способ получения иммуноактивных полипептидов/пептидов, обладающих иммунокорригирующими свойствами

Формула изобретения

Способ получения иммуноактивных веществ тимуса, обладающих иммунокорригирующими свойствами, путем измельчения ткани тимуса, очищенной от жировой и соединительной ткани, центрифугирования, нагревания при 80°С, удаления осадка, обработки надосадочной жидкости (супернатанта), осаждения сернокислым аммонием, центрифугирования, фракционирования методом гель-хроматографии на сефадексе, лиофилизации, растворения в воде, обессоливания на сефадексе и высушивания целевого продукта, отличающийся тем, что измельченную ткань обрабатывают путем лиофилизации с последующим обезжириванием жидким CO ₂ и гидратированием в изотоническом фосфатном буфере, рН 7,2-7,4, после удаления нерастворимого осадка центрифугированием обрабатывают надосадочную жидкость (супернатант) добавлением раствора уксусной кислоты до рН 4,0-4,2, затем добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения, оставляют на 10-12 ч при +4°С, сформировавшийся осадок после отделения центрифугированием растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 8,0-8,2, наносят на колонку с сефадексом G-15, удаляют сульфат аммония, собирают белковую фракцию, лиофилизируют, растворяют в 0,01 М трис HCl буфере, содержащем 0,14 М NaCl, рН 8,0-8,2, фракционирование проводят на откалиброванной по молекулярным массам колонке с сефадексом G-50, уравновешенной тем же буфером, содержащим 0,14 М NaCl, собирают фракции с молекулярными массами от 500 до 25000 дальтон, лиофилизируют, растворяют в бидистиллированной воде и удаляют соли на колонке с сефадексом G-15.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может найти применение в экспериментальных исследованиях по изучению функции иммунной системы эукариотов, в том числе и человека, а также в клинике для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний. Кроме этого, препарат может быть использован для профилактики старения организма, вызванного стрессовыми агентами.

Известен способ получения «Тимозина» из свежеполученного тимуса телят (U.S.P. 4.079.127 3/1978 Goldstein A. Et al.). Тимозин (F-5) - смесь веществ, обладающих иммунологической активностью. Метод получения тимозина заключается в гомогенизации тимуса в 0,15 М растворе хлористого натрия, центрифугировании при 1400 g без предварительной инкубации гомогената. Супернатант прогревают при 80°С, удаляют центрифугированием термоденатурированные белки, осаждают ацетоном (7 объемов ацетона) иммунологически активные вещества, высаливают, подвергают ультрафильтрации, затем хроматографируют с использованием сефадекса G-25 и выделяют конечный продукт «Тимозин F-5» с молекулярными массами от 1200 до 14000 дальтон.

Данный способ не обеспечивает высокого выхода активного материала - из 1 кг тимуса получают 0,015% сухого конечного продукта с низкой удельной активностью в тесте восстановления чувствительности к азатиоприну клеток селезенки тимэктомированных мышей на 50%. Минимальная доза тимозина F-5 в этом тесте составляет 300 мкг на 3×10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей.

Способ не отличается экологической чистотой, ибо требует большого количества ацетона (17-21 кг ацетона на 1 кг сырого веса тимуса).

Известен способ получения тимозина из замороженного при -49°С тимуса каспийского тюленя (Phoca caspica) (a.c. 975017. Бюллетень №43 от 23.11.82). Новым в этом изобретении является то, что тимус предварительно очищают от соединительной ткани и после гомогенизации проводят дезинтеграцию клеток ультразвуком. По сравнению с методом, описанным в патенте (U.S.P. 4.079.127 3/1978 Goldstein A. Et al.), активность материала в 1,5 раза увеличивается.

Недостатком этого метода является то, что тимус необходимо замораживать и хранить при -49°С, что требует специальной аппаратуры. Кроме того, этот метод также не отличается экологической чистотой, т.к. при этом используется большое количество ацетона, который не только токсичен, но и пожароопасен. Утилизация отработанного ацетона довольно дорогостоящая процедура.

Известен способ получения иммунокорригирующего препарата «Тактивин» из замороженного при -18-22°С тимуса телят, вызывающего дифференцировку и созревание лимфоцитов Т-ряда (Авторское свидетельство СССС №784052; Арион В.Я. Выделение, физико-химические свойства и биологическая активность Тактивина. В кн. Итоги науки и техники. Сер. Иммунология. М., ВИНИТИ, 1982, т.10, с.45-53), заключающийся в размораживании тимуса при +4°С, тщательном удалении жировой и соединительной ткани, гомогенизации в изотоническом растворе натрия хлористого в соотношении 1:3, инкубации гомогената в течение 16-18 часов (аутолиз), фильтровании через капроновый фильтр, центрифугировании (1 час при 2000 × g), нагревании до 80°С (15 мин), удалении центрифугированием (1 час 2000 × g) денатурированных белков, удалении липидов ацетоном, центрифугировании (30 мин 2000 × g), трехкратной отмывке осадка ацетоном, высушивании (на воздухе в вытяжном шкафу), растворении порошка в 10 мМ натрий фосфатном буфере рН 7,0, удалении нерастворимого осадка центрифугированием при 30000×g в течение 40 мин, подкислении супернатанта уксусной кислотой до рН 4,0, трехкратном высаливании сульфатом аммония при различных концентрациях соли и рН, ультрафильтрации под давлением инертного газа через миллипоровские фильтры, обессоливании на колонке с сефадексом G-15, разделении на колонке с сефадексом G-50, выделении фракции с м.м. от 1000 до 6000 дальтон, лиофилизации, растворении в апирогенной воде, обессоливании с использованием сефадекса G-15, лиофилизации. Конечный продукт проявляет активность в стандартном азатиоприновом тесте в минимальной дозе 10 мкг на 3×10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей, т.е в 30 раз более активен, чем препарат «Тимозин», получаемый по вышеописанному патенту США. Выход из 1 кг сырого веса тимуса - 100±10 мкг с мол. массами от 1000 до 6000 дальтон.

Данный способ получения тактивина не лишен ряда недостатков, присущих всем известным методам получения иммуноактивных препаратов из животного сырья. Способ не является экологически чистым, т.к. требует применения большого количества ацетона (на 1 кг тимуса 18-20 кг ацетона), который после использования необходимо утилизировать, что приводит к значительному увеличению расходов, а следовательно, к удорожанию конечного продукта. Кроме этого, способ не позволяет получить более высокополимерный материал тимуса, обладающий иммунотропными свойствами. Еще одним недостатком является необходимость хранения сырья при -18-20°С.

Способ получения тактивина взят нами за самый близкий прототип.

Задачей данного изобретения является устранение описанных для прототипа недостатков, а именно:

А. Создать способ получения иммуноактивных полипептидов/пептидов тимуса, обладающих иммунокорригирующими свойствами.

По предлагаемому методу иммунокорригирующие полипептиды/пептиды можно получить из тимуса млекопитающих и морских животных (тюленей, моржей, акул). Северные олени, тюлени, моржи, акулы забиваются только в определенный сезон один раз в год, что требует длительного хранения изъятого тимуса. Несомненным преимуществом предложенного метода перед прототипом является то, что срок хранения лиофилизированного и обезжиренного жидким CO₂ тимуса практически неограничен. При этом порошкообразный тимус можно хранить как при низких температурах (-7°-10°С), так и при комнатной температуре (20-24°С).

Б. Повысить экологическую чистоту производства иммуноактивных препаратов.

В. Расширить сырьевую базу.

Г. Увеличить выход целевого продукта.

Эта задача решается тем, что при осуществлении предлагаемого способа тимус животных, в том числе и морских животных, тщательно очищают от жира и соединительной ткани, измельчают, лиофилизируют, обезжиривают жидким CO₂, гидратируют в изотоническом фосфатном буфере при рН 7,2-7,4, после удаления нерастворимого осадка центрифугированием собирают супернатант, прогревают при 80°С, удаляют нерастворимый осадок центрифугированием, собирают супернатант и доводят рН уксусной кислотой до 4,0-4,2, проводят осаждение сульфатом аммония (при 50% насыщения), оставляют на 10-12 часов при +4°С, сформировавшийся осадок собирают центрифугированием, растворяют осадок в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 8,0-8,2, наносят на колонку с сефадексом G-15, удаляют сульфат аммония, собирают белковую фракцию, лиофилизируют, растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере, содержащем 0,14 М NaCl, рН 8,0-8,2, гель-хроматографируют на откалиброванной по молекулярным массам колонке с сефадексом G-50, уравновешенной тем же буфером, содержащим 0,14 М NaCl, отбирают целевой продукт по молекулярным массам (от 500 до 25000 дальтон), лиофилизируют, растворяют в бидистиллированной воде и обессоливают на колонке с сефадексом G-15, целевой продукт, вышедший в свободном объеме колонки, высушивают лиофилизированием.

Выход целевого продукта 160±10 мг из расчета на 1 кг сырого веса тимуса, с удельной активностью 1-5 мкг на 3×10 ⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей.

Предпочтительно нерастворимый осадок удаляют центрифугированием при 2500-4500 × g, 30-50 мин, +4°С.

Прогревание при 80°С ведут до коагуляции белков, как правило, 10-15 минут.

Предпочтительными условиями сбора осадка после обработки сульфатом аммония является следующие: сформировавшийся осадок собирают центрифугированием (2500-4000 × g, 40-50 мин, +4°С).

Техническими результатами настоящего изобретения являются:

- увеличение срока хранения сырья;

- повышение выхода и удельной активности продукта;

- создание экологически чистого производства;

- стабильный выход целевого продукта;

- устранение коррозии металлических частей аппаратуры.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1 (тимус телят крупного рогатого скота)

1800 г тимуса освобождают от жировой, соединительной ткани и крупных сосудов, измельчают с помощью измельчителя тканей РТ-1, 8000 об/мин, 3 мин при +4°С, лиофилизируют, обезжиривают жидким СО₂, растирают до однородной порошкообразной массы (выход 60 г), добавляют 800 мл изотонического фосфатного буфера рН 7,4 и перемешивают в течение 4-х часов при +4°С, центрифугируют 45 мин (4000 × g) при +4°С, отбирают в стеклянную колбу супернатант (680 мл) и помещают в кипящую водяную баню при непрерывном перемешивании, доводят температуру супернатанта до 80°С, выдерживают 10 мин при этой температуре, после чего охлаждают до температуры +20°С, центрифугируют 2 часа со скоростью 3600 об/мин (4000 × g) при +4°С, собирают супернатант (640 мл), осадок отбрасывают. Охлажденный до +4°С супернатант при перемешивании подкисляют 20% уксусной кислотой до рН 4,0, добавляют постепенно при перемешивании 200 г растертого в порошок сульфата аммония (до 50% насыщения) и оставляют на 12 часов при +4°С для формирования осадка, центрифугируют 40 мин со скоростью 3600 об/мин при +4°С, супернатант удаляют, осадок растворяют в 80 мл 0,01 М трис-HCl буфера рН 8,0, наносят на колонку с сефадексом G-15 (5×60 см), уравновешенную тем же буфером, и проводят элюцию 0,01 М трис-НС1 буфером рН 8,0 на хроматографе LKB со скоростью 120 мл/час и автоматической записью элюента при 280 нм, получают 180 мл белкового раствора, который подвергается лиофилизации. Лиофилизированный препарат растворяют в 35 мл трис-HCl буфере, рН 8,0, содержащем 0,14 М NaCl, наносят на откалиброванную по молекулярным массам колонку 5×100 см с сефадексом G-50, уравновешенную 0,01 М трис-HCl 0,14 М NaCl буфером, рН 8,0, элюируют этим же буфером со скоростью 80 мл/час, контролируя автоматически поглощение в УФ-области (280 нм). Собирают фракции с молекулярными массами от 500 до 25000 Да (соответственно калибровке) и лиофилизируют. Препарат растворяют в 22 мл дистиллированной воды и наносят на колонку 2,5×40 см с сефадексом G-15, уравновешенную дистиллированной водой, и элюируют дистиллированной водой со скоростью 30 мл/час, контролируют по поглощению в УФ (280 нм) и электропроводности элюата, получают 82 мл белкового раствора, который подвергают лиофилизации. Выход - 275 мг препарата, активность - 1 мкг препарата на 3×10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей.

Пример 2

Отличается от примера 1 тем, что иммуноактивный препарат получают из тимуса северных оленей. Выход - 280 мг, активность - 1 мкг препарата на 3×10 ⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей.

Пример 3

Отличается от примера 1 сырьем, а именно берут тимус молодняка тюленя. Выход - 277 мг, активность - 1 мкг препарата на 3×10⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей.

Пример 4

Для определения срока хранения были исследованы партии продукта, полученные по примерам 1-3. Результаты представлены в таблице.

Активность иммуноактивных препаратов, полученных из тимуса разных животных в стандартном тесте восстановления чувствительности Т-клеток селезенки тимэктомированных мышей к азатиоприну
№№	Препараты**	Даты получения конечного продукта	% восстановления чувствительности Т-клеток селезенки тимэктомированных мышей к азатиоприну* (1 мкг препарата на 3×106 клеток)
			определ. №1	определ. №2	определ. №3	среднее знач. из трех определений
1	Получен согласно пункту 1	14.05.2003	52	58	54	54,7
		16.06.2004	56	54	55	55,0
		21.04.2005 15.02.2006	53 51	54 53	55 56	54,0 52,7
2	Получен согласно пункту 2	9.04.2003	54	57	50	53,7
		17.03.2004	53	54	52	53,0
		24.01.2005 12.04.2006	50 56	54 50	52 55	52,0 53,4
3	Получен согласно пункту 3	23.01.2003	57	52	51	53,3
		22.09.2004	56	52	50	52,7
		20.10.2005 22.06.2006	54 51	52 54	56 58	54,0 54,3
* - Активными считаются препараты, вызывающие восстановление чувствительности Т-лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к азатиоприну на 50% и более.
** - Лиофильно высушенный тимус хранили в порошкообразном виде в стеклянной посуде с завинчивающейся крышкой.