент нуклеиновой кислоты, полученный из герпесвируса, предпочтительно альфагерпесвируса, и культивирование указанной инфицированной или трансфицированной клетки или ее потомства при условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты и размножения указанной клетки или ее потомства. Учитывая, что клеточная линия является преимущественно свободной от вирусов, является необходимым условием, чтобы нуклеиновая кислота не кодировала реплицирующийся вирус герпеса как таковой, для возможности размножения при последующем инфицировании штаммом герпесвируса. Следовательно, указанная непрерывная клеточная линия, как представлено в данном описании, не является сама по себе (латентным) продуцентом вируса, но используется для культивирования или выращивания герпесвируса после заражения с помощью достаточных титров для, например, получения вакцины. Например, является достаточным, чтобы указанная нуклеиновая кислота или ее фрагмент герпесвируса содержала нуклеиновую кислоту, кодирующую структурный белок, или гликопротеин, или его часть. Примеры герпесвирусов включают вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейн-Барра, вирус простого герпеса и др. Следовательно, настоящее изобретение, помимо прочего, обеспечивает непрерывную клеточную линию, которая может поддерживать рост герпесвирусов, включая гипервирулентные, вирулентные и авирулентные штаммы MDV, без необходимости адаптации указанных штаммов для получения вакцины.

В предпочтительном варианте изобретение обеспечивает использование клетки, инфицированной или трансфицированной вектором, содержащим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент гена гликопротеина Е (gE) или его функционального фрагмента. В предпочтительном варианте изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота содержит ген гликопротеина gE вируса болезни Марека, или его функциональный фрагмент, или эквивалент гена гликопротеина gE. Предпочтительно указанный ген гликопротеина gE получают из альфагерпесвируса. Как используется в данном описании, «его функциональный фрагмент» относится к фрагменту гена/нуклеиновой кислоты, чей продукт экспрессии сохраняет свойство обеспечения/поддержки роста вируса, предпочтительно роста герпесвируса, в указанной непрерывной клеточной линии. «Эквивалент» гена гликопротеина gE, как используется в данном описании, представляет собой любой сходный ген (т.е. функционально эквивалентный), например ген гликопротеина gE, полученный от другого герпесвируса, такого как альфагерпесвирус, чей продукт экспрессии обладает свойством обеспечения/поддержки роста вируса в указанной непрерывной клеточной линии. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота содержит ген гликопротеина gI вируса болезни Марека, или его функциональный фрагмент, или эквивалент гена гликопротеина gI. Предпочтительно, указанный ген гликопротеина gI получают из альфагерпесвируса. Как используется в данном описании, «его функциональный фрагмент» относится к фрагменту гена/нуклеиновой кислоты, чей продукт экспрессии сохраняет свойство обеспечения/поддержки роста вируса, предпочтительно роста герпесвируса, в указанной непрерывной клеточной линии. «Эквивалент» гена гликопротеина gI, как используется в данном описании, представляет собой любой сходный ген (т.е. функционально эквивалентный), например ген гликопротеина gI, полученный от другого герпесвируса, такого как альфагерпесвирус, чей продукт экспрессии обладает свойством обеспечения/поддержки роста вируса в указанной непрерывной клеточной линии. В другом предпочтительном варианте воплощения изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота содержит ген гликопротеина gI вируса болезни Марека, или его функциональный фрагмент, или эквивалент гена гликопротеина gI. Предпочтительно указанный ген гликопротеина gI получают из альфагерпесвируса. Как используется в данном описании, «его функциональный фрагмент» относится к фрагменту гена/нуклеиновой кислоты, чей продукт экспрессии сохраняет свойство обеспечения/поддержки роста вируса, предпочтительно роста герпесвируса, в указанной непрерывной клеточной линии. «Эквивалент» гена гликопротеина gI, как используется в данном описании, представляет собой любой сходный ген (т.е. функционально эквивалентный), например ген гликопротеина gI, полученный от другого герпесвируса, такого как альфагерпесвирус, чей продукт экспрессии обладает свойством обеспечения/поддержки роста вируса в указанной непрерывной клеточной линии. В предпочтительном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ получения непрерывной клеточной линии, способной поддерживать рост штамма вируса болезни Марека, включающий инфицирование или трансфицирование клетки вектором, содержащим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент штамма вируса болезни Марека, и культивирование указанной инфицированной или трансфицированной клетки или ее потомства в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты и размножения указанной клетки или ее потомства. Необходимо, чтобы такая нуклеиновая кислота не кодировала реплицирующийся вирус болезни Марека как таковой, допуская возможность размножения при последующем инфицировании штаммом герпесвируса. Непрерывная клеточная линия, как используется в данном описании, представляет собой установившуюся/стойкую клеточную линию, которая может выращиваться без ограничений и может проходить, по меньшей мере, 10 пассажей. К тому же, желательно, чтобы указанная непрерывная клеточная линия, хотя и снабженная фрагментом нуклеиновой кислоты, полученной от герпесвируса, являлась свободной от вирусов птиц или млекопитающих, как, между прочим, не было в случае перепелиной клеточной линии QT-35, которая оказалась латентно инфицирована MDV. Под использованием термина «клетка или ее потомство» понимают, что указанная клетка может быть культивирована и выращена от одной клетки до получения клеточной линии с использованием коммерчески доступной культуральной среды в известных условиях, подходящих для размножения птичьих клеток. Под «инфицированием» или «трансфицированием» подразумевают перенос ДНК вируса или его фрагмента(ов) в клетки птицы или млекопитающего. Способы переноса гена в клетки известны специалисту в области техники. Например, способ трансфицирования может включать известные методики, используемые для трансфицирования ДНК в клетки, такие как осаждение фосфатом кальция, с использованием полибрена, ДЭАЭ-декстрана, липофектина, электропорирования или слияния протопласта.

Вектор, как используется в данном описании, включает любой носитель для доставки гена, который способен доставлять нуклеиновую кислоту в указанную клетку, такой как, например, плазмидный вектор (pcDNA3, Invitrogen). Нуклеиновая кислота, как используется в данном описании, относится к последовательности нуклеиновой кислоты герпесвируса, предпочтительно альфагерпесвируса и еще более предпочтительно вируса болезни Марека, такой как, например, ген, эквивалентный гликопротеину Е (gE) альфагерпесвирусов или его фрагменту. Предпочтительный штамм вируса болезни Марека выбирают из вируса болезни Марека онкогенного серотипа-1 (MDV-1), и/или неонкогенного серотипа-2 (MDV-2), и/или неонкогенного серотипа-3, герпесвируса индейки (HVT). Такая нуклеиновая кислота по изобретению может экспрессироваться непрерывно или кратковременно под контролем собственных регуляторных элементов клетки или гетерологичных регуляторных элементов (т.е. постоянно активными регуляторными элементами или индуцируемыми регуляторными элементами). В предпочтительном варианте воплощения указанная нуклеиновая кислота по изобретению, продукт ее экспрессии обладают функциональным свойством обеспечения/поддержки роста вируса, предпочтительно птичьих вирусов [например, вируса болезни Марека, вируса ветряной оспы, вируса Ньюкастльской болезни (NDV), вируса инфекционного бурсита (IBDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса куриной анемии (CAV), вируса инфекционного ларинготрахеита (ILV), вируса птичьего лейкоза (ALV), вируса ретикулоэндотелиоза (REV), и вируса птичьего гриппа (AIV) и др.], в указанной непрерывной клеточной линии.

Различные условия культивирования для указанной клеточной линии, включая композиции среды в отношении уровней специфических питательных веществ, кислорода, реологии, диоксида углерода и восстановленной сыворотки, могут быть выбраны и оптимизированы специалистом в области техники. Предпочтительно указанная инфицированная или трансфицированная клетка по изобретению включает в себя клетку позвоночного. Еще более предпочтительно указанная инфицированная или трансфицированная клетка включает в себя птичью клетку. Например, указанная клетка может быть получена из мышечной ткани, т.е. мышечный миобласт. Любой мышечный миобласт может использоваться в соответствии с настоящим изобретением, например указанный мышечный миобласт может быть получен из мышечной ткани человека, примата, курицы, перепелки, индейки, гуся, голубя, фазана, куропатки виргинской. Линии мышечных клеток могут быть культивированы и поддерживаться с использованием известных методик культивирования клеток позвоночных. В предпочтительном варианте воплощения указанный миобласт получают от перепелки, например клетка QM.

Предпочтительной клеткой QM является клетка QM7, депонированная как АТСС CRL-1962.

В предпочтительном варианте воплощения изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота содержит ген гликопротеина gE вируса болезни Марека, или его функциональный фрагмент, или эквивалент гена гликопротеина gE. Предпочтительно указанный ген гликопротеина gE получают от вируса болезни Марека серотипа 1, и/или серотипа 2, и/или серотипа 3. Как используется в данном описании, «его функциональный фрагмент» относится к фрагменту гена/нуклеиновой кислоты, чей продукт экспрессии поддерживает свойство обеспечения/поддержки роста вируса, предпочтительно роста вируса болезни Марека, в указанной непрерывной клеточной линии. «Эквивалент» гена гликопротеина gE, как используется в данном описании, представляет собой любой сходный ген (т.е. функционально эквивалентный), например ген гликопротеина gE, полученный от другого герпесвируса, такого как альфагерпесвирус, чей продукт экспрессии обладает свойством обеспечения/поддержки или усиления роста вируса в указанной непрерывной клеточной линии. В другом предпочтительном варианте воплощения указанный вирус болезни Марека включает авирулентный штамм вируса болезни Марека, такой как, например, Rispens CVI988. Изобретение включает все аттенуированные вирусы болезни Марека/вакцинные штаммы, которые способны реплицироваться в указанной непрерывной клеточной линии. Изобретение обеспечивает способ получения непрерывной клеточной линии, способной поддерживать рост штамма вируса болезни Марека, включающей инфицирование или трансфицирование клетки вектором, включающим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент штамма вируса болезни Марека, и культивирование указанной инфицированной или трансфицированной клетки или ее потомства в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты и размножения указанной клетки или ее потомства, где указанная непрерывная клеточная линия способна поддерживать рост штамма вируса болезни Марека без адаптации указанного вируса. «Без адаптации», как используется в данном описании, обозначает, что указанная непрерывная (т.е. постоянная/устойчивая) клеточная линия по изобретению способна поддерживать рост и продуктивное заражение вирусом болезни Марека в высоких титрах (т.е. на уровне, сравнимом или даже выше такового в первичной клеточной линии, например фибробластах куриных эмбрионов) после 1 или 2 пассажей.

В еще одном варианте воплощения изобретение обеспечивает клетку или ее потомство, получаемое способом по изобретению. Более того, изобретение обеспечивает препарат клетки, полученной из клетки или ее потомства по изобретению. Предпочтительно указанная клетка или ее потомство или лизат клеток инфицируют или транфицируют аттенуированным штаммом вируса болезни Марека серотипа 1. Изобретение обеспечивает использование клетки, инфицированной или трансфицированной вектором, содержащим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент штамма вируса болезни Марека по изобретению и/или препарат, полученный из нее для получения вакцины, способной индуцировать в определенной степени защиту от заболевания (т.е. способствует иммунитету) у позвоночных, преимущественно птиц. Настоящее изобретение также относится к способу получения вируса болезни Марека в количествах, подходящих для целей вакцинации. Изобретение обеспечивает способ получения вакцины, способной индуцировать иммунный ответ в отношении заболеваний у позвоночных, преимущественно птиц, включающий культивирование клетки по изобретению и сбор компонентов клеточной культуры. Также ясно, что указанный штамм вируса болезни Марека может быть сохранен как нелитическая или литическая инфекция в указанной клеточной линии (т.е. SOgE), и указанная клеточная линия по изобретению способна инфицировать позвоночных, предпочтительно птиц in vivo, с целью получения иммунной защиты от болезни Марека.

Кроме того, изобретение обеспечивает способ получения как моновалентной, так и поливалентной вакцины для защиты позвоночных, предпочтительно птиц, от инфицирования агентами, вызывающими заболевание, т.е. в добавление к вирусу болезни Марека. Ясно, что указанная клеточная линия по изобретению (т.е. SOgE) может быть инфицирована или трансфицирована вектором, таким как вектор вируса болезни Марека, включающий геном вируса болезни Марека или его части, включая гены, кодирующие один или более гетерологичных белков или полипептидов (т.е. антигенные пептиды агентов, вызывающих заболевание), которые могут быть полезными против агентов, вызывающих заболевание позвоночных, иных, чем вирус болезни Марека. Примеры агентов, вызывающих заболевание, которые могут быть применимыми для получения вакцин, включают вирус Ньюкастльской болезни (NDV), вирус инфекционного бурсита (IBDV), вирус инфекционного бронхита (IBV), вирус куриной анемии (CAV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILV), вирус птичьего лейкоза (ALV), вирусу астровирусного ретикулоэндотелиоза индейки (RV) и вирус птичьего гриппа (AIV). Понятно, что фактически любая последовательность гетерологичного гена может быть создана в указанном векторе, включающем указанную нуклеиновую кислоту по изобретению, для использования в получении вакцин, т.е. поливалентных вакцин. Является предпочтительным, чтобы такая последовательность гетерологичного гена включала генетический продукт, который может поддерживать или активировать клеточный и/или гуморальный иммунный ответ организма-хозяина, или генетический продукт, который кодирует антигенную детерминанту, которая индуцирует защитный иммунный ответ на любое множество патогенных микроорганизмов (предпочтительно патогенных микроорганизмов позвоночных, еще более предпочтительно патогенных микроорганизмов птиц), или антигены, которые связывают нейтрализующие антитела. Например, гены или фрагменты генов, кодирующие антигенные пептиды одного или более из трех серотипов вируса болезни Марека. Такие антигенные пептиды могут использоваться в поливалентной вакцине для введения позвоночным, так чтобы дать полный защитный эффект против инфицирования вирусом болезни Марека.

Изобретение, кроме того, обеспечивает вакцину, получаемую способом по изобретению. Такие вакцины могут быть получены способами, хорошо известными специалисту в области техники получения вакцин. Вакцины могут иметь форму суспензий клеточной линии, инфицированной или трансфицированной указанным вектором, включающим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент штамма вируса болезни Марека по изобретению, инфицированной и поддерживающей репликацию вакцинного штамма/аттенуированного штамма вируса болезни Марека, предпочтительно серотипа 1, и/или серотипа 2, и/или серотипа 3 (т.е. отдельно, т.е. моновалентные вакцины) или в их комбинациях (т.е. поливалентные вакцины)), и/или других вирусов, как герпесвирусы. Кроме того, вакцина по изобретению может быть получена из бесклеточных суспензий вируса, полученных из обработанных ультразвуком клеток, например клеток SOgE и/или клеточных лизатов или компонентов лизатов, инфицированных и поддерживающих продуктивное заражение вакцинным штаммом/аттенуированным штаммом вируса болезни Марека, предпочтительно серотипа 1, и/или серотипа 2, и/или серотипа 3 (т.е. отдельно или в их комбинации), и/или другими вирусами, как герпесвирусы. Понятно, что вектор по изобретению может быть создан с использованием рекомбинантных методик по опыту такового в области техники для кодирования гетерологичных белков, о которых известно, что они усиливают иммунный ответ (т.е. способны стимулировать представление молекул класса 1 или 2 главного комплекса гистосовместимости), усиливая таким образом общий защитный эффект вводимой вакцины.

Изобретение обеспечивает применение клетки, инфицированной или трансфицированной вектором, включающим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент штамма вируса болезни Марека по изобретению, для получения, и/или поддержания, и/или выделения герпесвируса, предпочтительно альфагерпесвируса. Примеры герпесвирусов включают вирус ветряной оспы, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса и др. В предпочтительном варианте воплощения изобретение обеспечивает применение клетки, инфицированной или трансфицированной вектором, включающим нуклеиновую кислоту или ее фрагмент штамма вируса болезни Марека по изобретению для получения, и/или поддержания, и/или выделения гипервирулентного, и/или вирулентного, и/или авирулентного штамма вируса болезни Марека. Такая клетка может быть использована в качестве подходящего субстрата для размножения гипервирулентных штаммов, таких как штаммы EU1, 648A и 584А, и/или вирулентных штаммов, таких как штамм RB1B, и/или авирулентных штаммов, таких как 584Аp80C и CVI988. Изобретение включает все штаммы вируса болезни Марека, выбираемые из группы, состоящей из серотипа 1, серотипа 2, серотипа 3. Серотип 1 включает все патогенные штаммы и их аттенуированные производные. Серотип 2 состоит из естественно авирулентных куриных вирусов, тогда как серотип 3, также известный как герпесвирус индеек (HVT), включает авирулентные вирусы индеек, которые способны реплицироваться у кур. Понятно, что указанный штамм вируса болезни Марека может включать натуральный или генетически модифицированный штамм.

Настоящее изобретение включает способ получения, и/или выделения, и/или поддержания очень вирулентного (vv), очень вирулентного плюс (vv+), гипервирулентного, и/или вирулентного, и/или авирулентного штамма вируса болезни Марека, включающий инфицирование клетки, способной поддерживать рост штамма вируса болезни Марека по изобретению, герпесвирусом и культивирование указанной клетки при условиях, подходящих для размножения указанной клетки и образования, поддержания и выделения герпесвируса. Изобретение, кроме того, обеспечивает герпесвирус, получаемый способом по изобретению.

В предпочтительном варианте воплощения изобретение обеспечивает способ получения, и/или выделения, и/или поддержания очень вирулентного (vv), очень вирулентного плюс (vv+), гипервирулентного, и/или вирулентного, и/или авирулентного штамма вируса болезни Марека, включающий инфицирование клетки, способной поддерживать рост штамма вируса болезни Марека по изобретению очень вирулентным (vv), очень вирулентным плюс (vv+), гипервирулентным, и/или вирулентным, и/или авирулентным штаммом вируса болезни Марека и культивирование указанной клетки при условиях, подходящих для размножения указанной клетки и образования, поддержания и выделения указанного очень вирулентного (vv), очень вирулентного плюс (vv+), гипервирулентного, и/или вирулентного, и/или авирулентного штамма вируса болезни Марека. Подходящие условия для культивирования клеток позвоночных/птиц известны в области техники. Изобретение, кроме того, обеспечивает очень вирулентный (vv), очень вирулентный плюс (vv+), гипервирулентный, и/или вирулентный, и/или авирулентный штаммы вируса болезни Марека, получаемые способом по изобретению.

Кроме того, является предпочтительным, чтобы указанную клетку, способную поддерживать рост штамма вируса болезни Марека по изобретению, культивировали в присутствии генетицина (G-418), его производного или аналога или любого другого лекарственного препарата, который является нетоксичным в присутствии гена устойчивости к неомицину и может быть использован для отбора. Производное G-418, как используется в данном описании, представляет собой вещество, полученное из G-418 с подобными свойствами. Аналог G-418, как используется в данном описании, представляет собой вещество, обладающее химической структурой и химическими свойствами, сходными с таковыми G-418 (Gibco, Life Technologies).

Изобретение, кроме того, обеспечивает применение клетки, способной поддерживать рост штамма вируса болезни Марека по изобретению для продуцирования диагностического антигена герпесвируса, предпочтительно, альфагерпесвируса и, еще более предпочтительно, вируса болезни Марека. Понятно, что фактически любая последовательность гетерологичного гена может быть создана в указанном векторе, включающем указанную нуклеиновую кислоту по изобретению, для использования в получении диагностического антигена. Например, гены или фрагменты генов, кодирующих необычные антигенные пептиды одного или более серотипов вируса болезни Марека, или ген или фрагменты генов, кодирующих специфические антигенные пептиды других герпесвирусов. Такие специфические вирусные антигены могут быть использованы для диагностики специфической вирусной инфекции у птиц и также применимы для получения вакцин. Кроме того, изобретение обеспечивает способ продукции диагностического антигена вируса болезни Марека, включающий предоставление клетки по изобретению, инфицированной и способной поддерживать рост штамма вируса болезни Марека по изобретению, и выделение из нее компонентов.

Изобретение, кроме того, обеспечивает вакцину по изобретению для получения лекарственного препарата для предотвращения и/или лечения заболеваний позвоночных. Предпочтительно указанными заболеваниями позвоночных являются болезни птиц, еще более предпочтительно болезнь, связанная с вирусом болезни Марека. Подходящая основа для лекарственного препарата известна в области техники. Изобретение включает как профилактические, так и терапевтические вакцины. Изобретение, кроме того, обеспечивает способ защиты позвоночных от заболеваний, включающий введение указанному позвоночному вакцины по изобретению с фармацевтически приемлемым носителем подходящему реципиенту. Изобретение, кроме того, обеспечивает способ иммунизации позвоночного (например, животного, человека, птицы) против инфекционного герпесвируса, включающий введение позвоночному эффективной иммунизирующей дозы вакцины по настоящему изобретению. Может быть создана как живая рекомбинантная вирусная вакцина, так и инактивированная рекомбинантная вирусная вакцина. Продуцирование композиций живой вирусной вакцины может быть осуществлено с использованием обычных способов, включающих размножение вируса в клеточной линии по изобретению с последующим введением в качестве лекарственного препарата позвоночному. Вакцины могут быть введены позвоночному любым из способов, хорошо известных специалисту в области техники, например путем внутримышечной, подкожной, интраабдоминальной, внутривенной инъекции или инъекции in-ovo.

Является предпочтительным представлять композицию вирусной вакцины через естественный путь инфицирования патогенным микроорганизмом, для которого создана вакцина. В качестве альтернативы, такую вакцину можно вводить окуло-назально или перорально. С целью получения инактивированных вакцин вирус может быть выращен в клеточной линии по изобретению, инактивирован, например, формальдегидом или бета-пропиолактоном. Инактивированные вирусы могут быть скомпонованы с подходящим вспомогательным средством с целью усиления иммунологического ответа. Такие вспомогательные вещества могут включать, без ограничения, минеральные гели, например гидроксид алюминия; поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониковые полиолы; пептиды; масляные эмульсии и потенциально применимые вспомогательные вещества, такие как BCG и Corynebacterium parvum. Фармацевтически приемлемые носители известны в области техники и включают, без ограничения, физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, стерильный изотонический водный буфер и их комбинации. Одним примером такого приемлемого носителя является физиологически сбалансированная культуральная среда, содержащая один или более стабилизирующих агентов, таких как стабилизированные, гидролизованные белки, лактоза, диметилсульфоксид и др. Более предпочтительно носитель является стерильным. Подходящим реципиентом является позвоночное, предпочтительно птицы.

Пример 1

Животные. Использовали белых селекционных леггорнов Lohmann (LSL) (Lohmann, Cuxhaven, Germany) и им перевязывали крылья в день вылупления. Птиц держали в клетках, и они получали пищу и воду по желанию.

Клетки и вирусы. Фибробласты куриных эмбрионов (CEF) получали, как описано ранее (Schumacher et al., 2000). Мышечные клетки перепелки QM7 (АТСС клетки номер CRL-1962) использовали для получения постоянной клеточной линии. Используемыми штаммами MDV были CVI988 (MarekVac forte®, Lohmann, Cuxhaven, Germany), 584Ap80C³⁷ , RB1B (любезно предоставленный Dr. T.F.Davison, Compton, UK) и EU1. Штамм 584Ap80C или его US-2-негативное производное вируса ВАС20, восстановленное из инфекционного ВАС клона MDV (Schumacher et al., 2000) размножали на CEF²⁹. Штамм MDV EU1 представляет собой вирус, выделенный в 1992 у группы птиц в Италии, которая была иммунизирована вакциной HVT. Показано, что EU1 свободен от вируса инфекционной анемии кур, вирусов птичьего лейкоза и ретикулоэндотелиоза и вируса инфекционного бурсита по ПЦР и не мог размножаться на CEF. Для получения вируса штамм EU1 инъецировали внутримышечно (в/м) 10 курам. На 10 день после инфицирования получали клетки периферической крови (РВМС) и мононуклеарные клетки селезенки от инфицированных птиц путем центрифугирования в градиенте плотности Histopaque® (Sigma, Munich, Germany) и хранили в жидком азоте.

Плазмида. Открытую рамку считывания гликопротеина Е, US8 гомологичный ген 17,33 вакцинного штамма MDV Rispens CVI988 амплифицировали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием 100 пмоль каждого 5'-праймера 5'-CATAGCATGCGAGTCAGCGTCATAATGTG-3' и 3'-праймер 5'-CAAGGGCCCATCAGTGGTATAAATCTAAGC-3'. Полученный фрагмент 1,4 т.п.н. расщепляли рестрикционными эндонуклеазами BamHI и EcoRI и клонировали в тех же участках вектора pcDNA3 (Invitrogen), приводя к образованию рекомбинантного вектора pcMgE ³⁰.

ПЦР-исследование. Одно ПЦР-исследование было направлено на открытую рамку считывания gE (смотри выше), другие ПЦР-исследования, проводимые на инфицированных клетках, были направлены на ген gB MDV (Lee et al., 2000). ПЦР-исследование ²⁵, имеющее целью ген gB MDV ^17,33 проводили с 100 пмоль каждого из прямого (5'-GCATATCAGCCTGTTCTAATC-3') и обратного праймера (5'-AACCAATGGTCGGCTATAAC-3'). В обоих протоколах соответствующие праймеры смешивали с ДНК и выполняли 35 циклов (95°С 30 с, 50°С 30 с, 72°С 30 с). Специфичность продуктов ПЦР подтверждали саузерн-блоттингом с использованием последовательностей gB или gE, меченных дигоксигенином, в качестве образца ²⁹.

Непрямой иммунофлуоресцентный анализ. Для непрямого иммунофлуоресцентного анализа (НИФА) клетки выращивали на 6-луночных планшетах (Greiner) или на стеклянных покровных стеклах. Клетки фиксировали 90% ацетоном в различное время после инфицирования. НИФА проводили в точности, как описано, и образцы анализировали обычной флуоресцентной микроскопией (29,30). Используемыми антителами были анти-gB моноклональные антитела (mab) 2K11; любезно предоставленные Dr. J.-F. Vautherot, INRA, Nouzilly, France), или сыворотка реконвалесцентов, т.е. от кур, инфицированных MDV-1 (анти-MDV1).

Методика ELISA для определения антител MDV-1

MDV-1-специфические антитела в плазме определяли иммуносорбентным анализом с ферментной меткой (ELISA). Антиген состоял из лизата 5×10⁷ BAC20-инфицированных CEF, собранных через 5 дней после инфицирования путем замораживания-оттаивания. Лизат (5 мл в PBS) обрабатывали ультразвуком в течение 60 с при 60 Вт и обломки клеток удаляли путем центрифугирования (10000 g, 10 мин, 4°С). Лизат 5×10 ⁷ неинфицированных CEF использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты ELISA (Nunc) покрывали 100 мкл лизатов (окончательная концентрация: 5 мкл лизата/мл) в течение 16 часов при 4°С. Образцы плазмы разводили в логарифмической последовательности, начиная с разведения 1:100, и добавляли на планшеты в течение 60 мин при 25°С после блокирования с использованием 2% снятого латекса. После тщательного промывания PBS добавляли 100 мкл конъюгата анти-куриного IgG и пероксидазы (Sigma) в течение 30 мин при 25°С. После окончательного промывания PBS добавляли 100 мкл раствора TMB субстрата (Sigma) в течение 10 мин перед тем, как реакцию останавливали 2 М H₂SO ₄. Считывали поглощение при 450 нм (А₄₅₀ ) (TecanSPECTRA, Crailsheim, Germany) и окончательные титры антител определяли, как описано ранее ²⁰.

Пример 2: Создание клеточной линии, постоянно экспрессирующей гликопротеин Е вакцинного штамма MDV CVI988.

Клетки QM7 трансфицировали методом осаждения фосфатом кальция, как описано ранее ²⁹. Клетки QM7 выращивали на 6-луночных планшетах до приблизительно 70% слияния и трансфицировали 10 мкг рекомбинантной плазмиды pcMgE ³⁰. Трансфицированные клетки покрывали средой DMEM, содержащей 5% FCS и 1000 мкг на мл G-418 (Gibco-BRL). Через 2 недели культивирования клеток в присутствии антибиотиков клоны одной клетки отбирали в 96-луночные планшеты. После выращивания клонов клеток до слияния в 96-луночных планшетах их разделяли 1:2 и проводили НИФА с сывороткой реконвалесцента MDVI на этих клонах клеток. Клеточный клон, в котором фактически каждая клетка экспрессировала gE MDV, определяли (фиг.2) и называли SOgE. Клетки SOgE выращивали и оценивали в отношении экспрессии gE с недельными интервалами. В присутствии G-418 была доказана стабильная экспрессия gE в течение более чем 15 недель. В отсутствии лекарственного препарата экспрессию gE в клетках SOgE определяли до 10 недель. Присутствие ДНК gE MDV в SOgE, но не в клетках QM7 подтверждали ПЦР-исследованием ДНК, полученной из 1×10⁷ клеток каждая (фиг.3).

Пример 3: Клетки SOgE экспрессируют функциональный gE MDV

Вопрос экспрессии функционального gE MDV полученной клеточной линией был решен путем анализа роста gE-отрицательного MDV на клетках SOgE. Было показано, что гликопротеин Е является необходимым для роста MDV in vitro ³⁰. Следовательно, 20 gE ДНК, кодирующей gE-негативный BAC20 вирус (Schumacher et al., 2000), трансфицировали в клетки SOgE или QM7 и отслеживали образование бляшек. Тогда как 20 gE бляшки легко наблюдались на клетках SOgE после НИФА с использованием анти-gB mab 2K11, только отдельные инфицированные клетки могли быть обнаружены с помощью mab на родительских клетках QM7 (фиг.4). Эти результаты подтверждают, что функциональный gE продуцируется клетками SOgE, которые способны к транс-дополнению необходимого gE MDV-1 gE-дефицитному вирусу.

Пример 4: Клетки SOgE поддерживают рост нескольких штаммов MDV-1

Размер бляшек 20 gE на клетках SOgE оказался значительно больше, чем таковой вируса ВАС20 на клетках QM7 или таковой gB-негативного вируса мутанта на клетках QM7, экспрессирующих gB ²⁹ . Это неожиданное наблюдение привело к последующим экспериментам. Размеры бляшек авирулентных штаммов MDV-1 584Ap80C и CVI988, а также вирулентного RB1B и гипервирулентного штамма оценивали на клетках CEF, QM7 и SOgE. Это делали путем совместного посева инфицированных CEF или PBMC (EU1) с соответствующим клетками. Быть продемонстрировано, что совместный посев клеток SOgE с клетками CEF, инфицированными 584Ap80C, CVI988 или RB1B при низкой множественности инфекции (МЗ (MOI)=0,0001; т.е. 100 БОЕ (PFU) на 1×10 ⁶ клеток) приводило к образованию бляшек (фиг.5). Размер бляшек был сравним с таковым на клетках CEF (фиг.5). Кроме того, было возможно непосредственно восстановить инфекционный MDV-1 из вирусной ДНК или полученной из Escherichia Coli, клонированной вирусной ДНК (ВАС20), ²⁹ после трансфекции клеток SOgE (фиг.5). Следовательно, непосредственная адаптация MDV к клеткам SOgE без длительного пассирования культуры клеток является возможной, что является важным преимуществом как для продуцирования вакцин, так и для выделения или образования вирулентного и гипервирулентного MDV-1 для экспериментов на животных.

Вышеописанные эксперименты предполагают, что клетки SOgE представляют собой постоянный клеточный субстрат для эффективного размножения как авирулентных (вакцинных) штаммов MDV, так и вирулентных, очень вирулентных и гипервирулентных штаммов MDV-1. Так как, в частности, продукция MD вакцин может быть облегчена с использованием постоянной клеточной линии, позволяющей размножать вакцинные штаммы MDV, ДНК CVI988 трансфицировали в клетки CEF, QM7 и SOgE. На 6 день после трансфицирования, когда вирусные бляшки становились видимыми, клетки собирали и 1×10³ инфицированных клеток высевали совместно с 1×10 ⁷ неинфицированных клеток подходящего клеточного типа. Через 5 дней после инфицирования этого большого числа клеток, инфицированные клетки трипсинизировали и титровали в десятикратных разведениях на свежеполученных клетках CEF, QM7 и SOgE. На 4 день после титрования клетки фиксировали и определяли количества вирусных бляшек после НИФА окрашивания с использованием анти-gB mab антитела 2K11. Было показано, что средние титры CVI988 на клетках SOgE достигали 1,8×10⁶ БОЕ, тогда как титры только 3,2×10³ были получены на клетках QM7. Титры на клетках SOgE были фактически идентичными таковым на первичных клетках CEF. Из результатов определений размеров бляшек и экспериментов титрования авторы заключили, что размножение вирулентных и авирулентных вакцинных штаммов MDV на клетках SOgE, которые постоянно экспрессируют gE штамма MDV CVI988, было таким же эффективным или даже выше размножения на первичных клетках CEF.

Пример 5: Клетки SOgE не вызывают опухоли у однодневных цыплят

Тот факт, что клетки SOgE получают из химически индуцированной опухоли перепелки, поставил вопрос об отдаленной возможности того, могут ли они вызывать опухоли у кур после системного введения препарата цельных клеток. Для решения этого важного вопроса 18 цыплятам прививали или клетки SOgE (12 цыплят), или родительские клетки QM7 (6 цыплят). Каждый цыпленок получил 1×10 ⁶ клеток внутримышечно и 1×10⁶ клеток интраабдоминальным путем (таблица 1). Исход у привитых цыплят оценивали через 12 недель, когда проводили посмертное исследование. Ни у одного из цыплят не развились клинические признаки во время ведения эксперимента. Кроме того, все цыплята находились в хорошем состоянии от питания и без каких-либо признаков образования опухоли при посмертном исследовании. Из этих результатов авторы заключили, что экспрессирующие рекомбинантный gE MDV клетки SOgE, а также родительские клетки QM7 не вызывали опухолей у цыплят, даже когда их вводили приблизительно в 100-1000 раз больше клеток, по сравнению с дозой вакцины. Следовательно, авторы расценили клетки SOgE как безопасные для продукции MDV или комбинированных вакцин.

Пример 6: Защита кур от болезни Марека с использованием вакцины, продуцируемой SOgE

Для сравнения защитной способности вакцинного штамма Rispens CVI988, размноженного на клетках SogE, с таковой, получаемого обычным образом на клетках CEF, проводили эксперименты на животных. Однодневные цыплята получали 1×10⁶ клеток SOgE (группа 1, таблица 2), 1×10 ⁶ родительских клеток QM7 (группа 4, таблица 1) или 1×10 ³ бляшко-образующих единиц CVI988, полученного на SOgE (группа 2, таблица 2) или клеток CEF (группа 3, таблица 2). Во избежание перекрестной контаминации вакцинный вирус получали после трансфицирования ДНК CVI988, выделенной из CEF, в клетки SOgE или CEF. Трансфицированные клетки совместно высевали со свежими неинфицированными клетками и вакцинный вирус собирали на 5-й день после инфицирования, когда развивался полный цитопатический эффект. Иммунизированные птицы были инфицированы гипервирулентным штаммом MDV-1 EU1 на день 12 после иммунизации. У ложно иммунизированных животных (клетки QM7, группа 4) развилась MD на 7 день после инфицирования и две птицы умерли на день 9 и 10 соответственно. На день 37 после инфицирования все птицы умерли в результате инфекции (таблица 2). У животных, иммунизированных SOgE, 4 курицы умерли в результате инфекции, но 3 птицы дожили до окончания эксперимента на день 70 после инфицирования (таблица 2). Однако у 3 выживших птиц развилась MD, что доказано общим патологическим исследованием и обнаружением опухолей во внутренних органах (таблица 2). Абсолютно наоборот, куры, иммунизированные CVI988, который получали как на клетках SOgE, так и CEF, не умерли от MD до завершения эксперимента (таблица 2). У одной птицы из каждой из групп 2 и 3, однако, были идентифицированы признаки MD по общему патологическому исследованию (таблица 2). Серологические анти-MDV-1 ответы у иммунизированных и зараженных птиц отслеживали проведением ELISA. Было продемонстрировано, что защищенные птицы имели антитела, определенные с помощью ELISA, которые постепенно нарастали со временем после выборочного инфицирования, тогда как у кур, привитых клетками SOgE или QM7, не развивались высокие титры антител. Более того, титры антител падали в позднее время после инфицирования или оставались фактически постоянными (фиг.6). Из результатов было сделано заключение, что вакцина MD CVI988, которую получали на постоянных клетках SOgE, обеспечивала такую хорошую защиту, которую дает таковая, получаемая обычным образом на клетках CEF. Кроме того, защита от MD соответствовала постепенно нарастающим анти-MDV-1 антителам, которые могут показывать, что постоянное усиление иммунной системы кур литически реплицирующимся вакцинным вирусом или низким уровнем репликации EU1, который может контролироваться присутствием вакцинного вируса, является необходимым условием защиты от опухолегенной MD.

Ссылки

Таблица 1 Исследование образования опухолей у кур после введения клеток QM7 и SogE
Число животных с опухолями Недели после прививки
Группа	Животные	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	Всего
SogE	6												0	0/6
QM7	6												0	0/6

Таблица 2 Болезнь Марека у кур, иммунизированных вакцинным штаммом CVI988, полученным на клетках SOgE и получивших введение гипервирулентного штамма EU1
Число животных с болезнью Марека Недели после инфицирования
Группа	Животные (n)	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	Всего
1: SOgE	7					1*	1		2			3	7/7
2: CVI988 - SOgE	8											1	1/8
3: CVI988 -CEF	8											1	1/8
4: QM7	6			2		2	2						6/6

*Количество животных, указанное на неделях 0-9, умерло в результате инфицирования EU1, количество животных, указанное на неделе 10, представляет собой животных, имеющих MD при посмертном исследовании.

Описание фигур

Фиг.1

Схематическое представление генома MDV-1 и расположения открытой рамки считывания gE в уникальном коротком участке (Us). Показанное представляет собой организацию приблизительно 180 т.п.н. генома MDV-1 и рестриктазную карту BamHI. Открытую рамку считывания gE амплифицировали ПЦР и клонировали в векторе pcDNA3 (Invitrogen) под контролем прямого раннего промотора/энхансера человеческого цитомегаловируса. Шкалы даны в т.п.н. или п.н.

Фиг.2

Определение экспрессии gE клетками SOgE НИФА с использованием поликлональной gE специфичной антисыворотки кролика ³⁰. Тогда как реакционная способность клеток SOgE с антителом легко определялась, не наблюдали реакционной способности с gE-специфичной сывороткой клеток QM7. Отдельные изображения имеют размер 1000×650 мкм.

Фиг.3

Полимеразная цепная реакция клеток SOgE. Клетки SOgE оставляли неинфицированными или инфицировали штаммами MDV-1 584Ap80C, CVI988 или RB1B. Тогда как gE-специфичные последовательности определялись во всех инфицированных и неинфицированных клетках SOgE, gB-специфичный продукт амплификации получали только в инфицированных клетках. В клетках QM7 ни gB, ни gE не определялись. Размеры продуктов амплификации даны. Специфичность амплифицированных продуктов определяли с использованием последовательностей gE или gB, меченных дигоксигенином в качестве образца. Определение ДНК-ДНК гибридов проводили с использованием CSPD^TM (Roche Biochemicals) и усиленной хемилюминесценцией в соответствии с инструкциями производителя.

Фиг.4

Рост gE-негативного и ВАС20 вируса на клетках SOgE, экспрессирующих gE или клетках QM7. После трансфекции ДНК 20 gE или ВАС20 (Schumacher et al., 2000, 2001) в соответствующие клетки, образование бляшек 20 gE становилось видимым через 3 дня после трансфицирование в клетках SOgE, но не в клетках QM7. В клетках QM7 наблюдали только отдельные инфицированные клетки, но не образование бляшек в случае вируса 20 gE. ВАС20 вирус вызывал очень небольшие бляшки в клетках QM7, и большие бляшки на рекомбинантных клетках SOgE. Отдельные изображения имеют 1000×650 мкм в размере (нижние панели) или 300×200 мкм в размере (верхние панели).

Фиг.5

Бляшки штаммов вируса MDV-1 584Ap80C, RB1B и CVI988 на клетках CEF и SOgE. Образование бляшек, индуцированное вакцинными штаммами 584Ap80C, CVI988 и вирулентным штаммом MDV-1 RB1B, легко наблюдали после посева на клетки SOgE. Образование вирусных бляшек на клетках CEF также наблюдали в случае 584Ap80C, CVI988 и RB1B. Показанные бляшки фиксировали на 4-й день после инфицирования 1×10⁶ клеток 100 БОЕ указанных вирусов. Отдельные изображения имеют 1500×1000 мкм в размере.

Фиг.6

ELISA титры цыплят, иммунизированных CVI988, полученных на рекомбинантных клетках SOgE или на CEF. День -12 является днем иммунизации, на день 0 животных заражали гипервирулентным штаммом MDV-1 EU-1. Титры MDV-1-специфичных антител в плазме. У всех птиц в каждой группе брали кровь на указанные дни и образцы плазмы двух птиц объединяли. Плазму разводили в логарифмической последовательности, начиная с разведения 1:100. Титры выражены как разведение, при котором А_450нм после реакции с лизатами MDV-инфицированных клеток превосходили таковые с лизатами неинфицированных клеток по 3 стандартным отклонениям. Символы для отдельных групп объяснены.